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        枳實黃酮提取物對6-羥基多巴胺所致PC12 細胞 損傷的保護作用

        2021-05-17 07:43:46梁曾恩妮李志堅
        湖南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年2期
        關(guān)鍵詞:枳實橙皮黃酮

        梁曾恩妮,李志堅,單 楊

        (湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,湖南 長沙 410125)

        帕金森病(Parkinson disease,PD)又名震顫麻痹,以靜止性震顫、動作遲緩、肌張力痙攣、舉止特征異常、眨眼反應(yīng)以及癡呆等為主要臨床表現(xiàn),是一種發(fā)生于老年前或老年期的進行性神經(jīng)退行性疾病,與中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性壞死等因素有關(guān),尚無有效的根治方法[1]。在65 歲以上的人群中發(fā)病率大約為1%~2%,目前全球帕金森病患者約為2 500萬人,我國大約有500 萬PD 患者[2]。6-羥基多巴胺(6-Hydroxydopamine,6-OHDA)可使神經(jīng)細胞發(fā)生退行性改變、老化和死亡,導(dǎo)致神經(jīng)末梢損毀,遞質(zhì)減少[3]。PC12 細胞為大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細胞,是氧化脅迫物質(zhì)的主要靶細胞。6-OHDA 作用PC12 細胞是常用的帕金森病細胞模型[4]。

        枳實是蕓香科植物酸橙及其變種或甜橙的幼果干燥制成。研究表明,枳實傳統(tǒng)功效為破氣消積,化痰散痞,臨床用于健脾開胃、理氣降逆和痰濁阻滯[5]。枳實中最能體現(xiàn)枳實特征的成分是黃酮類化合物,具有抗氧化、消炎、抗癌、抗菌等多種藥理學(xué)活性[6]。用枳實分離新橙皮苷的同時會產(chǎn)生大量的類黃酮,研究這部分物質(zhì)的成分、含量和功能,可提高經(jīng)濟效益,為枳實的開發(fā)利用增加新的附加產(chǎn)品。

        筆者以枳實為原料提取分離枳實黃酮,采用HPLC 法檢測總黃酮成分和含量,應(yīng)用CCK8 法、流式細胞術(shù)和蛋白印跡技術(shù)等方法研究枳實黃酮提取物對6-OHDA 損傷PC12 細胞的保護作用,為生產(chǎn)橙皮苷后剩余枳實黃酮的利用和進一步防治與衰老有關(guān)的神經(jīng)退行性疾病提供新思路。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        枳實由漣源康麓科技生物有限公司提供(經(jīng)鑒定為酸橙幼果Citrus aurantium L.);蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素、橙皮素、甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素標(biāo)準(zhǔn)品,購于國藥集團化工試劑有限公司;橙皮苷、香蜂草苷標(biāo)準(zhǔn)品購于北京索萊寶科技有限公司;色譜級甲醇、二甲基亞砜和乙酸購于美國默克公司;PC12 細胞由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細胞庫提供;胎牛血清購于杭州四季青公司;1640 培養(yǎng)基購于美國Sigma 公司;CCK-8 試劑盒(cell counting Kit-8)購于日本同仁。

        主要儀器有IC-20AT 型高效液相色譜儀(日本島津公司)、EL204-IC 型電子天平(美國瑞士梅特勒-托利多公司)、CKX41SF 熒光倒置顯微鏡(日本Olympus)、MK3 酶 標(biāo) 儀(美 國Thermo 公 司)、Cytoflex 流式細胞儀(美國Beckman 公司)、水套式Ⅱ型細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo 公司)、B-290 噴霧干燥機(瑞士Buchi 公司)、SHB- Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)、UV-1700 型紫外可見分光光度計(日本島津公司)。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 枳實類黃酮的提取 500 g 枳實粉碎后,加入6倍量的90%乙醇加熱回流提取2 次,每次2 h,減壓濃縮,采用BA-8 大孔樹脂對提取液進行分離,洗脫液濃縮后,用5.0%NaCl 助析,得粗晶,結(jié)晶用于獲得新橙皮苷。溶液采用DA201-C 大孔樹脂脫鹽,洗脫液噴霧干燥獲得枳實黃酮粉末,稱重。

