張曉東，趙麗娜

1 南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 腫瘤研究室，天津 300071；2 天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院 腫瘤研究所，天津 300060

HBV感染是世界范圍內(nèi)的重要公共衛(wèi)生問題。全球有約2.57億人感染HBV。感染HBV后發(fā)展為慢性乙型肝炎(CHB)的原因有：HBV為部分環(huán)狀DNA病毒，血液中的HBV比較容易清除，但是組織細(xì)胞中的HBV很難清除，而且易發(fā)生免疫耐受、基因整合和基因變異。CHB有發(fā)展為肝纖維化、肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌(HCC)的風(fēng)險[1]。然而，CHB很少能徹底治愈[2-3]。有力的證據(jù)表明，當(dāng)前抗病毒治療缺乏療效是由于它們無法消除游離型HBV共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)，而它們是病毒基因組和病毒復(fù)制的轉(zhuǎn)錄模板的持久形式[4-5]。較為理想的抗HBV藥物應(yīng)該具有良好的安全性，作用較持久且停藥無反跳，激發(fā)宿主免疫應(yīng)答，強(qiáng)效抑制病毒復(fù)制甚至清除病毒[6]?？笻BV藥物可分為兩類：一是直接干擾病毒復(fù)制的某一環(huán)節(jié)的抗HBV藥物；二是通過阻斷宿主因子與病毒相互作用以抑制病毒復(fù)制的藥物。

1 抗HBV藥物

目前治療CHB的方法(已上市應(yīng)用于臨床的藥物)包括聚乙二醇干擾素(PEG-IFN)和口服核苷(酸)類似物。目前在研的抗HBV藥物主要分為三大類：直接抗病毒藥物、免疫類藥物和其他抗HBV藥物。

1.1 直接抗病毒藥物

完整的HBV生命周期包括附著、進(jìn)入、脫衣殼、轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核、cccDNA形成、轉(zhuǎn)錄、翻譯、包衣、組裝和分泌。直接作用抗病毒的方式是針對病毒并干擾HBV復(fù)制過程(圖1)，目前主要包括7類：病毒進(jìn)入抑制劑、RNA干擾劑、反義核酸藥物、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、核衣殼蛋白抑制劑、HBsAg抑制劑和基因編輯藥物等。

圖1 抗HBV新藥作用機(jī)制示意圖

1.1.1 病毒進(jìn)入抑制劑 病毒進(jìn)入抑制劑一種是以細(xì)胞成分為靶點干擾HBV與細(xì)胞受體結(jié)合，另一種以病毒顆粒為靶點阻止HBV附著于肝細(xì)胞[7-8]。?；悄懰徕c協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(NTCP)主要表達(dá)于肝細(xì)胞的基底外側(cè)膜[9]。有研究[10]證明，NTCP是HBV和HDV的一種功能受體，它能幫助病毒進(jìn)入肝細(xì)胞，HBV表面蛋白(HBs)中的前S1 區(qū)(pre-S1)被用來附著在NTCP受體上[10]。Myrcludex B是一種來源于HBsAg的HBV大蛋白(LHBs)pre-S1的合成脂多糖，作為一種入胞抑制劑抑制HBV進(jìn)入細(xì)胞[11]，其可降低HBV DNA水平，安全性及耐受性均較好[12]。目前Myrcludex B在已經(jīng)披露的 Ⅱ a期臨床試驗中。此外，上海賀普藥業(yè)的賀普拉肽(Hepalatide)通過與HBV肝細(xì)胞感染受體NTCP結(jié)合，阻斷HBV感染。

