王佳麗，朱 丹，孫列雄，陳旭峰，孫建平，王如福，許 女*

（1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山西太谷030801 2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心 山西太谷030801）

大曲作為生產(chǎn)白酒和食醋的主要糖化劑和發(fā)酵劑，對(duì)酒醋產(chǎn)品的品質(zhì)至關(guān)重要。目前，大曲的制備方法仍是傳統(tǒng)的自然發(fā)酵，整個(gè)發(fā)酵制備過(guò)程依據(jù)傳統(tǒng)工藝形成的固有原料配比和環(huán)境條件變化，微生物自我組裝，互相適應(yīng)，自然演變，此消彼長(zhǎng)，其中的微生物眾多，酶系豐富，機(jī)理復(fù)雜[1]。

霉菌是大曲生產(chǎn)制備中最重要的微生物，其主要功能是產(chǎn)生大量的淀粉酶、糖化酶、蛋白酶，將原料中的淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為一些小分子物質(zhì)——還原糖、氨基酸等[2]。大曲中的優(yōu)勢(shì)霉菌是曲霉屬和根霉屬。施安輝等[3]通過(guò)對(duì)徐坊大曲的微生物區(qū)系進(jìn)研究，以及對(duì)其優(yōu)勢(shì)菌鑒定，結(jié)果顯示：中溫大曲中占優(yōu)勢(shì)的霉菌主要為黑曲霉、毛霉、根霉和青霉。姚萬(wàn)春等[4]系統(tǒng)研究瀘州老窖國(guó)窖曲中不同層次間微生物的數(shù)目、種類(lèi)及優(yōu)勢(shì)種群的差異和規(guī)律，結(jié)果顯示：在國(guó)窖曲層次間微生物的數(shù)目、種類(lèi)和優(yōu)勢(shì)種群差別較大，其中曲側(cè)表層和曲包表層的微生物數(shù)目較多，霉菌是曲中的主要菌群，微生物的種類(lèi)較少，根霉為優(yōu)勢(shì)菌群。Wang 等[5]通過(guò)DGGE 方法在中國(guó)白酒釀造用大曲中檢測(cè)到米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、土曲霉（Aspergillus terreus）等霉菌。王佳麗[6]通過(guò)菌種分離手段及ITS 測(cè)序技術(shù)在大曲制作過(guò)程中檢測(cè)到14種霉菌，對(duì)這些霉菌的產(chǎn)酶能力進(jìn)行測(cè)定，篩選出一株高產(chǎn)糖化酶、蛋白酶及纖維素酶的霉菌菌株，經(jīng)鑒定為黑曲霉。黃靜等[7]通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）法檢測(cè)到食醋大曲中主要的霉菌有曲霉、毛霉、根霉等，其中曲霉和根霉可分泌糖化酶，淀粉酶等，有利于促進(jìn)大曲發(fā)酵。

黑曲霉具有較強(qiáng)的產(chǎn)糖化酶、液化酶、蛋白酶、單寧酶的能力，還能產(chǎn)生果膠酶、纖維素酶等其它酶系[8]。目前在制醬、釀酒、制醋等一些釀造工業(yè)中，通常使用黑曲霉作為主要的糖化生產(chǎn)菌株[9]。黑曲霉對(duì)風(fēng)味也具有重要貢獻(xiàn)，如程偉等[10]從金種子濃香型大曲中分離篩選出1 株產(chǎn)糖化酶的黑曲霉Mxzd-001，將該菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)后產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)主要有醇類(lèi)、酯類(lèi)、醛類(lèi)等推測(cè)，該菌株在發(fā)酵代謝的過(guò)程中還可產(chǎn)生豐富的酸類(lèi)物質(zhì)，并為酯類(lèi)物質(zhì)的生成提供前體物質(zhì)。米根霉具有非常強(qiáng)的淀粉酶活力，多用作糖化菌，其次，米根霉還具有酒精發(fā)酵的能力，能夠同時(shí)分解蛋白質(zhì)，還可產(chǎn)生乳酸、反丁烯二酸等物質(zhì)[8]。

