楊曉飛，王臨旭，黃長形，董 杰，胡海峰，畢占虎，連建奇，張 野

空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院(第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院) 傳染科，西安 710038

γ鏈(γ chain, γC)細胞因子家族成員包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21，受體為γC受體亞基和特異性α/β受體亞基形成的異源二聚體，在慢性病毒感染過程中調控CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞功能，影響機體抗病毒免疫活性[1-2]。T淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(T-cell immunoglobulin and mucin domain-containning molecule 3, TIM-3)是重要的免疫檢查點分子，主要發(fā)揮負性調控機體免疫應答的作用[3]。在人免疫缺陷病毒(HIV)感染中，γC細胞因子可誘導CD8+T淋巴細胞中TIM-3表達升高，通過相應異源二聚體受體介導的信號通路影響下游細胞因子分泌[4]。本課題組前期研究[5-6]也發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞中TIM-3表達升高，IL-7和IL-15可增強CHB患者CD8+T淋巴細胞中TIM-3的表達，但抑制γC受體亞基并不影響IL-7和IL-15誘導的TIM-3表達升高。因此，本研究通過抑制CD8+T淋巴細胞中各種γC細胞因子受體特異性α/β亞單位，探討γC細胞因子誘導CD8+T淋巴細胞中TIM-3表達調控的機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2017年1月—5月就診于第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院傳染科的CHB患者。納入標準：(1)符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[7]的診斷標準；(2)年齡≥18歲；(3)獲得知情同意。排除標準：(1)近1年內曾接受抗病毒治療或免疫調節(jié)治療者；(2)合并其他嗜肝病毒或HIV感染者；(3)合并自身免疫性疾病、酒精性肝炎、藥物性肝損傷者；(4)合并惡性腫瘤者；(5)合并終末期肝臟疾病(包括失代償期肝硬化、肝衰竭、肝癌)者。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑和儀器 淋巴細胞分離液購自美國Sigma公司。小鼠抗人CD3-APC、小鼠抗人CD8-FITC、小鼠抗人TIM-3-PE CF594、小鼠抗人磷酸化信號傳導及轉錄激活蛋白-1(signal transducer and activator of transcription-1, STAT-1)-PE(磷酸化位點為Y701)、小鼠抗人磷酸化STAT-3-PerCP Cy5.5(磷酸化位點為Y705)、小鼠抗人磷酸化STAT-5-APC(磷酸化位點為Y694)，大鼠抗人IL-2-APC、小鼠抗人IFNγ-FITC、大鼠抗人IL-10-PE購自美國BD公司。重組人IL-7、重組人IL-15、重組人IL-21購自美國PeproTech公司?？谷薎L-7Rα、抗人IL-2Rβ、抗人IL-21R、抗γC抗體購自美國R&D公司。流式細胞儀FACS Aria Ⅱ為美國BD公司產品。

1.2.2 外周血單個核細胞(PBMC)的分離 于清晨、空腹采集外周靜脈血20 ml，采用EDTA抗凝，立即使用淋巴細胞分離液、采用Ficoll密度梯度離心法分離 PBMC。使用0.4%臺盼蘭對PBMC計數(shù)，以5×106個/管分裝在凍存管內，加凍存液(90%胎牛血清+10%二甲基亞砜)保存于液氮中備用。

1.2.3 PBMC刺激培養(yǎng) 復蘇凍存的PBMC，于24孔板中培養(yǎng)，每孔中加入2×105個PBMC，每例患者設立20個復孔，每2個復孔設立同一刺激因素，分別為：(1)陰性對照(無刺激)；(2)重組人IL-7；(3)重組人IL-7+抗人IL-7Rα；(4)重組人IL-7+抗人IL-7Rα+抗γC；(5)重組人IL-15；(6)重組人IL-15+抗人IL-2Rβ；(7)重組人IL-15+抗人IL-2Rβ+抗γC；(8)重組人IL-21；(9)重組人IL-21+抗人IL-21R；(10)重組人IL-21+抗人IL-21R+抗γC，其中重組人IL-7、重組人IL-15、重組人IL-21的終濃度為25 ng/ml，抗人IL-7Rα、抗人IL-2Rβ、抗人IL-21R和抗γC的終濃度為10 μg/ml。PBMC在5% CO2條件下培養(yǎng)90 h，然后加入終濃度為10 μg/ml的布雷菲爾德菌素A繼續(xù)培養(yǎng) 6 h，進行后續(xù)實驗。

