梁曾恩妮，李志堅，單 楊

（湖南省農(nóng)業(yè)科學院，湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南 長沙 410125）

帕金森?。≒arkinson disease，PD）又名震顫麻痹，以靜止性震顫、動作遲緩、肌張力痙攣、舉止特征異常、眨眼反應以及癡呆等為主要臨床表現(xiàn)，是一種發(fā)生于老年前或老年期的進行性神經(jīng)退行性疾病，與中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性壞死等因素有關，尚無有效的根治方法[1]。在65 歲以上的人群中發(fā)病率大約為1%～2%，目前全球帕金森病患者約為2 500萬人，我國大約有500 萬PD 患者[2]。6-羥基多巴胺（6-Hydroxydopamine，6-OHDA）可使神經(jīng)細胞發(fā)生退行性改變、老化和死亡，導致神經(jīng)末梢損毀，遞質(zhì)減少[3]。PC12 細胞為大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細胞，是氧化脅迫物質(zhì)的主要靶細胞。6-OHDA 作用PC12 細胞是常用的帕金森病細胞模型[4]。

枳實是蕓香科植物酸橙及其變種或甜橙的幼果干燥制成。研究表明，枳實傳統(tǒng)功效為破氣消積，化痰散痞，臨床用于健脾開胃、理氣降逆和痰濁阻滯[5]。枳實中最能體現(xiàn)枳實特征的成分是黃酮類化合物，具有抗氧化、消炎、抗癌、抗菌等多種藥理學活性[6]。用枳實分離新橙皮苷的同時會產(chǎn)生大量的類黃酮，研究這部分物質(zhì)的成分、含量和功能，可提高經(jīng)濟效益，為枳實的開發(fā)利用增加新的附加產(chǎn)品。

筆者以枳實為原料提取分離枳實黃酮，采用HPLC 法檢測總黃酮成分和含量，應用CCK8 法、流式細胞術和蛋白印跡技術等方法研究枳實黃酮提取物對6-OHDA 損傷PC12 細胞的保護作用，為生產(chǎn)橙皮苷后剩余枳實黃酮的利用和進一步防治與衰老有關的神經(jīng)退行性疾病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

枳實由漣源康麓科技生物有限公司提供（經(jīng)鑒定為酸橙幼果Citrus aurantium L.）；蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素、橙皮素、甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素標準品，購于國藥集團化工試劑有限公司；橙皮苷、香蜂草苷標準品購于北京索萊寶科技有限公司；色譜級甲醇、二甲基亞砜和乙酸購于美國默克公司；PC12 細胞由中國科學院上海生命科學研究所細胞庫提供；胎牛血清購于杭州四季青公司；1640 培養(yǎng)基購于美國Sigma 公司；CCK-8 試劑盒（cell counting Kit-8）購于日本同仁。

主要儀器有IC-20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）、EL204-IC 型電子天平（美國瑞士梅特勒-托利多公司）、CKX41SF 熒光倒置顯微鏡（日本Olympus）、MK3 酶 標 儀（美 國Thermo 公 司）、Cytoflex 流式細胞儀（美國Beckman 公司）、水套式Ⅱ型細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）、B-290 噴霧干燥機（瑞士Buchi 公司）、SHB- Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、UV-1700 型紫外可見分光光度計（日本島津公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 枳實類黃酮的提取 500 g 枳實粉碎后，加入6倍量的90%乙醇加熱回流提取2 次，每次2 h，減壓濃縮，采用BA-8 大孔樹脂對提取液進行分離，洗脫液濃縮后，用5.0%NaCl 助析，得粗晶，結(jié)晶用于獲得新橙皮苷。溶液采用DA201-C 大孔樹脂脫鹽，洗脫液噴霧干燥獲得枳實黃酮粉末，稱重。