鑒于曲霉和根霉對(duì)大曲酶活、發(fā)酵力和最終產(chǎn)品風(fēng)味的重要作用，一些學(xué)者開(kāi)展了大曲中優(yōu)良霉菌的篩選、強(qiáng)化應(yīng)用在酒醋釀造的研究。如：王旭亮等[11]從不同香型白酒大曲中分離篩選出1株優(yōu)良米根霉（Rhizopus oryzae）Rh-07，其在大麥豌豆純種曲培養(yǎng)基中，25 ℃下培養(yǎng)7 d，糖化酶活力高達(dá)2 657.00 U/g。劉曄等[12]從浙江傳統(tǒng)玫瑰醋釀造過(guò)程中篩選出高產(chǎn)糖化酶和蛋白酶的米根霉Ml 和米曲霉M17，二者以一定比例強(qiáng)化制備的米曲可明顯縮短玫瑰醋釀造時(shí)間。

本文主要對(duì)山西老陳醋大曲中分離出的75株霉菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，從中篩選出1 株高產(chǎn)糖化酶的菌株-黑曲霉186，將其與大曲中的優(yōu)勢(shì)優(yōu)良高產(chǎn)蛋白酶菌株-米根霉774-2 進(jìn)行共培養(yǎng)，研究二者不同比例共培養(yǎng)條件下對(duì)生物量、酶活、有機(jī)酸和揮發(fā)性香氣的影響，為將來(lái)進(jìn)一步揭示霉菌間的共培養(yǎng)機(jī)制及采用優(yōu)良組合菌株進(jìn)行大曲生產(chǎn)代謝調(diào)控奠定基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 山西老陳醋大曲，山西福源昌老陳醋有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）PDA 培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g，葡萄糖20.0 g，蛋白胨2 g，KH2PO42 g，MgSO4·2H2O 1 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L。1×105Pa 滅菌20 min。

2）麩皮培養(yǎng)基 將麩皮和水按照1∶1 的質(zhì)量比進(jìn)行混合，1×105Pa 滅菌20 min。

3）大麥豌豆培養(yǎng)基 將大麥、豌豆、水按照7∶3∶4 的質(zhì)量比進(jìn)行混合，1×105Pa 滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑和儀器 乳酸、乙酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酮酸、酒石酸、草酸均為色譜純級(jí)，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；PCR 試劑，生工生物工程（上海）有限公司；PCR 引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-9100），北京瑞利分析儀器公司；酸度計(jì)（PB-21），賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；液相色譜儀（戴安U3000）、氣相色譜儀（Trace1300）、質(zhì)譜分析儀（TraceISQ），賽默飛世爾科技有限公司；Eppendorf 離心機(jī)，艾本德中國(guó)有限公司；PCR 儀（T100），美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 山西老陳醋大曲中霉菌的分離鑒定 用稀釋涂布平板法[13]在PDA 培養(yǎng)基上分離不同霉菌，30 ℃培養(yǎng)3 d，純化菌種接種至PDA 培養(yǎng)基上，觀察并記錄菌落顏色及形態(tài)[14]，通過(guò)形態(tài)描述對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行初步鑒定。

采用改良的CTAB 法[15]提取基因組，并以此為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系和條件見(jiàn)參考文獻(xiàn)[16]，PCR 反應(yīng)以ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）為ITS 基因序列的上下游引物。擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.2 山西老陳醋大曲中霉菌的篩選 用生理鹽水沖洗PDA 培養(yǎng)基上的霉菌孢子，制備孢子懸液，調(diào)整孢子懸液的濃度使其孢子濃度為106個(gè)/mL。將調(diào)整好孢子懸液濃度的霉菌均按2%接種量接種于裝有30 g 麩皮培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，30 靜置培養(yǎng)3 d。

將發(fā)酵3 d 的10 g 樣品置于90 mL 緩沖液中，40 ℃下浸提1 h，4 ℃4 000 r/min 離心20 min取上清，采用福林比色法[17]、DNS 比色法[17]、DNS比色法[15]測(cè)定上清液中蛋白酶、糖化酶和纖維素酶的活力。

