李竹馨,尹洪娜,李海燕,李晨陽,王雪,孫忠人*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是一種復雜且具有破壞性的疾病，其特征是下行、上行和內(nèi)在脊髓傳導中斷[1]，導致慢性神經(jīng)功能缺失，損傷平面以下出現(xiàn)運動功能喪失，感覺受損，嚴重損傷自主神經(jīng)系統(tǒng)。據(jù)估計，每年全球SCI的發(fā)病率在25萬～50萬人之間[2]，患者往往在最具生產(chǎn)力的時期殘疾，這對個人和社會都有巨大的身體、情感和經(jīng)濟負擔。大量研究表明夾脊電針產(chǎn)生的脈沖電場對SCI修復具有促進作用，包括減輕繼發(fā)性損傷和促進神經(jīng)修復與再生[3-4]。

自噬是一種具有神經(jīng)保護特性的溶酶體依賴的細胞降解途徑，越來越多的證據(jù)表明，在SCI中自噬可以起到中樞神經(jīng)損傷后的神經(jīng)保護作用[5-6]。自噬體的出現(xiàn)標志著自噬進程開始，自噬相關(guān)基因微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)在細胞內(nèi)以LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式出現(xiàn)，自噬形成時，胞漿型LC3(即LC3-Ⅰ)會酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型(即LC3-Ⅱ)，因此，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的動態(tài)變化可評估自噬水平的高低。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)參與自噬體的誘導及形成，在自噬起始階段對細胞自噬起負調(diào)控作用。作為自噬經(jīng)典通路PI3K/AKT/mTOR的上游蛋白，磷酸酯酶與同源張力蛋白(phosphatase and tensin homolog, PTEN)異常表達與自噬相關(guān)[7]，是一種有前景的SCI治療靶點，越來越多的研究表明PTEN在自噬介導的神經(jīng)細胞損傷后修復起到重要作用[7-9]。PTEN特異性抑制劑bpV(HOpic)主要應用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子3(singnal transducers and activators of transcription 3, STAT3)是調(diào)控神經(jīng)發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子，在創(chuàng)傷、炎癥或缺血導致永久性軸突損傷的神經(jīng)疾病中誘導STAT3持續(xù)表達，有助于改善神經(jīng)功能恢復[10]。本研究涉及的主要路徑敘述如圖1。

圖1 PTEN/mTOR/STAT3通路示意圖

那么夾脊電針治療SCI是否通過影響自噬上下游分子起到治療作用呢？本研究觀察抑制PTEN后，夾脊電針對SCI大鼠運動功能和脊髓組織中LC3-Ⅱ/Ⅰ、mTOR和STAT3含量的影響，闡述夾脊電針對PTEN/mTOR/STAT3通路和自噬的影響，以期為夾脊電針治療SCI提供一定的實驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠120只，購于黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，許可證號：SYXK(黑)2013-012，體質(zhì)量180～220 g。實驗動物飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學針灸臨床神經(jīng)生物學重點實驗室動物房，室溫(25±3)℃，濕度(55±5)%，保持12 h/12 h晝夜循環(huán)，給予標準飲食、自由飲水，適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗。

1.2 實驗主要儀器和試劑

NYUImpactor M-Ⅲ型脊髓打擊器(美國)；手術(shù)器械(上海元洪醫(yī)療器械有限公司)；KWD 808Ⅱ電麻儀(中國長城)；0.25 mm×13 mm針灸針(吳江市云龍醫(yī)療器械有限公司)；抑制劑bpV(HOpic)(美國Med Chem Express)；Nano Quant infinite M200PRO多功能酶標儀(瑞士TECAN)；大鼠LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、mTOR、STAT3 ELISA試劑盒(江蘇酶免實業(yè)有限公司)。

1.3 造模與干預方法

1.3.1 分組與造模

采用隨機數(shù)字表法，將大鼠隨機分為假手術(shù)(Sham)組、模型(Model)組、電針(EA)組、bpV組和EA+bpV組，每組分為1、3、7、14 d等4個時間點，每組6只。假手術(shù)組去除椎板暴露脊髓，但不對脊髓進行打擊，模型組、電針組、抑制劑組和抑制劑+電針組在大鼠第10胸椎椎骨平面用打擊器以50 g·cm的勢能撞擊脊髓，以撞擊后大鼠出現(xiàn)深長呼吸、擺尾、脊髓血管紅腫作為SCI造模成功的標志[11]。