1.1.2 RNA干擾劑 RNA干擾劑由siRNA組成，具有較高的特異性，通過干擾HBV的mRNA來減少所有HBV的轉(zhuǎn)錄，由于HBV是一個具有區(qū)域重疊的緊湊基因組，單個siRNA可以抑制核心蛋白、表面蛋白、聚合酶和X蛋白的產(chǎn)生。通過直接阻斷HBV復(fù)制，間接促進(jìn)HBV免疫，降低HBsAg和HBeAg的表達(dá)[13]。siRNA ARC-520是美國Arrowhead公司推出的臨床首次開發(fā)的siRNA。ARC-520對HBs轉(zhuǎn)錄沒有影響，因為ARC-520的目標(biāo)序列在核心啟動子位點上游，靠近整合HBs序列的插入位點。為了解決這個問題，Arrowhead公司制造了一種針對該區(qū)域的第二代siRNA，它涵蓋了整合型和cccDNA來源的HBs的轉(zhuǎn)錄本。這有效地降低了HBeAg陽性和HBsAg陰性的CHB患者的HBsAg水平[14-16]。目前，許多開發(fā)者，如Arrowhead和Alnylam，都有活躍的siRNA開發(fā)項目。

1.1.3 反義核酸藥物 反義藥物主要指反義寡核苷酸，其核苷酸序列可與靶mRNA或靶DNA互補(bǔ)，抑制或封閉該基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，干擾致病蛋白的產(chǎn)生過程，即干擾遺傳信息從核酸向蛋白質(zhì)的傳遞。Ionis與GSK合作開發(fā)的反義藥物IONIS-HBVRx(GSK 3228836)目前正處于臨床 Ⅱ 期，前期臨床數(shù)據(jù)顯示IONIS-HBVRx對HBsAg和HBV DNA具有明顯的抑制活性。此外，Aligos Therapeutics公司的ALG-020572正處于臨床前研究階段。

1.1.4 逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑 逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑是指核苷(酸)類似物，其抗HBV的機(jī)理是干擾HBV的核苷酸代謝，直接作用于病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，阻斷HBV復(fù)制。這些藥物已成為這些年來抗病毒藥物的研究熱點，優(yōu)點是安全、有效、易行。但核苷(酸)類藥物沒有抗HBsAg而產(chǎn)生全身性的免疫抑制的作用，因此，一旦不再治療，病毒會再次復(fù)活，需要終身治療，而且易引起原發(fā)性耐藥或繼發(fā)性耐藥，一旦停藥，容易反彈[17-19]，因為其抑制HBV復(fù)制，對cccDNA庫沒有影響。

1.1.5 核衣殼蛋白抑制劑 衣殼蛋白是用來保護(hù)HBV DNA的蛋白外殼，靶向衣殼組裝和拆卸是很有前途的抗病毒策略[20]。衣殼抑制劑通過破壞核心粒子的組裝從而抑制核殼蛋白合成和病毒DNA復(fù)制；或?qū)е乱職し纸獾幕衔?通過中斷衣殼的拆卸)都會阻礙rcDNA進(jìn)入細(xì)胞核，從而阻礙rcDNA轉(zhuǎn)化為cccDNA[20]。因此，核衣殼蛋白抑制劑是很有前途的抗病毒策略。

由小分子組成的抑制劑附著在核心蛋白上，引起變構(gòu)調(diào)節(jié)，阻止二聚和核衣殼組裝[21]。這些分子包括雜芳基二氫嘧啶、苯丙烯酰胺、吡啶酮衍生物和磺胺酰苯甲酰胺。甲磺酸莫非賽定和齊魯制藥的QL-007目前正處于臨床 Ⅱ 期，甲磺酸莫非賽定在28天的短期治療中，不但可以顯著降低HBV DNA，而且可以有效地降低HBeAg水平。

1.1.6 HBsAg抑制劑 核酸聚合物(NAPs)通過硫代反義寡核苷酸(PS-ONs)抑制病毒復(fù)制過程中的蛋白相互作用，對包膜病毒有廣泛的抑制活性。HBsAg抑制劑可以抑制感染HBV的肝細(xì)胞釋放HBsAg，繼而破壞HBsAg誘導(dǎo)的免疫機(jī)制而發(fā)揮抗病毒作用。在此領(lǐng)域走在前列的是加拿大的Replicor公司，分別為REP-2139(已經(jīng)進(jìn)入臨床Ⅲ期)和REP-2165(已經(jīng)進(jìn)入臨床Ⅱ期)。