1.2.2 枳實黃酮提取物總黃酮的含量測定 10 種類黃酮標品混溶于10 mL 甲醇和二甲基亞砜（體積比為1 ∶1），超聲提取30 min，10 000 r/min 離心10 min，收集上清液，再重復上述操作2 次，合并3 次提取的上清液，10 000 r/min 離心10 min，定容至50 mL，經(jīng) 0.22 μm 微孔有機濾膜過濾后于HPLC 系統(tǒng)中用C18色譜柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）進行色譜分離。使用甲醇（A 相）和0.2%乙酸溶液（B 相）雙流動相梯度洗脫，洗脫程序為：0～8 min，40%～60%B；8～25 min， 70%～30%B；25～32 min，40%～60%B。流速1 mL/min， 柱溫25℃，檢測波長設為283 nm。通過混標的保留時間和峰面積，確定樣品中類黃酮組成與含量，運用分光光度法測定總黃酮含量。

1.2.3 CCK8 檢測細胞活力 PC12 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基中，以5×103個細胞/孔密度接種于96 孔板內(nèi)，每孔100 μL，貼壁后，分別加入不同質(zhì)量濃度的6-OHDA 和枳實黃酮提取物，各組均設3 個復孔。細胞培養(yǎng)24 h 后，去除培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 含有CCK8 的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育4 h 后于酶標儀分析450 nm 處測定吸光度。

1.2.4 細胞活性氧（ROS）水平檢測 PC12 細胞以1.0×105個/mL 密度接種于6 孔板，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)12 h，分別加入50 μM 6-OHDA 和不同質(zhì)量濃度枳實黃酮提取物（3.75、7.5、15 μg/mL），用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA 濃度到10 μmol/L。小心棄去細胞培養(yǎng)液，加入1 mL 的10 μmol/L DCFH-DA，37°C、5% CO2孵育20 min，用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3 次，用胰酶消化收集細胞，采用流式細胞儀檢測細胞的ROS 水平。

1.2.5 抗氧化酶活性檢測 將PC12 細胞以1.0×105個/mL 密度接種于6 孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)12 h貼壁后，分別加入50 μM 6-OHDA 和不同質(zhì)量濃度枳實黃酮提取物（3.75、7.5、15 μg/mL），吸去細胞培養(yǎng)液后，用pH 值7.4 的PBS 清洗3 次，加入100 μL細胞裂解液，2 000 r/min、4℃離心10 min，保留上清液待測。按試劑盒說明書測定MDA 水平及SOD、CAT、GSH-Px 活力。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值表示。使用SPSS 軟件進行單因素方差分析，P ＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 枳實黃酮提取物中總黃酮含量及組成

枳實黃酮提取物得率為12.64%，總黃酮含量35.82%。由圖1 可知，枳實黃酮提取物含9 種，蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、橙皮素、甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素，其中柚皮苷含量最高，為473.9 g/kg，其次為新橙皮苷（153.7 g/kg）和蕓香柚皮苷（59.6 g/kg）。

圖1 枳實黃酮提取物總黃酮組成及其含量

2.2 枳實黃酮提取物和6-OHDA 對PC12 細胞活力的影響

與對照組相比，6-OHDA 呈劑量依賴性的抑制PC12 細胞生長（圖2）；3.75、7.5、15 μg/mL 枳實黃酮提取物對PC12 細胞生長沒有明顯影響，但高濃度的枳實黃酮提取物明顯抑制PC12 細胞生長（圖3）。因此， 3.75、7.5、15 μg/mL 枳實黃酮提取物用于進行后續(xù)研究。由圖4 可知，3.75、7.5、15 μg/mL 枳實黃酮提取物可顯著緩解6-OHDA 對PC12 細胞生長造成的損傷。

圖2 6-OHDA 對PC12 細胞活力的影響

[圖中不同小寫字母表示處理間差異顯著（P＜0.05），下同]

圖3 枳實黃酮提取物對PC12 細胞活力的影響

圖4 枳實黃酮提取物對6-OHDA 誘導的PC12 細胞活力的影響

2.3 枳實黃酮提取物和6-OHDA 對PC12 細胞ROS 水平的影響

采用流式細胞術研究了枳實黃酮提取物和6-OHDA 對PC12 細胞ROS 水平的影響。結(jié)果（圖5）顯示，與對照組相比，6-OHDA 能夠誘導PC12 細胞內(nèi)ROS 釋放量顯著增加；而3.75、7.5、15 μg/mL 枳實黃酮提取物可顯著緩解6-OHDA 對PC12 細胞ROS的過度產(chǎn)生。

