梁曾恩妮，李志堅(jiān)，單 楊

（湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

帕金森?。≒arkinson disease，PD）又名震顫麻痹，以靜止性震顫、動(dòng)作遲緩、肌張力痙攣、舉止特征異常、眨眼反應(yīng)以及癡呆等為主要臨床表現(xiàn)，是一種發(fā)生于老年前或老年期的進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，與中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性壞死等因素有關(guān)，尚無(wú)有效的根治方法[1]。在65 歲以上的人群中發(fā)病率大約為1%～2%，目前全球帕金森病患者約為2 500萬(wàn)人，我國(guó)大約有500 萬(wàn)PD 患者[2]。6-羥基多巴胺（6-Hydroxydopamine，6-OHDA）可使神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生退行性改變、老化和死亡，導(dǎo)致神經(jīng)末梢損毀，遞質(zhì)減少[3]。PC12 細(xì)胞為大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細(xì)胞，是氧化脅迫物質(zhì)的主要靶細(xì)胞。6-OHDA 作用PC12 細(xì)胞是常用的帕金森病細(xì)胞模型[4]。

枳實(shí)是蕓香科植物酸橙及其變種或甜橙的幼果干燥制成。研究表明，枳實(shí)傳統(tǒng)功效為破氣消積，化痰散痞，臨床用于健脾開胃、理氣降逆和痰濁阻滯[5]。枳實(shí)中最能體現(xiàn)枳實(shí)特征的成分是黃酮類化合物，具有抗氧化、消炎、抗癌、抗菌等多種藥理學(xué)活性[6]。用枳實(shí)分離新橙皮苷的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的類黃酮，研究這部分物質(zhì)的成分、含量和功能，可提高經(jīng)濟(jì)效益，為枳實(shí)的開發(fā)利用增加新的附加產(chǎn)品。

筆者以枳實(shí)為原料提取分離枳實(shí)黃酮，采用HPLC 法檢測(cè)總黃酮成分和含量，應(yīng)用CCK8 法、流式細(xì)胞術(shù)和蛋白印跡技術(shù)等方法研究枳實(shí)黃酮提取物對(duì)6-OHDA 損傷PC12 細(xì)胞的保護(hù)作用，為生產(chǎn)橙皮苷后剩余枳實(shí)黃酮的利用和進(jìn)一步防治與衰老有關(guān)的神經(jīng)退行性疾病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

枳實(shí)由漣源康麓科技生物有限公司提供（經(jīng)鑒定為酸橙幼果Citrus aurantium L.）；蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素、橙皮素、甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化工試劑有限公司；橙皮苷、香蜂草苷標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；色譜級(jí)甲醇、二甲基亞砜和乙酸購(gòu)于美國(guó)默克公司；PC12 細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)提供；胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司；1640 培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；CCK-8 試劑盒（cell counting Kit-8）購(gòu)于日本同仁。

主要儀器有IC-20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）、EL204-IC 型電子天平（美國(guó)瑞士梅特勒-托利多公司）、CKX41SF 熒光倒置顯微鏡（日本Olympus）、MK3 酶 標(biāo) 儀（美 國(guó)Thermo 公 司）、Cytoflex 流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman 公司）、水套式Ⅱ型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司）、B-290 噴霧干燥機(jī)（瑞士Buchi 公司）、SHB- Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）、UV-1700 型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 枳實(shí)類黃酮的提取 500 g 枳實(shí)粉碎后，加入6倍量的90%乙醇加熱回流提取2 次，每次2 h，減壓濃縮，采用BA-8 大孔樹脂對(duì)提取液進(jìn)行分離，洗脫液濃縮后，用5.0%NaCl 助析，得粗晶，結(jié)晶用于獲得新橙皮苷。溶液采用DA201-C 大孔樹脂脫鹽，洗脫液噴霧干燥獲得枳實(shí)黃酮粉末，稱重。

1.2.2 枳實(shí)黃酮提取物總黃酮的含量測(cè)定 10 種類黃酮標(biāo)品混溶于10 mL 甲醇和二甲基亞砜（體積比為1 ∶1），超聲提取30 min，10 000 r/min 離心10 min，收集上清液，再重復(fù)上述操作2 次，合并3 次提取的上清液，10 000 r/min 離心10 min，定容至50 mL，經(jīng) 0.22 μm 微孔有機(jī)濾膜過(guò)濾后于HPLC 系統(tǒng)中用C18色譜柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）進(jìn)行色譜分離。使用甲醇（A 相）和0.2%乙酸溶液（B 相）雙流動(dòng)相梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?～8 min，40%～60%B；8～25 min， 70%～30%B；25～32 min，40%～60%B。流速1 mL/min， 柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為283 nm。通過(guò)混標(biāo)的保留時(shí)間和峰面積，確定樣品中類黃酮組成與含量，運(yùn)用分光光度法測(cè)定總黃酮含量。