1.1.7 基因編輯藥物 滅活或消除cccDNA是降低HBV重新激活風(fēng)險的唯一方法[22]。體外CRISPR/Cas9實驗可以使HBV cccDNA基因編碼的cccDNA和HBV蛋白水平均下降[23]。然而，為了確保對宿主DNA的最小脫靶毒性，CRISPR/Cas9必須缺乏與人類遺傳物質(zhì)的交叉反應(yīng)性，并且必須具有將基因編輯工具專門傳遞至肝細(xì)胞核的能力。而且目前缺乏針對cccDNA的標(biāo)準(zhǔn)化測量(cccDNA轉(zhuǎn)錄本及其蛋白水平的變化)[24]。如果研究人員克服了這些障礙，那么這樣的基因編輯技術(shù)就有可能根除cccDNA并實現(xiàn)HBV的完全治愈。雖然CRISPR也可以被設(shè)計成專門從人類DNA中去除整合的HBV序列，但是任何隨后的染色體易位都會產(chǎn)生災(zāi)難性的后果[24]。

1.2 免疫類藥物

乙型肝炎患者對HBV DNA 特殊的免疫功能和對HBV DNA 的免疫耐受性，以及免疫協(xié)調(diào)功能的個體差異，使HBV在體內(nèi)不能被除去。免疫類抗HBV藥物目前在研的有治療性疫苗、先天免疫系統(tǒng)激活藥物、單克隆抗體、檢查點抑制劑以及其他免疫途徑。

1.2.1 治療性疫苗 治療性疫苗是用于刺激免疫系統(tǒng)作為治療的疫苗技術(shù)。治療性乙型肝炎疫苗屬于特異性主動免疫療法，可分為蛋白質(zhì)疫苗、基因疫苗和細(xì)胞疫苗三大類。臨床上普遍使用重組HBsAg 疫苗。GS-4774疫苗是利用重組釀酒酵母表達(dá)HBsAg、HBcAg和HBV X蛋白。GS-4774在病毒抑制的患者中耐受性很好，但它并沒有顯著降低HBsAg水平，即使有近一半(40%)的HBV特異性T淋巴細(xì)胞增加，影響HBcAg和HBV X蛋白[25]。

1.2.2 先天免疫系統(tǒng)激活藥物 有證據(jù)[26-27]表明HBV蛋白被病原體識別受體識別，包括Toll樣受體2 (TLR-2)、TLR-4和RIG-I。病毒可能已經(jīng)進(jìn)化出抑制病原體識別受體信號通路的機(jī)制。TLR-7、TLR-8或TLR-9刺激先天免疫應(yīng)答的藥理作用正在研究中。GS-9620是美國Gilead制藥公司研發(fā)的一種 TLR-7激動劑，可刺激TLR-7 感知外來病原體存在、誘發(fā)免疫應(yīng)答，提高抗病毒能力并獲得保護(hù)性免疫。GS-9620安全、耐受性良好，但對HBsAg水平無影響[26-29]。TLR-8激動劑可以在腸道淋巴組織或肝臟中刺激觸發(fā)專職抗原細(xì)胞的成熟，刺激產(chǎn)生的各種細(xì)胞因子可以刺激或挽救抗原特異性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，以提高抗HBV活性。在動物模型中，TLR-8激動劑可誘導(dǎo)循環(huán)血細(xì)胞的先天免疫反應(yīng)，而不會引起全身性的不良反應(yīng)。第一個TLR-8激動劑GS-9688最近進(jìn)入了Ⅱ期臨床開發(fā)[30]。

1.2.3 單克隆抗體 單克隆抗體方面，韓國Green Cross(綠十字)公司的GC1102正在進(jìn)行臨床Ⅱ期試驗，在一項前瞻性研究[31]中，證明GC1102能夠降低HBsAg水平，進(jìn)而獲得良好的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答。此外，Vir Biotech的單克隆抗體Vir-3434正處于臨床Ⅰ期階段。