1.2.3 霉菌之間相互作用研究 將篩選出的高產(chǎn)糖化酶優(yōu)良菌株——黑曲霉186 與大曲中的另1株優(yōu)勢(shì)優(yōu)良高產(chǎn)蛋白酶菌株——米根霉774-2，按照1∶0，0∶1，1∶0.1，1∶0.5，1∶1，1∶5，1∶10（體積比），總接種量為2%（體積分?jǐn)?shù)）接入大麥豌豆培養(yǎng)基中進(jìn)行共培養(yǎng)，30 ℃靜置培養(yǎng)8 d 后，測(cè)定不同比例共培養(yǎng)體系下的生物量、酶活[15，17]、總酸[18]、總酯[18]、有機(jī)酸和揮發(fā)性香氣成分。

1）有機(jī)酸的測(cè)定 取5 g 發(fā)酵培養(yǎng)物樣品，加入超純水并定容至50 mL，浸泡3 h 后抽濾，于12 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液于0.22 μm 微孔濾膜濾樣，進(jìn)樣檢測(cè)。色譜條件：液相色譜儀UItimate 3000；色譜柱選擇Agilent ZORBAXC184.6 mm×150 mm，5 μm；流動(dòng)相為pH 2.7 的20 mmol/L NaH2PO4；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)速度0.8 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；柱溫30 ℃。

2）揮發(fā)性香氣成分測(cè)定 將萃取頭在進(jìn)樣口于270 ℃老化至無(wú)雜峰，將1 g 發(fā)酵培養(yǎng)物樣品于45 ℃孵化爐中平衡30 min，頂空吸附30 min，將萃取頭插入進(jìn)樣口，270 ℃解析5 min。色譜條件：色譜柱為VF-5MS（30 mm×0.25 mm×0.25 mm），載氣：氦氣，純度99.999%，流量1 mL/min，不分流。程序升溫：起始溫度40 ℃，保持3 min，以4 ℃/min 的速度升至160 ℃，保持1 min。再以10℃/min 的速度升至270 ℃保持5 min。質(zhì)譜條件：接口溫度280 ℃，離子源溫度280 ℃，電子能量70 eV，掃描質(zhì)量范圍41～500 u。

2 結(jié)果與分析

2.1 山西老陳醋大曲中霉菌的分離鑒定

從大曲中共分離到75 株霉菌菌株，根據(jù)其菌落形態(tài)可主要分為10 類(lèi)，典型菌落形態(tài)見(jiàn)圖1。提取75 株霉菌基因組，擴(kuò)增ITS 序列，測(cè)序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行比對(duì)，鑒定結(jié)果及菌落形態(tài)描述見(jiàn)表1。

10 株典型霉菌的ITS 序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖3所示，菌186 與黑曲霉（Aspergillus niger strain）B4/1/VF（KX901281.1）和黑曲霉（Aspergillus niger）isolate NJDL-12（KT832690.1）的相似度最高，可達(dá)99%，可鑒定為黑曲霉。最終，75 株霉菌中，總狀橫梗霉（Lichtheimia ramosa）25 株，米根霉（Rhizopus oryzae）21 株，草莖點(diǎn)霉（Phoma herbarum）3 株，輪枝樣鐮刀菌（Fusarium verticillioides）3 株，黃曲霉（Aspergillus flavus）5 株，藍(lán)狀菌（Talaromyces stollii）3 株，煙曲霉（Aspergillus fumigatus）1 株，極細(xì)鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）1 株，黑曲霉（Aspergillus niger）10 株，小孢根霉（Rhizopus microsporus）3 株。