        1.2.2 枳實黃酮提取物總黃酮的含量測定 10 種類黃酮標(biāo)品混溶于10 mL 甲醇和二甲基亞砜(體積比為1 ∶1),超聲提取30 min,10 000 r/min 離心10 min,收集上清液,再重復(fù)上述操作2 次,合并3 次提取的上清液,10 000 r/min 離心10 min,定容至50 mL,經(jīng) 0.22 μm 微孔有機濾膜過濾后于HPLC 系統(tǒng)中用C18色譜柱(4.6 mm × 150 mm,5 μm)進行色譜分離。使用甲醇(A 相)和0.2%乙酸溶液(B 相)雙流動相梯度洗脫,洗脫程序為:0~8 min,40%~60%B;8~25 min, 70%~30%B;25~32 min,40%~60%B。流速1 mL/min, 柱溫25℃,檢測波長設(shè)為283 nm。通過混標(biāo)的保留時間和峰面積,確定樣品中類黃酮組成與含量,運用分光光度法測定總黃酮含量。

        1.2.3 CCK8 檢測細胞活力 PC12 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基中,以5×103個細胞/孔密度接種于96 孔板內(nèi),每孔100 μL,貼壁后,分別加入不同質(zhì)量濃度的6-OHDA 和枳實黃酮提取物,各組均設(shè)3 個復(fù)孔。細胞培養(yǎng)24 h 后,去除培養(yǎng)基,每孔加入100 μL 含有CCK8 的培養(yǎng)基,繼續(xù)孵育4 h 后于酶標(biāo)儀分析450 nm 處測定吸光度。

        1.2.4 細胞活性氧(ROS)水平檢測 PC12 細胞以1.0×105個/mL 密度接種于6 孔板,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)12 h,分別加入50 μM 6-OHDA 和不同質(zhì)量濃度枳實黃酮提取物(3.75、7.5、15 μg/mL),用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA 濃度到10 μmol/L。小心棄去細胞培養(yǎng)液,加入1 mL 的10 μmol/L DCFH-DA,37°C、5% CO2孵育20 min,用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3 次,用胰酶消化收集細胞,采用流式細胞儀檢測細胞的ROS 水平。

        1.2.5 抗氧化酶活性檢測 將PC12 細胞以1.0×105個/mL 密度接種于6 孔板中,每孔2 mL,培養(yǎng)12 h貼壁后,分別加入50 μM 6-OHDA 和不同質(zhì)量濃度枳實黃酮提取物(3.75、7.5、15 μg/mL),吸去細胞培養(yǎng)液后,用pH 值7.4 的PBS 清洗3 次,加入100 μL細胞裂解液,2 000 r/min、4℃離心10 min,保留上清液待測。按試劑盒說明書測定MDA 水平及SOD、CAT、GSH-Px 活力。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

        所有數(shù)據(jù)均以平均值表示。使用SPSS 軟件進行單因素方差分析,P <0.05 為差異顯著。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 枳實黃酮提取物中總黃酮含量及組成

        枳實黃酮提取物得率為12.64%,總黃酮含量35.82%。由圖1 可知,枳實黃酮提取物含9 種,蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、橙皮素、甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素,其中柚皮苷含量最高,為473.9 g/kg,其次為新橙皮苷(153.7 g/kg)和蕓香柚皮苷(59.6 g/kg)。

        圖1 枳實黃酮提取物總黃酮組成及其含量

        2.2 枳實黃酮提取物和6-OHDA 對PC12 細胞活力的影響

        與對照組相比,6-OHDA 呈劑量依賴性的抑制PC12 細胞生長(圖2);3.75、7.5、15 μg/mL 枳實黃酮提取物對PC12 細胞生長沒有明顯影響,但高濃度的枳實黃酮提取物明顯抑制PC12 細胞生長(圖3)。因此, 3.75、7.5、15 μg/mL 枳實黃酮提取物用于進行后續(xù)研究。由圖4 可知,3.75、7.5、15 μg/mL 枳實黃酮提取物可顯著緩解6-OHDA 對PC12 細胞生長造成的損傷。

        圖2 6-OHDA 對PC12 細胞活力的影響

        [圖中不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05),下同]

        圖3 枳實黃酮提取物對PC12 細胞活力的影響

        圖4 枳實黃酮提取物對6-OHDA 誘導(dǎo)的PC12 細胞活力的影響

        2.3 枳實黃酮提取物和6-OHDA 對PC12 細胞ROS 水平的影響

        采用流式細胞術(shù)研究了枳實黃酮提取物和6-OHDA 對PC12 細胞ROS 水平的影響。結(jié)果(圖5)顯示,與對照組相比,6-OHDA 能夠誘導(dǎo)PC12 細胞內(nèi)ROS 釋放量顯著增加;而3.75、7.5、15 μg/mL 枳實黃酮提取物可顯著緩解6-OHDA 對PC12 細胞ROS的過度產(chǎn)生。