1.3.2 分組治療

于造模成功后次日開始治療。抑制劑+電針組每日電針治療前10 min腹腔注射抑制劑bpV 0.2 mL(200 μL/kg，溶于生理鹽水中，-80 ℃凍存)，模型組、假手術(shù)組和電針組大鼠腹腔注射0.2 mL生理鹽水。電針組方法：將大鼠固定后，在造模時標記處相鄰上、下棘突間隙距正中線3～4 mm處進行毫針針刺，針刺深度4～5 mm，電極線以正極在上、負極在下的方式連接同側(cè)穴位。選擇連續(xù)波(頻率為100 Hz)，電流強度約為1 mA，30 min/d，按不同時間點分別連續(xù)治療1、3、7、14 d。療程完成后分別于次日取材，將損傷組織取出約1 cm長，從橫截面正中間剪斷，取其中50%凍存于-80 ℃冰箱中待檢測。每天進行2次人工擠壓膀胱排尿。

1.4 行為學評價

采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評分量表[12]對SCI大鼠行走、步態(tài)、肢體協(xié)調(diào)性、腳掌位置和身體穩(wěn)定性進行綜合分析后進行打分。各組大鼠分別于麻醉前、每次治療前置于開放視野場地自由活動5 min，由兩名熟悉此表但對分組未知的研究人員進行交叉評價取均值記錄分數(shù)。量表范圍為0～21分，0分代表完全癱瘓，21分代表運動功能正常。

1.5 ELISA檢測法檢測脊髓中LC3-Ⅱ/Ⅰ、mTOR和STAT3含量

ELISA試劑盒使用前在常溫下平衡20 min，標準品孔各加不同濃度的標準品50 μL，樣本孔先加待測組織上清液10 μL，再加樣本稀釋液40 μL。標準品孔和樣本孔中每孔加入HRP標記的檢測抗體100 μL，37 ℃恒溫箱溫育60 min。洗板，每孔加入底物A、B各50 μL，避光孵育，加入終止液，測定各孔的OD值，計算擬合曲線并換算樣本濃度值。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 BBB評分情況

見表1和圖2。與Sham組比較，其余各組評分均顯著降低(P<0.05)。與Model組相比，在1 d時，EA組、bpV組和EA+bpV組評分均無顯著性差異(P>0.05)，而在3、7、14 d時差異顯著(P<0.05)，說明此時各治療組開始起到恢復大鼠運動功能的作用。與EA組相比，bpV組在各時間點均無顯著性差異(P>0.05)。與EA組和bpV組相比，EA+bpV組在1 d和3 d時無顯著性差異(P>0.05)，而在7 d和14 d時評分進顯著增高(P<0.05)。

表1 各組BBB評分表比較分)

2.2 脊髓組織LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ含量的比值

見表2和圖3。與Sham組相比，Model組各時間點均無顯著性差異(P>0.05)。從3 d起，與Model組相比，EA組LC3-Ⅱ/Ⅰ顯著升高(P<0.05)。與EA組相比，各時間點的bpV組比值均顯著降低(P<0.05)，說明EA較bpV更能引起自噬的發(fā)生。與EA組相比，EA+bpV組在7 d和14 d時具有顯著性差異(P<0.05)。

圖2 各組大鼠BBB評分比較

表2 各組脊髓組織LC3-Ⅱ/Ⅰ比較

圖3 各組脊髓組織LC3-Ⅱ/Ⅰ比較

2.3 脊髓組織mTOR含量

見表3和圖4。Sham組和Model組在各時間點均無顯著性變化(P>0.05)。與Model組比較，EA組在3、7、14 d具有顯著性差異(P<0.05)。bpV組與EA組在各時間點均無顯著性差異(P>0.05)。與Model組相比，EA+bpV組只在3 d時有顯著性差異(P<0.05)。