可見(jiàn)，黑曲霉和米根霉在大曲中所占比例較高，分別為13%和28%，根霉具有很強(qiáng)的淀粉酶活性，是一種常用的糖化菌，能夠產(chǎn)生一些有機(jī)酸，如乳酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸和延胡索酸等，還可以產(chǎn)生一些芳香性的風(fēng)味物質(zhì)，如酯類(lèi)物質(zhì)和乙醛、乙酸乙酯、異丁醇、異戊醇、乳酸乙酯、乙酸、苯乙醇等；曲霉菌主要有黑曲霉、黃曲霉、煙曲霉等，它們的習(xí)性與根霉相同，富含淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等酶系，黑曲霉是α-淀粉酶與酸性蛋白酶的主要來(lái)源，在釀造的高溫和酸性或強(qiáng)酸性環(huán)境下，這2種酶依舊可以發(fā)揮作用，還可以產(chǎn)生活性較高的糖化酶，它們是釀造原料中淀粉質(zhì)與蛋白質(zhì)的主要降解酶；煙曲霉在釀造中能夠分泌α-葡萄糖酐酶，可以將葡萄糖釋放，并將葡萄糖轉(zhuǎn)移給其它的受體[19]。

圖1 山西老陳醋大曲中典型霉菌的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of typical molds isolated from Daqu of Shanxi aged vinegar

表1 75 株從山西老陳醋大曲中分離的霉菌鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of 75 molds isolated from Daqu of Shanxi aged vinegar

圖2 山西老陳醋大曲中霉菌的種類(lèi)分布Fig.2 The distribution of mold species of Daqu of Shanxi aged vinegar

2.2 山西老陳醋大曲中霉菌的篩選

糖化酶是淀粉糖化酶（Glucoamylase EC.3.2.1.3）的簡(jiǎn)稱(chēng)，又稱(chēng)γ-淀粉酶（γ-amylase），它可以從淀粉的非還原性末端依次切下一個(gè)葡萄糖單位，并將淀粉水解成葡萄糖[14]。糖化酶不斷催化淀粉質(zhì)原料為葡萄糖，使之作為酒精發(fā)酵階段酵母菌的營(yíng)養(yǎng)源。在食醋釀造過(guò)程中添加糖化酶可以將酒精發(fā)酵液快速升溫，提高原料的利用率，大大縮短發(fā)酵時(shí)間[20]。

蛋白酶在食醋釀造過(guò)程中極其重要，蛋白酶具有水解作用，可以將原料與大曲中的蛋白質(zhì)分解為可溶性含氮物，如多肽、氨基酸等，蛋白酶的活性越高，食醋中可溶性含氮物就越多，原料中蛋白質(zhì)利用率越高，食醋的營(yíng)養(yǎng)越豐富，除此之外，一些氨基酸是山西老陳醋中某些風(fēng)味的前體物質(zhì)，在經(jīng)過(guò)豐富的微生物酶系的代謝后，還可以產(chǎn)生多種芳香物質(zhì)；更加重要的是，近年來(lái)研究表明，生產(chǎn)蛋白酶高活性霉菌的應(yīng)用有助于解決食醋的沉淀問(wèn)題[20-21]。

纖維素酶是一種復(fù)合酶，包括外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，在纖維素酶的作用下，食醋釀造原料中的纖維素能夠轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性的糖，從而增加了原料中可利用的碳源，纖維素酶還可以破壞原料中的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，促進(jìn)淀粉溶出，這有利于糖化酶更好地進(jìn)行糖化。纖維素酶應(yīng)用于食醋生產(chǎn)中，可提高其出醋率[18]。

圖3 10 株典型霉菌的ITS 序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS gene of 10 typical molds isolated from Daqu of Shanxi aged vinegar

山西老陳醋大曲中分離的75 株霉菌菌株，經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)酶篩選，最終得到糖化酶、蛋白酶和纖維素酶3 種酶活均較高的菌株有29 株，這29 株霉菌產(chǎn)酶具體數(shù)據(jù)見(jiàn)圖4，其中黑曲霉186 的糖化酶、纖維素酶活力最高，采用麩皮培養(yǎng)基30 ℃下培養(yǎng)3 d 的糖化酶活力可達(dá)4 279.11 U/g，顯著高于王旭亮等[11]和程偉等[10]從釀酒大曲中分離的黑曲霉在25 ℃或30 ℃下培養(yǎng)7 d（708.5 U/g）或4 d（1 050 U/g）的糖化酶活力。并且，黑曲霉186 的纖維素酶活力高達(dá)到4 476.60 U/g，顯著高于程偉等[10]從濃香型大曲中篩選出的黑曲霉Mxzd-001采用麩皮培養(yǎng)基30 ℃下培養(yǎng)4 d 的纖維素酶活力（411 U/g）。