1.2.4 檢查點抑制劑 在T淋巴細(xì)胞受體中，PD-1在肝臟內(nèi)HBV特異性T細(xì)胞上表達(dá)最多，同時在肝細(xì)胞中PD-L1表達(dá)增加[32]。因此，PD-1和PD-L1抑制劑目前正被研究作為可能的治療CHB的方法。在首次臨床試驗中，低劑量(單劑量0.3 mg/kg)抗PD -1中可顯著降低CHB患者的HBsAg，并且有1例患者實現(xiàn)了完全的HBsAg血清轉(zhuǎn)換[33]。我國歌禮藥業(yè)/康寧杰瑞的一款PD-L1抑制劑ASC22，目前正處于臨床Ⅱ期。此外，Gilead的PD-L1抑制劑GS4224正處于臨床前研究階段。

1.2.5 其他免疫途徑 其他免疫類藥物有Immunocore的IMC-I109V，正處于臨床Ⅱ期。LionTCR的LTCR-H2-1，還在臨床前研究階段。

1.3 其他抗HBV藥物

除了上述介紹外，還有一些其他抗HBV藥物(附錄1)，它們的作用機(jī)制各不相同。法國Enyo Pharma公司的FXR激動劑EYP001正處于臨床Ⅱ期。來自我國亞盛醫(yī)藥的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑APG-1387目前正在全球范圍內(nèi)開展臨床試驗，所涉及的適應(yīng)證不僅有乙型肝炎，還有晚期實體瘤和血液瘤。其他還有托普泰克公司的抗HBV X蛋白D-TTK001，Regulus的MicroRNA “HBV”，EnochianBio的基因修飾細(xì)胞療法ENOB-HB-01，GemVax& KAEL的“新型肽段”GV1001和FinchTherapeutics的口服微生物制劑CP101均處于臨床前研究階段。

2 阻斷宿主因子與病毒相互作用的藥物

在細(xì)胞核內(nèi)，HBV cccDNA是具有細(xì)胞染色質(zhì)樣結(jié)構(gòu)的單個小染色體[34-35]。HBV cccDNA是高度穩(wěn)定的，并在肝細(xì)胞中持續(xù)存在。迄今為止，越來越多的證據(jù)[34-35]表明，表觀遺傳機(jī)制是造成HBV cccDNA持續(xù)性和難以清除的原因。表觀遺傳調(diào)控機(jī)制包括但不限于DNA甲基化，組蛋白修飾，染色質(zhì)重塑和非編碼RNA干擾[36]。慢性病毒感染的表觀遺傳治療法的研究越來越多，如人類免疫缺陷病毒、愛潑斯坦巴爾病毒[37]，表明表觀遺傳治療可能是一種有前途的治療策略。

2.1 靶向cccDNA甲基化 病毒基因組的DNA甲基化被認(rèn)為是一種宿主防御機(jī)制[38]。有報道稱DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的表達(dá)增加可以促進(jìn)病毒基因組的甲基化，從而在體外阻止HBV復(fù)制[39]，這表明DNMT可以用來抑制cccDNA的轉(zhuǎn)錄。但是宿主DNA甲基化已被證明是肝癌中相關(guān)腫瘤抑制基因失活的主要機(jī)制[40]，因此，在開發(fā)基于DNMT的治療方法時，應(yīng)該仔細(xì)考慮阻斷HBV感染和抑制宿主腫瘤抑制基因之間的平衡。對幾種癌細(xì)胞系的研究表明，EGCG(-)可改變DNMT活性。此外，EGCG還被證明可以抑制HBV進(jìn)入并誘導(dǎo)抗HBV自噬反應(yīng)，這表明EGCG可能對HBV相關(guān)的HCC患者有益。據(jù)報道[41]，HBV感染誘導(dǎo)從頭甲基化，并降低抗病毒細(xì)胞因子IL- 4的表達(dá)。此外，DNMT已被證明可上調(diào)癌癥患者的細(xì)胞因子以及Janus激酶(JAK)/STAT和IFN信號通路。因此，基于DNMT的表觀遺傳治療也可能喚起HBV感染細(xì)胞和免疫細(xì)胞的先天免疫，從而系統(tǒng)地增強(qiáng)對HBV復(fù)制的抑制。