        2.4 枳實黃酮提取物和6-OHDA 對PC12 細胞MDA 和氧化酶活性的影響

        圖5 枳實黃酮提取物對6-OHDA 誘導(dǎo)的PC12 細胞ROS 水平的影響

        如圖6 所示,與對照組相比,6-OHDA 組MDA含量顯著增加(圖4A),SOD、CAT 和GSH-Px 活性顯著降低(P <0.05);與模型組(即只添加6-OHDA的處理組)相比,隨著枳實黃酮提取物濃度的升高,MDA 含量顯著降低,SOD、CAT 和GSH-Px 酶活性均顯著增加(P <0.05),但7.5 和15 μg/mL 枳實黃酮 對提高6-OHDA 誘導(dǎo)的PC12 細胞抗氧化酶活性沒有顯著的劑量效應(yīng)。

        圖6 枳實黃酮提取物對6-OHDA 誘導(dǎo)的PC12 細胞MDA 含量和抗氧化酶活性的影響

        3 小結(jié)與討論

        作為神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的羥基化衍生物,6-OHDA對很多物種都具有神經(jīng)毒性。有研究發(fā)現(xiàn),6-OHDA在體內(nèi)外都顯示出較強的氧化損傷能力,能夠誘導(dǎo)細胞大量生成過氧化氫等物質(zhì),同時下調(diào)相關(guān)抗氧化酶活性,促使活性氧的大量快速聚集。當(dāng)活性氧的產(chǎn)生超出神經(jīng)元的清除能力時,細胞內(nèi)的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)將會受到攻擊,從而導(dǎo)致神經(jīng)毒性作用的產(chǎn)生[7]。試驗用6-OHDA 成功構(gòu)建了PC12 細胞損傷體外PD 模型,相較于空白對照組,加入6-OHDA 后,PC12 細胞活力顯著降低,ROS 水平和MDA 含量顯著升高,而相關(guān)抗氧化酶活性顯著降低。

        氧化損傷是PD 發(fā)生和發(fā)展的主要機制之一,氧化應(yīng)激啟動并加重PD 反應(yīng),其主要原因是ROS 的過度產(chǎn)生。作為一種強化學(xué)介質(zhì),ROS 能夠作用于細胞膜受體激酶,對多種細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進行調(diào)節(jié),損傷細胞大分子結(jié)構(gòu),攻擊細胞脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu),產(chǎn)生神經(jīng)毒性,最終導(dǎo)致PD 的發(fā)生[8]。有研究表明,植物提取物能夠抑制6-OHDA 誘導(dǎo)的細胞ROS 的過度釋放,如紅景天苷能夠減少6-OHDA 誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細胞中ROS 的過度產(chǎn)生而發(fā)揮其抗氧化作用[9]。該研究發(fā)現(xiàn),6-OHDA 能夠誘導(dǎo)PC12 細胞ROS 大量增加,使細胞活力下降,而添加不同濃度枳實黃酮提取物可以降低6-OHDA 誘導(dǎo)的PC12 細胞內(nèi)ROS 水平。

        ROS 的過度增加會加劇細胞氧化損傷程度,正常情況下抗氧化酶如SOD、CAT 和GSH-Px 可以調(diào)控自由基的水平,而細胞損傷程度也可以通過MDA 含量反應(yīng)[10]。植物提取物可以通過提高這些抗氧化酶活性降低MDA 含量達到治療PD 的效果。如璋芝多糖對帕金森小鼠顯示出較好的治療效果,其效果與調(diào)控抗氧化酶SOD、CAT 和GSH-Px 活性,降低MDA 含量相關(guān)[11]。研究發(fā)現(xiàn),枳實黃酮提取物可以顯著抑制6-OHDA 誘導(dǎo)的PC12 細胞MDA 含量的升高,同時通過相關(guān)檢測也發(fā)現(xiàn)其可以顯著提高GSH-Px、SOD和CAT 等抗氧化酶活性,且這些變化都呈劑量正相關(guān)。

        綜上所述,通過細胞生物學(xué)及分子生物學(xué)分析手段證實枳實黃酮提取物可以有效抑制6-OHDA 誘導(dǎo)的PC12 細胞的損傷,為枳實黃酮的應(yīng)用提供了理論依據(jù),其具體抗神經(jīng)損傷機制還有待進一步研究。

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