1.2.3 CCK8 檢測(cè)細(xì)胞活力 PC12 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基中，以5×103個(gè)細(xì)胞/孔密度接種于96 孔板內(nèi)，每孔100 μL，貼壁后，分別加入不同質(zhì)量濃度的6-OHDA 和枳實(shí)黃酮提取物，各組均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，去除培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 含有CCK8 的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育4 h 后于酶標(biāo)儀分析450 nm 處測(cè)定吸光度。

1.2.4 細(xì)胞活性氧（ROS）水平檢測(cè) PC12 細(xì)胞以1.0×105個(gè)/mL 密度接種于6 孔板，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)12 h，分別加入50 μM 6-OHDA 和不同質(zhì)量濃度枳實(shí)黃酮提取物（3.75、7.5、15 μg/mL），用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA 濃度到10 μmol/L。小心棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入1 mL 的10 μmol/L DCFH-DA，37°C、5% CO2孵育20 min，用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次，用胰酶消化收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的ROS 水平。

1.2.5 抗氧化酶活性檢測(cè) 將PC12 細(xì)胞以1.0×105個(gè)/mL 密度接種于6 孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)12 h貼壁后，分別加入50 μM 6-OHDA 和不同質(zhì)量濃度枳實(shí)黃酮提取物（3.75、7.5、15 μg/mL），吸去細(xì)胞培養(yǎng)液后，用pH 值7.4 的PBS 清洗3 次，加入100 μL細(xì)胞裂解液，2 000 r/min、4℃離心10 min，保留上清液待測(cè)。按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定MDA 水平及SOD、CAT、GSH-Px 活力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值表示。使用SPSS 軟件進(jìn)行單因素方差分析，P ＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 枳實(shí)黃酮提取物中總黃酮含量及組成

枳實(shí)黃酮提取物得率為12.64%，總黃酮含量35.82%。由圖1 可知，枳實(shí)黃酮提取物含9 種，蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、橙皮素、甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素，其中柚皮苷含量最高，為473.9 g/kg，其次為新橙皮苷（153.7 g/kg）和蕓香柚皮苷（59.6 g/kg）。

圖1 枳實(shí)黃酮提取物總黃酮組成及其含量

2.2 枳實(shí)黃酮提取物和6-OHDA 對(duì)PC12 細(xì)胞活力的影響

與對(duì)照組相比，6-OHDA 呈劑量依賴性的抑制PC12 細(xì)胞生長(zhǎng)（圖2）；3.75、7.5、15 μg/mL 枳實(shí)黃酮提取物對(duì)PC12 細(xì)胞生長(zhǎng)沒有明顯影響，但高濃度的枳實(shí)黃酮提取物明顯抑制PC12 細(xì)胞生長(zhǎng)（圖3）。因此， 3.75、7.5、15 μg/mL 枳實(shí)黃酮提取物用于進(jìn)行后續(xù)研究。由圖4 可知，3.75、7.5、15 μg/mL 枳實(shí)黃酮提取物可顯著緩解6-OHDA 對(duì)PC12 細(xì)胞生長(zhǎng)造成的損傷。

圖2 6-OHDA 對(duì)PC12 細(xì)胞活力的影響

[圖中不同小寫字母表示處理間差異顯著（P＜0.05），下同]

圖3 枳實(shí)黃酮提取物對(duì)PC12 細(xì)胞活力的影響

圖4 枳實(shí)黃酮提取物對(duì)6-OHDA 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞活力的影響

2.3 枳實(shí)黃酮提取物和6-OHDA 對(duì)PC12 細(xì)胞ROS 水平的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)研究了枳實(shí)黃酮提取物和6-OHDA 對(duì)PC12 細(xì)胞ROS 水平的影響。結(jié)果（圖5）顯示，與對(duì)照組相比，6-OHDA 能夠誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞內(nèi)ROS 釋放量顯著增加；而3.75、7.5、15 μg/mL 枳實(shí)黃酮提取物可顯著緩解6-OHDA 對(duì)PC12 細(xì)胞ROS的過(guò)度產(chǎn)生。