2.3 黑曲霉186 和米根霉774-2 之間相互作用研究

2.3.1 純培養(yǎng)與共培養(yǎng)中霉菌生物量變化 米根霉（Rhizopus oryzae）774-2 在大曲中占28%（圖2），為山西老陳醋大曲中的優(yōu)勢(shì)菌，其蛋白酶活力較高，為158.19 U/g。將篩選出的高產(chǎn)酶活的黑曲霉186 和大曲優(yōu)勢(shì)優(yōu)良菌株米根霉774-2 共培養(yǎng)進(jìn)行互作研究。以黑曲霉186、米根霉774-2 純培養(yǎng)為對(duì)照（即1∶0 和0∶1），研究共培養(yǎng)相互作用對(duì)霉菌生物量的影響。如圖5所示，在不同比例下共培養(yǎng)，2 株菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)與純培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)趨勢(shì)接近，表明在不同比例下共培養(yǎng)，各菌的生長(zhǎng)均無(wú)顯著影響。

圖4 山西老陳醋大曲中霉菌酶活力測(cè)定結(jié)果Fig.4 Determination results of enzyme activity of molds isolated from Daqu of Shanxi aged vinegar

圖5 純培養(yǎng)及混合培養(yǎng)體系中黑曲霉186、米根霉774-2 生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.5 The growth curve of Aspergillus niger 186，Rhizopus oryzae 774-2 in pure and mixed culture

2.3.2 純培養(yǎng)與共培養(yǎng)產(chǎn)酶差異 將黑曲霉186和米根霉774-2 共培養(yǎng)，檢測(cè)純培養(yǎng)與共培養(yǎng)下產(chǎn)蛋白酶、糖化酶、纖維素酶的能力。如圖6所示，不同比例下共培養(yǎng)蛋白酶活力均不同程度地高于2 株菌純培養(yǎng)的蛋白酶活力。當(dāng)黑曲霉186和米根霉774-2 的比例為1∶5 時(shí)，蛋白酶活力最高，為282.04 U/g，顯著高于黑曲霉186 純培養(yǎng)（即1∶0）和米根霉774-2 純培養(yǎng)（即0∶1）的蛋白酶活力（115.88 U/g 和158.19 U/g），表明適當(dāng)添加米根霉774-2 可有效提高體系中蛋白酶的活力。徐丹等[22]比較了黃曲霉和米曲霉純培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系下的產(chǎn)蛋白酶活性，結(jié)果表明二者共培養(yǎng)10 d后，其酸性蛋白酶活性、中性蛋白酶活性和堿性蛋白酶活性比米曲霉純培養(yǎng)分別降低了3.1，3.2 和4.1 倍，證明黃曲霉對(duì)米曲霉的產(chǎn)蛋白酶活性具有抑制作用。

圖6結(jié)果證明，共培養(yǎng)體系下，同樣在二者比例為1∶5 時(shí)糖化酶和纖維素酶活力相對(duì)其它比例要高，分別達(dá)1 874.21 U/g 和300.67 U/g，然而遠(yuǎn)低于黑曲霉186 純培養(yǎng)（1∶0）時(shí)的糖化酶和纖維素酶活力。分析原因：在總接種量一定的情況下，由于添加了米根霉從而減少了高產(chǎn)糖化酶和纖維素酶菌株186 的接種量，因此造成共培養(yǎng)體系下糖化酶和纖維素酶低于黑曲霉186 純培養(yǎng)體系。然而霉菌間的產(chǎn)酶互作機(jī)制非常復(fù)雜，需進(jìn)一步系統(tǒng)深入研究。