1.2.4 流式細胞檢測CD8+T淋巴細胞中TIM-3表達和細胞因子的分泌 刺激后的PBMC轉入2個FACS管中，一管加入抗CD3、抗CD8、抗TIM-3、抗pSTAT-1(或抗pSTAT-3、抗pSTAT-5)，另一管中加入抗CD3、抗CD8、抗IL-2、抗IL-10、抗IFNγ，并設立同型對照。用FACS Aria Ⅱ流式細胞儀檢測，BD FACS Diva軟件獲取細胞，F(xiàn)lowJo V10軟件分析結果。

1.3 倫理學審查 本研究方案經空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院(第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院)醫(yī)學倫理委員會批準，批號：TDLL-201505-013，所有入組志愿者均簽署知情同意書。

2 結果

2.1 一般資料 共納入CHB患者23例，男14例，女9例，年齡18～41歲，ALT 93～337 U/L，HBV DNA(5.91±1.17)log10IU/ml。

2.2 IL-7對CHB患者CD8+T淋巴細胞中TIM-3、細胞因子和pSTAT-5表達的影響 CHB患者CD8+T淋巴細胞中TIM-3和細胞因子分泌、下游pSTAT檢測的典型流式分析(圖1)。首先利用前向角散射(forward scatter, FSC)和側向角散射(side scatter, SSC)對淋巴細胞進行圈門，在淋巴細胞中選擇CD3+CD8+T淋巴細胞，檢測CD3+CD8+T淋巴細胞中TIM-3+比例，進一步對CD3+CD8+TIM-3+細胞中IL-2、IL-10、IFNγ和pSTAT的比例進行檢測。重組人IL-7刺激可誘導CHB患者CD8+T淋巴細胞中TIM-3陽性細胞比例較無刺激組升高[(20.73±3.56)% vs (11.90±2.32)%，t=9.966，P<0.001]，亦可誘導TIM-3+CD8+細胞中IL-2陽性[(34.87±10.02)% vs(17.89±6.22)%，t=6.905，P<0.001]、IL-10陽性[(64.22±8.71)% vs (51.14±8.31)%，t=5.211，P<0.001]、IFNγ陽性[(27.52±5.94)% vs (20.90±5.78)%，t=3.831，P<0.001]細胞比例較無刺激組升高，pSTAT-5陽性細胞比例亦較無刺激組升高[(38.92±3.67) % vs (25.93±9.68)%，t=6.018，P<0.001]?？谷薎L-7Rα刺激對IL-7刺激組的TIM-3、IL-2、IL-10、IFNγ和pSTAT-5表達均無顯著影響(P值均>0.05)?？谷薎L-7Rα和抗γC聯(lián)合刺激后可降低IL-7刺激組的TIM-3(16.10±2.01)%、IL-2(18.01±8.27)%和IL-10(55.61±2.89)%表達水平(P值均<0.05)，但對IFNγ和pSTAT-5表達無顯著影響(P值均>0.05)(圖2)。