表3 各組脊髓組織mTOR含量比較

圖4 各組脊髓組織mTOR含量比較

2.4 脊髓組織STAT3含量

見表4和圖5。1 d時各組均無顯著性差異(P>0.05)。3 d時EA組分別與Sham組和Model組比較，均具有顯著性差異(P<0.05)。與EA組比較，bpV組和EA+bpV組在3、7、14 d均具有顯著性差異(P<0.05)。

表4 各組脊髓組織STAT3含量比較

圖5 各組脊髓組織STAT3含量比較

3 討論

中醫(yī)認為本病病因為“腎督虛寒”“瘀血留于太陽經(jīng)中”，因此多以溫通督脈法為主，同時重視疏通膀胱經(jīng)氣血，以此進行中藥配伍和針灸取穴[13-14]。夾脊穴在督脈與膀胱經(jīng)之間，同時接受督脈陽氣的溫煦和膀胱經(jīng)氣血的濡養(yǎng)。而且夾脊穴在后正中線旁開0.5寸胸椎棘突下，深部有脊神經(jīng)和交感神經(jīng)，針刺深度達到接近神經(jīng)根處為最佳[15]。隨著交通運輸業(yè)與建筑業(yè)的蓬勃發(fā)展，脊髓損傷發(fā)病率逐年升高，患者承受著沉重的心理與經(jīng)濟負擔。目前臨床指南推薦胸腰段脊髓損傷后行手術(shù)治療或佩戴胸腰骶支具8～10周的保守治療[16-17]。納米醫(yī)學和組織工程被認為是很有前途的治療方法，通過植入或注射生物材料支架來增強軸突生長和方向性，但轉(zhuǎn)化成臨床成果需要考慮安全性和巨大的經(jīng)濟投入[18]。電刺激產(chǎn)生的電場與人體的生物電協(xié)同作用于脊髓軸突生長，在脊髓損傷部位遠端施加電場刺激(EFS)可以延緩和減弱脊髓損傷電位的形成[4]，夾脊電針基于中醫(yī)辨證論治的理論與實踐基礎(chǔ)，以針灸針作為電極實現(xiàn)了接近損傷部位的電場刺激，延緩脊髓繼發(fā)性損傷，改善神經(jīng)功能，但具體作用機制仍不明確。

本研究首次通過PTEN/mTOR/STAT3信號通路調(diào)控的自噬研究夾脊電針的作用機制，發(fā)現(xiàn)抑制PTEN后，自噬水平上調(diào)。結(jié)果顯示，在改善大鼠運動功能方面EA組與bpV組水平基本持平，在引起LC3-Ⅱ/Ⅰ變化和mTOR、STAT3含量變化方面EA組與bpV組具有相似的趨勢，即在3 d達到高峰，之后呈下降趨勢，與SCI損傷后的神經(jīng)修復時間基本吻合[5],說明EA與bpV均能有效干預SCI后自噬水平。隨著治療時間延長，bpV+EA組的效果雖然沒有達到EA組與bpV組的完全疊加效果，但是也體現(xiàn)出了夾脊電針與bpV的協(xié)同作用，即總體效果均優(yōu)于單獨EA組與bpV組(P<0.05)。mTOR波動水平雖然不能明確自噬期始的準確情況[16]，但與LC3Ⅱ/Ⅰ相結(jié)合可以大致描述自噬的全過程(自噬流)。在今后的研究中將增加進一步檢測mTOR磷酸化水平和p62、ATG5等自噬相關(guān)基因以求更全面地描述自噬流。

筆者研究初步表明，夾脊電針作為優(yōu)化自噬的外源性刺激促進脊髓損傷恢復，可能與PTEN抑制劑bpV具有協(xié)同作用，能夠在通路被激活后上調(diào)細胞自噬。PTEN/mTOR/STAT3通路已經(jīng)在干預癌細胞增殖和避免心肌細胞過度增殖等方面起到顯著作用[19-20]，調(diào)節(jié)神經(jīng)元內(nèi)在PTEN/mTOR/STAT3活性是促進成人SCI后突出再生和功能修復的潛在治療策略[21]，也是目前治療SCI機制的熱點。然而抑制PTEN后對通路其他相關(guān)因素如星形膠質(zhì)細胞、自噬流等方面的影響需要在未來的研究中解決，可以從組織病理形態(tài)、蛋白和mRNA含量的動態(tài)變化等進一步闡述夾脊電針的作用機制。