2.3.3 純培養(yǎng)與共培養(yǎng)產(chǎn)酸差異 在制曲過(guò)程中，大曲酸度的形成來(lái)源于生酸微生物的有機(jī)酸代謝，比如乳酸菌及醋酸菌均提供一些有機(jī)酸，主要是醋酸、乳酸；脂肪的降解，生成脂肪酸等；蛋白質(zhì)、脂肪和淀粉降解之后，即進(jìn)入三羧酸循環(huán)系統(tǒng)，可生成各類(lèi)酸類(lèi)物質(zhì)[18]，大曲酸度的高低也可以定性地將大曲復(fù)合曲香物質(zhì)的強(qiáng)弱反映出來(lái)，而霉菌是大曲中的優(yōu)勢(shì)菌，霉菌不僅僅有產(chǎn)酶的能力，同時(shí)也可產(chǎn)生有機(jī)酸，提供風(fēng)味前體。關(guān)叢笑[23]從基因、蛋白表達(dá)的角度闡釋黑曲霉高產(chǎn)檸檬酸機(jī)理的同時(shí)發(fā)現(xiàn)黑曲霉可產(chǎn)生乙醛酸、琥珀酸、乳酸等多種有機(jī)酸。分析霉菌互作對(duì)大曲有機(jī)酸產(chǎn)生等風(fēng)味的影響[24]尤為重要。

如圖7所示，不同比例下共培養(yǎng)總酸差異較大。當(dāng)黑曲霉186 和米根霉774-2 的比例為1∶5時(shí)，產(chǎn)酸最高，為0.48 g/100 g，高于黑曲霉186 純培養(yǎng)（1∶0）的產(chǎn)酸量（0.36 g/100 g）。

山西老陳醋的重要組成部分之一就是有機(jī)酸，其中的不揮發(fā)酸可以中和乙酸的刺激性，從而使得醋中的酸味柔和，大曲中的有機(jī)酸在食醋生產(chǎn)過(guò)程中直接或間接進(jìn)入醋體，對(duì)食醋的品質(zhì)產(chǎn)生重大影響，檢測(cè)純培養(yǎng)與共培養(yǎng)下乳酸、丙酮酸、草酸、乙酸、酒石酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸等有機(jī)酸的含量。如圖8所示，不同比例下共培養(yǎng)產(chǎn)有機(jī)酸差異較大，共培養(yǎng)比例為1∶10，1∶5，1∶1的有機(jī)酸譜相似，聚為一簇，比例為1∶0.5，1∶0.1及純培養(yǎng)的有機(jī)酸譜聚為另一簇。當(dāng)二者比例為1∶5 時(shí)，有機(jī)酸含量最高，為4.7260 mg/g，比黑曲霉186 純培養(yǎng)顯著提高了25.13%，其中草酸、丙酮酸、琥珀酸的含量與黑曲霉186 純培養(yǎng)相比分別提高了1.9514，0.0340，0.0048 mg/g；而米根霉774-2 的比例低于黑曲霉186 時(shí)，則共培養(yǎng)體系相對(duì)于黑曲霉186 純培養(yǎng)減少了有機(jī)酸的生成，證明米根霉774-2 對(duì)黑曲霉186 產(chǎn)有機(jī)酸有一定的影響。

圖6 純培養(yǎng)及混合培養(yǎng)體系中黑曲霉186、米根霉774-2 產(chǎn)酶差異Fig.6 The enzyme production of Aspergillus niger 186，Rhizopus oryzae 774-2 in pure and mixed culture

2.3.4 純培養(yǎng)與共培養(yǎng)產(chǎn)香差異

圖7 純培養(yǎng)及混合培養(yǎng)體系中黑曲霉186、米根霉774-2 產(chǎn)酸差異Fig.7 The acid production of Aspergillus niger 186，Rhizopus oryzae 774-2 in pure and mixed culture