2.4 枳實黃酮提取物和6-OHDA 對PC12 細胞MDA 和氧化酶活性的影響

圖5 枳實黃酮提取物對6-OHDA 誘導的PC12 細胞ROS 水平的影響

如圖6 所示，與對照組相比，6-OHDA 組MDA含量顯著增加（圖4A），SOD、CAT 和GSH-Px 活性顯著降低（P ＜0.05）；與模型組（即只添加6-OHDA的處理組）相比，隨著枳實黃酮提取物濃度的升高，MDA 含量顯著降低，SOD、CAT 和GSH-Px 酶活性均顯著增加（P ＜0.05），但7.5 和15 μg/mL 枳實黃酮 對提高6-OHDA 誘導的PC12 細胞抗氧化酶活性沒有顯著的劑量效應。

圖6 枳實黃酮提取物對6-OHDA 誘導的PC12 細胞MDA 含量和抗氧化酶活性的影響

3 小結(jié)與討論

作為神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的羥基化衍生物，6-OHDA對很多物種都具有神經(jīng)毒性。有研究發(fā)現(xiàn)，6-OHDA在體內(nèi)外都顯示出較強的氧化損傷能力，能夠誘導細胞大量生成過氧化氫等物質(zhì)，同時下調(diào)相關抗氧化酶活性，促使活性氧的大量快速聚集。當活性氧的產(chǎn)生超出神經(jīng)元的清除能力時，細胞內(nèi)的脂質(zhì)膜結(jié)構將會受到攻擊，從而導致神經(jīng)毒性作用的產(chǎn)生[7]。試驗用6-OHDA 成功構建了PC12 細胞損傷體外PD 模型，相較于空白對照組，加入6-OHDA 后，PC12 細胞活力顯著降低，ROS 水平和MDA 含量顯著升高，而相關抗氧化酶活性顯著降低。

氧化損傷是PD 發(fā)生和發(fā)展的主要機制之一，氧化應激啟動并加重PD 反應，其主要原因是ROS 的過度產(chǎn)生。作為一種強化學介質(zhì)，ROS 能夠作用于細胞膜受體激酶，對多種細胞信號轉(zhuǎn)導途徑進行調(diào)節(jié)，損傷細胞大分子結(jié)構，攻擊細胞脂質(zhì)膜結(jié)構，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，最終導致PD 的發(fā)生[8]。有研究表明，植物提取物能夠抑制6-OHDA 誘導的細胞ROS 的過度釋放，如紅景天苷能夠減少6-OHDA 誘導的SH-SY5Y 細胞中ROS 的過度產(chǎn)生而發(fā)揮其抗氧化作用[9]。該研究發(fā)現(xiàn)，6-OHDA 能夠誘導PC12 細胞ROS 大量增加，使細胞活力下降，而添加不同濃度枳實黃酮提取物可以降低6-OHDA 誘導的PC12 細胞內(nèi)ROS 水平。

ROS 的過度增加會加劇細胞氧化損傷程度，正常情況下抗氧化酶如SOD、CAT 和GSH-Px 可以調(diào)控自由基的水平，而細胞損傷程度也可以通過MDA 含量反應[10]。植物提取物可以通過提高這些抗氧化酶活性降低MDA 含量達到治療PD 的效果。如璋芝多糖對帕金森小鼠顯示出較好的治療效果，其效果與調(diào)控抗氧化酶SOD、CAT 和GSH-Px 活性，降低MDA 含量相關[11]。研究發(fā)現(xiàn)，枳實黃酮提取物可以顯著抑制6-OHDA 誘導的PC12 細胞MDA 含量的升高，同時通過相關檢測也發(fā)現(xiàn)其可以顯著提高GSH-Px、SOD和CAT 等抗氧化酶活性，且這些變化都呈劑量正相關。

綜上所述，通過細胞生物學及分子生物學分析手段證實枳實黃酮提取物可以有效抑制6-OHDA 誘導的PC12 細胞的損傷，為枳實黃酮的應用提供了理論依據(jù)，其具體抗神經(jīng)損傷機制還有待進一步研究。