圖1 CHB患者CD8+T淋巴細胞表面TIM-3和細胞因子分泌、STAT磷酸化檢測的典型流式分析圖

2.3 IL-15對CHB患者CD8+T淋巴細胞中TIM-3、細胞因子和pSTAT-1表達的影響 重組人IL-15刺激可誘導CHB患者CD8+T淋巴細胞中TIM-3陽性細胞比例較無刺激組升高[(23.93±5.92)%，t=9.074，P<0.001]，亦可誘導TIM-3+CD8+細胞中IL-2陽性[(37.72±9.28)%，t=8.513，P<0.001]、IL-10陽性[(83.92±6.90)%，t=14.550，P<0.001]、IFNγ陽性[(28.53±5.64)%，t=4.531，P<0.001]細胞比例較無刺激組升高，pSTAT-1陽性細胞比例亦較無刺激組升高[(40.88±3.69)% vs (25.93±9.68)%，t=6.921，P<0.001]?？笽L-2Rβ單獨刺激、抗IL-2Rβ和抗γC聯(lián)合刺激均可降低IL-15刺激組的TIM-3、IL-2、pSTAT-1表達水平(P值均<0.05)，但對IFNγ表達無顯著影響(P>0.05)(圖3)。

2.4 IL-21對CHB患者CD8+T淋巴細胞中TIM-3、細胞因子和pSTAT-1、pSTAT-3表達的影響 重組人IL-21刺激、抗IL-21R單獨刺激、抗IL-21R和抗γC聯(lián)合對CHB患者CD8+T淋巴細胞中TIM-3陽性細胞比例、TIM-3+CD8+細胞中IL-2、IL-10、IFNγ、pSTAT-1及pSTAT-3的表達與無刺激組比較均無統(tǒng)計學差異(P值均>0.05)(表1)。

表1 IL-21對CHB患者CD8+T淋巴細胞中TIM-3、IL-2、IL-10、IFNγ、pSTAT-1和pSTAT-3表達的影響

3 討論

CD8+T淋巴細胞是清除HBV感染的最主要免疫細胞，但持續(xù)HBV感染可通過誘導固有免疫系統(tǒng)功能紊亂、調節(jié)性T淋巴細胞水平升高、抑制性免疫應答異?；钴S等多種機制影響CD8+T淋巴細胞活性，導致CD8+T淋巴細胞功能衰竭，殺傷活性明顯減弱，分泌細胞因子能力降低，進一步誘導HBV感染慢性化[8]。免疫檢查點分子是目前免疫治療的熱點之一，針對程序性細胞死亡受體-1(programmed cell death-1, PD-1)、細胞毒性T淋巴細胞相關抗原(cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4, CTLA-4)和TIM-3等代表性免疫檢查點分子均已成為抗腫瘤和慢性感染免疫治療的重要靶點[9-10]。PD-1和CTLA-4在急性和慢性病毒性肝炎患者中的表達水平升高：在急性肝炎過程中，PD-1和CTLA-4可抑制CD8+T淋巴細胞的殺傷活性，降低CD8+T淋巴細胞對肝細胞的免疫損傷，發(fā)揮免疫保護作用；相反，在慢性肝炎過程中，PD-1和CTLA-4則與T淋巴細胞功能衰竭誘導的持續(xù)病毒感染密切相關[11]。本課題組既往研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，免疫檢查點分子家族中的重要成員——TIM-3在CHB患者CD4+和CD8+T淋巴細胞中的水平均顯著升高，γC細胞因子中的成員IL-2、IL-7和IL-15均可誘導T淋巴細胞表面TIM-3提升，本研究亦發(fā)現(xiàn)相同的結果，且與在慢性HIV感染中研究結果一致[4,12]，說明多種慢性病毒感染中均存在TIM-3升高表達，以TIM-3為代表的免疫檢查點分子可能與CD8+T淋巴細胞功能衰竭密切相關，參與病毒感染慢性化。

注：a，TIM-3+比例；b，IL-2+TIM-3+比例；c，IL-10+TIM-3+比

注：a，TIM-3+比例；b，IL-2+TIM-3+比例；c，IL-10+TIM-3+比例；d，IFNγ+TIM-3+比例；e，pSTAT-1+TIM-3+比例。