2.3.4.1 純培養(yǎng)與共培養(yǎng)產(chǎn)酯差異 霉菌在產(chǎn)酯生香方面亦具有極其重要的作用，是發(fā)酵食品中一類(lèi)重要的功能性微生物，例如：霉菌中的根霉能夠產(chǎn)生乙醇、2-甲基-1-丁酮、3-甲基-1-丁酮等，紅曲霉則能夠產(chǎn)生脂肪酶等，這些代謝產(chǎn)物以及酶類(lèi)可對(duì)發(fā)酵食品的風(fēng)味和口感產(chǎn)生重要影響[24]。霉菌在發(fā)酵過(guò)程中可以產(chǎn)生各種呈香物質(zhì)，比如高級(jí)醇、醛、酮、酯等，這些物質(zhì)對(duì)于大曲、食醋風(fēng)味物質(zhì)及風(fēng)味前體物質(zhì)的形成起著重要作用。圖9顯示不同比例共培養(yǎng)體系下產(chǎn)酯能力差異較大。當(dāng)黑曲霉186 和米根霉774-2 的比例為1∶0.5時(shí)，產(chǎn)酯含量最高，為6.12 g/100 g，相較于黑曲霉186 純培養(yǎng)提高了6.07%；而在其它比例下，共培養(yǎng)的產(chǎn)酯能力均低于黑曲霉186 和米根霉774-2純培養(yǎng)的產(chǎn)酯能力。

2.3.4.2 純培養(yǎng)與共培養(yǎng)揮發(fā)性香氣成分研究霉菌可以產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，例如：乙醇、苯乙醇、3-甲基丁醇、十六酸乙酯、油酸乙酯、2-甲基-1-丁酮、3-甲基-1-丁酮、乙酸、苯乙酸、3-甲基丁酸、亞麻油酸、α-亞乙基-苯乙醛等物質(zhì)，其中，許多物質(zhì)為食品中的風(fēng)味物質(zhì)和風(fēng)味前體，也是大曲中眾多呈香、呈味物質(zhì)的組成成分，對(duì)發(fā)酵食品的風(fēng)味和口感有重要影響[25-26]。因此，研究霉菌純培養(yǎng)與共培養(yǎng)的揮發(fā)性香氣成分的意義重大。

分析在大麥豌豆培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵8 天后，黑曲霉186 和米根霉774-2 純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)體系中揮發(fā)性香氣成分，選取大曲及食醋中典型的41 種風(fēng)味物質(zhì)繪制熱點(diǎn)圖（圖10），其中選取酯類(lèi)10 種，醇類(lèi)12 種，酸類(lèi)1 種，酮類(lèi)6 種，醛類(lèi)5 種和其它類(lèi)物質(zhì)7 種。檢測(cè)結(jié)果顯示，黑曲霉186 生成的醛類(lèi)和醇類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)較豐富，其中，大曲中典型的具有果香茉莉氣息的辛醛，蜜蠟花香的壬醛的含量均大于0.0080 mg/100 g，1-辛烯-3-醇的含量達(dá)到1.4618 mg/100 g。

圖8 黑曲霉186、米根霉774-2 純培養(yǎng)與共培養(yǎng)有機(jī)酸含量熱圖Fig.8 Heat map of organic acid compounds of Aspergillus niger 186 and Rhizopus oryzae 774-2 in pure and mixed culture

圖9 純培養(yǎng)及混合培養(yǎng)體系中黑曲霉186、米根霉774-2 產(chǎn)酯差異Fig.9 The ester production of Aspergillus niger 186，Rhizopus oryzae 774-2 in pure and mixed culture