2.2 靶向cccDNA的組蛋白修飾 認(rèn)識組蛋白蛋白質(zhì)翻譯后修飾(protein translational modifications,PTMs)在cccDNA轉(zhuǎn)錄中的作用為抑制cccDNA提供了幾個潛在的治療靶點。盡管在cccDNA微染色體上對PTMs的全基因組繪圖顯示，轉(zhuǎn)錄活性的PTMs水平?jīng)Q定了cccDNA的活性[42]，而不是抑制性的PTMs；這些PTMs在宿主染色體轉(zhuǎn)錄中也發(fā)揮著類似的作用。因此，如果有cccDNA特異性的PTMs修飾劑，將為開發(fā)治療靶點帶來新的希望。在這方面，最近的一項研究[43]表明，一種多功能蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶優(yōu)先誘導(dǎo)cccDNA上的H4R3me2s抑制病毒轉(zhuǎn)錄，表明某些PTMs酶可能能夠區(qū)分宿主染色體與HBV cccDNA的染色質(zhì)修飾[43]。此外，Tropberger等[42]發(fā)現(xiàn)，HAT抑制劑C646阻斷H3K27ac和H3K122ac的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300/CBP，并抑制HBV轉(zhuǎn)錄，但在人原代肝細(xì)胞中沒有細(xì)胞毒性，這為表觀遺傳化合物可能代表一種新型HBV抗病毒藥物的概念提供了證據(jù)。

3 抗HBV新藥展望

HBV治療的理想終點是消除宿主中的cccDNA，或者至少是cccDNA的完全失活，這是目前抗病毒治療無法實現(xiàn)的。越來越多的證據(jù)支持cccDNA的表觀遺傳調(diào)控在HBV擴(kuò)增中發(fā)揮重要作用。所有這些都迫切需要開發(fā)靶向cccDNA的表觀遺傳治療HBV的方法，從而阻斷宿主因子與病毒的相互作用以抑制病毒。為此，在cccDNA報告細(xì)胞系或HBV感染細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中篩選可用的前藥或更大的化合物庫將是首要嘗試的。預(yù)計在不久的將來，cccDNA特異性的表觀遺傳機(jī)制將得到充分闡明，并開發(fā)出治療甚至治愈CHB的cccDNA特異性的表觀藥物。

針對抗HBV的單藥治療和聯(lián)合治療各有優(yōu)勢，但聯(lián)合用藥可能會成為乙型肝炎治療的發(fā)展趨勢，如果將抗HBV藥物和阻斷宿主因子與病毒相互作用的藥物這樣兩個作用機(jī)制互補(bǔ)的藥物聯(lián)用，可能會更好阻止或延緩乙型肝炎的進(jìn)展，可能會離功能性治愈乙型肝炎更近一步。但需要明確藥物如何聯(lián)合，聯(lián)合治療的最佳時機(jī)，何時停藥，停藥后能否反復(fù)及如何應(yīng)對，預(yù)計未來會有更多基于不同機(jī)制的藥物聯(lián)用出現(xiàn)，有望成為乙型肝炎治療的新方法。值得期待的是，隨著新技術(shù)、新靶點、新療法和新長效劑型的產(chǎn)生，越來越多的新分子和新化合物進(jìn)入到臨床階段并取得了不錯的臨床效果。相信未來，能夠治愈乙型肝炎的藥物將會出現(xiàn)，乙型肝炎這個難題也終將被攻克。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：張曉東、趙麗娜負(fù)責(zé)提出研究選題，撰寫論文和修訂論文。

附錄1見二維碼