既往的研究認為γC細胞因子的主要功能為促進炎癥應答，雖然這些細胞因子共享γC受體亞基，但特異性α/β受體亞基所介導的信號通路卻存在差異。IL-7通過IL-7Rα/γC受體介導下游STAT-5磷酸化，IL-15通過IL-2R/γC受體以及抗原提呈細胞表面的IL-15Rα活化STAT-1介導的信號通路，IL-21通過IL-21R/γC受體介導下游STAT-1、STAT-3磷酸化，調控免疫細胞功能[13-14]。γC細胞因子可調控慢性HBV和HIV感染者T淋巴細胞中TIM-3的表達，在HIV感染者中，IL-2、IL-7、IL-15和IL-21均可上調T淋巴細胞中TIM-3表達[4,12]。但不同γC細胞因子對CHB患者TIM-3的表達調控卻存在差異，IL-7和IL-15可誘導CHB患者CD8+T淋巴細胞中TIM-3表達升高，

雖然IL-21在慢性HBV感染中的表達水平升高，在體內和體外均可介導HBV病毒清除[15-16]，但IL-21對CHB患者CD8+T淋巴細胞中TIM-3的表達則無顯著影響，這可能與γC細胞因子家族成員介導的下游信號通路不同有關[13-14]。同時，抑制IL-21R和/或γC受體對IL-21介導的CD8+T淋巴細胞中TIM-3的表達變化無影響，提示IL-21對CD8+T淋巴細胞的功能調控可能與其受體的表達水平和功能變化無明顯相關性，而深入的機制仍有待進一步研究。

IL-7和IL-15均可顯著增加CHB患者CD8+T淋巴細胞中TIM-3表達。IL-7在HCV[17-18]和肝細胞癌[16]患者外周血中的表達水平降低，外源性IL-7可降低肝細胞癌患者CD8+T中PD-1的表達，進而促進CD8+T淋巴細胞功能[19]。外源性IL-15在體內可抑制HBV復制[20]，但可上調CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞中PD-1和TIM-3表達[21]。雖然IL-7和IL-15在慢性HBV感染中的表達譜不同，但IL-7和IL-15究竟發(fā)揮免疫增強還是免疫抑制作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-7和IL-15可增強CD8+T淋巴細胞表面TIM-3的表達和下游IL-10的分泌，與CHB患者體內負性免疫調節(jié)分子通路的激活密切相關，同時，IL-7和IL-15亦可增強下游IL-2和IFNγ的表達，說明二者亦可能激活了機體的免疫應答。因此，筆者推測，在慢性HBV感染中，以IL-7和IL-15為代表的γC細胞因子不但可誘導TIM-3等負性免疫分子表達，還可促進炎癥細胞因子激活，使CD8+T淋巴細胞的增殖和殺傷活性與負性免疫調節(jié)在一定范圍內達到免疫穩(wěn)態(tài)，使機體既不能清除病毒，也不受到過強的免疫損傷[22]。阻斷IL-7和IL-15的特異性受體亞基可降低下游細胞因子的分泌，說明慢性HBV感染者中γC細胞因子可通過與慢性HIV感染者中相似的通路影響下游細胞因子分泌[4,12]。但由于本研究入組的CHB患者數(shù)量有限，且均為體外實驗，本研究結果仍需要擴大樣本量并以HBV轉基因小鼠為研究對象進行體內研究進行進一步確認。

總之，IL-7和IL-15可能主要通過γC受體介導的STAT磷酸化促進細胞因子信號通路，上調CHB患者CD8+T淋巴細胞中TIM-3表達。盡管γC細胞因子被認為是一種治療慢性病毒感染新的免疫方法，但其具體的治療機制仍需進一步闡釋。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：楊曉飛、董杰、胡海峰、畢占虎負責實驗操作和論文撰寫；楊曉飛、王臨旭、黃長形、連建奇、張野負責入組患者和數(shù)據(jù)分析；連建奇、張野負責課題設計，資料分析，擬定寫作思路，指導撰寫論文并最后定稿。