純培養(yǎng)和不同比例的共培養(yǎng)體系的揮發(fā)性香氣成分含量差異較為明顯。當(dāng)黑曲霉186 和米根霉774-2 的比例為1∶0.5 時(shí)，共培養(yǎng)體系中酮類(lèi)、醛類(lèi)、醇類(lèi)、酸類(lèi)的含量最高，種類(lèi)最豐富，酯類(lèi)物質(zhì)的含量相對(duì)較高，種類(lèi)較豐富，其中，大曲中重要的風(fēng)味化合物，如呈強(qiáng)烈蘋(píng)果皮、菠蘿皮和未成熟李子皮香氣的2-甲基丁酸乙酯，有干甜而尖銳的脂蠟香氣又帶有柑橘、橙皮和玫瑰樣氣息的辛醇，帶有蘑菇和泥土味的1-辛烯-3-醇，呈強(qiáng)烈油脂、果仁和草藥香味的3-辛醇，具有柔和、愉快而持久的玫瑰香氣的苯乙醇含量分別達(dá)到0.0098，0.1131，16.5057，9.3499，0.3005 mg/100 g，顯著高于純培養(yǎng)。

結(jié)合PCA 分析（圖11），S1（黑曲霉186 純培養(yǎng)）、S2（米根霉774-2 純培養(yǎng)）、S3（黑曲霉186 與米根霉774-2 的比例為1∶0.1） 三者相距接近，表明產(chǎn)生的揮發(fā)性香氣物質(zhì)種類(lèi)和含量相似。S4，S5，S6 和S7 相距較遠(yuǎn)，說(shuō)明其它比例下的共培養(yǎng)對(duì)揮發(fā)性香氣成分的產(chǎn)生影響差異顯著，主要體現(xiàn)在醇類(lèi)、酸類(lèi)及酮類(lèi)上。從載荷圖上可以看出，對(duì)差異有重要貢獻(xiàn)的成分都集中分布于PC1 和PC2 的正向，S4（1∶0.5）集中于此，與許多揮發(fā)性香氣物質(zhì)顯著相關(guān)，即黑曲霉186 和米根霉774-2的比例為1∶0.5 共培養(yǎng)對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)很大，可見(jiàn)大曲風(fēng)味物質(zhì)與霉菌代謝活動(dòng)有重要相關(guān)性。

綜上可知，與純培養(yǎng)時(shí)相比，黑曲霉186 和米根霉774-2 在混合培養(yǎng)體系中，一些揮發(fā)性香氣成分的含量和種類(lèi)會(huì)有所增加，這些揮發(fā)性香氣成分為大曲中主要的呈味物質(zhì)，其含量變化會(huì)影響大曲的質(zhì)量及品質(zhì)，同時(shí)說(shuō)明在不同比例下，兩菌株相互作用產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)差異較大，深入研究霉菌之間相互作用機(jī)制，并有目的性地應(yīng)用于大曲強(qiáng)化對(duì)于山西老陳醋的風(fēng)味顯得十分重要。

3 結(jié)論

本文主要從山西老陳醋大曲來(lái)源的75 株霉菌中篩選出1 株高產(chǎn)糖化酶的菌株-黑曲霉186，將其與大曲中的優(yōu)勢(shì)優(yōu)良高產(chǎn)蛋白酶菌株-米根霉774-2 進(jìn)行共培養(yǎng)互作研究，結(jié)果表明當(dāng)二者比例為1∶5 時(shí)，其蛋白酶、有機(jī)酸產(chǎn)量顯著高于黑曲霉186 純培養(yǎng)；當(dāng)比例為1∶0.5 時(shí)產(chǎn)酯量較純培養(yǎng)有所提高，揮發(fā)性香氣成分的種類(lèi)和含量也高于純培養(yǎng)。本研究對(duì)霉菌共培養(yǎng)互作機(jī)制的揭示，強(qiáng)化大曲的生產(chǎn)，老陳醋的提質(zhì)增效，具有十分重要的意義。

圖10 黑曲霉186、米根霉774-2 純培養(yǎng)與共培養(yǎng)揮發(fā)性香氣成分含量熱圖Fig.10 Heat map of volatile flavour compounds of Aspergillus niger 186 and Rhizopus oryzae 774-2 in pure and mixed culture

圖11 黑曲霉186、米根霉774-2 純培養(yǎng)與共培養(yǎng)風(fēng)味PCA 分析Fig.11 PCA analysis of the flavor of Aspergillus niger 186 and Rhizopus oryzae 774-2 in pure and mixed culture