2.4 枳實(shí)黃酮提取物和6-OHDA 對(duì)PC12 細(xì)胞MDA 和氧化酶活性的影響

圖5 枳實(shí)黃酮提取物對(duì)6-OHDA 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞ROS 水平的影響

如圖6 所示，與對(duì)照組相比，6-OHDA 組MDA含量顯著增加（圖4A），SOD、CAT 和GSH-Px 活性顯著降低（P ＜0.05）；與模型組（即只添加6-OHDA的處理組）相比，隨著枳實(shí)黃酮提取物濃度的升高，MDA 含量顯著降低，SOD、CAT 和GSH-Px 酶活性均顯著增加（P ＜0.05），但7.5 和15 μg/mL 枳實(shí)黃酮 對(duì)提高6-OHDA 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞抗氧化酶活性沒有顯著的劑量效應(yīng)。

圖6 枳實(shí)黃酮提取物對(duì)6-OHDA 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞MDA 含量和抗氧化酶活性的影響

3 小結(jié)與討論

作為神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的羥基化衍生物，6-OHDA對(duì)很多物種都具有神經(jīng)毒性。有研究發(fā)現(xiàn)，6-OHDA在體內(nèi)外都顯示出較強(qiáng)的氧化損傷能力，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞大量生成過(guò)氧化氫等物質(zhì)，同時(shí)下調(diào)相關(guān)抗氧化酶活性，促使活性氧的大量快速聚集。當(dāng)活性氧的產(chǎn)生超出神經(jīng)元的清除能力時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)將會(huì)受到攻擊，從而導(dǎo)致神經(jīng)毒性作用的產(chǎn)生[7]。試驗(yàn)用6-OHDA 成功構(gòu)建了PC12 細(xì)胞損傷體外PD 模型，相較于空白對(duì)照組，加入6-OHDA 后，PC12 細(xì)胞活力顯著降低，ROS 水平和MDA 含量顯著升高，而相關(guān)抗氧化酶活性顯著降低。

氧化損傷是PD 發(fā)生和發(fā)展的主要機(jī)制之一，氧化應(yīng)激啟動(dòng)并加重PD 反應(yīng)，其主要原因是ROS 的過(guò)度產(chǎn)生。作為一種強(qiáng)化學(xué)介質(zhì)，ROS 能夠作用于細(xì)胞膜受體激酶，對(duì)多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)，損傷細(xì)胞大分子結(jié)構(gòu)，攻擊細(xì)胞脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，最終導(dǎo)致PD 的發(fā)生[8]。有研究表明，植物提取物能夠抑制6-OHDA 誘導(dǎo)的細(xì)胞ROS 的過(guò)度釋放，如紅景天苷能夠減少6-OHDA 誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞中ROS 的過(guò)度產(chǎn)生而發(fā)揮其抗氧化作用[9]。該研究發(fā)現(xiàn)，6-OHDA 能夠誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞ROS 大量增加，使細(xì)胞活力下降，而添加不同濃度枳實(shí)黃酮提取物可以降低6-OHDA 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。

ROS 的過(guò)度增加會(huì)加劇細(xì)胞氧化損傷程度，正常情況下抗氧化酶如SOD、CAT 和GSH-Px 可以調(diào)控自由基的水平，而細(xì)胞損傷程度也可以通過(guò)MDA 含量反應(yīng)[10]。植物提取物可以通過(guò)提高這些抗氧化酶活性降低MDA 含量達(dá)到治療PD 的效果。如璋芝多糖對(duì)帕金森小鼠顯示出較好的治療效果，其效果與調(diào)控抗氧化酶SOD、CAT 和GSH-Px 活性，降低MDA 含量相關(guān)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，枳實(shí)黃酮提取物可以顯著抑制6-OHDA 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞MDA 含量的升高，同時(shí)通過(guò)相關(guān)檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)其可以顯著提高GSH-Px、SOD和CAT 等抗氧化酶活性，且這些變化都呈劑量正相關(guān)。

綜上所述，通過(guò)細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)分析手段證實(shí)枳實(shí)黃酮提取物可以有效抑制6-OHDA 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞的損傷，為枳實(shí)黃酮的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，其具體抗神經(jīng)損傷機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。