孫曉佳，李婷婷，赫彬彬，梅永超，謝 晶，勵(lì)建榮*

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 遼寧省高等學(xué)校生鮮食品產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院 遼寧錦州121013 2 大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遼寧大連116600 3 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海201306）

群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）是細(xì)菌細(xì)胞間通過(guò)分泌信號(hào)分子（Autoinducer，AI）進(jìn)行相互交流的一種通訊機(jī)制，當(dāng)信號(hào)分子濃度達(dá)到特定閾值時(shí)，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)特定基因的表達(dá)，以適應(yīng)環(huán)境的變化，進(jìn)而調(diào)控細(xì)菌的生物行為，包括生物發(fā)光、生物被膜形成及毒力因子表達(dá)等[1-3]。其中，革蘭氏陰性菌的QS 調(diào)控系統(tǒng)為luxI/R 型，所分泌的信號(hào)分子為N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（N-acyl-homoserine lactones，AHLs）[4]。微生物的生長(zhǎng)代謝是引起水產(chǎn)品腐敗的主要原因，其QS 系統(tǒng)在水產(chǎn)品的腐敗過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。研究表明，微生物許多特性的表達(dá)受溫度、pH 值、營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)等外界環(huán)境因素的影響[5]。外界環(huán)境的改變、營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的差異都可能影響微生物的QS 系統(tǒng)及其致腐能力。食源性假單胞菌具有較強(qiáng)的分泌信號(hào)分子的能力，然而，不同溫度和碳源條件下分泌的信號(hào)分子種類和產(chǎn)量明顯不同[6]。孔西曼等[7]發(fā)現(xiàn)蜂房哈夫尼菌在不同碳源或氮源培養(yǎng)條件下分泌AHLs 的能力具有顯著差異，分別以果糖、硫酸銨為碳源和氮源時(shí)AHLs 的分泌量最高。

溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria），又稱維隆氣單胞菌溫和生物型（A.veronii biovar sobria），屬于弧菌科、氣單胞菌屬，廣泛存在于植物、動(dòng)物以及海洋環(huán)境中[8]。作為魚(yú)類等水產(chǎn)品中常見(jiàn)的特定腐敗菌之一，其毒力因子的產(chǎn)生和生物被膜的形成引起嚴(yán)重的食品安全問(wèn)題，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[9-11]。本實(shí)驗(yàn)室工作人員從腐敗大菱鲆中分離得到1 株溫和氣單胞菌，發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)條件顯著影響其分泌AHLs 的能力[12-13]。此外，有研究表明不同溫度條件下蜂房哈夫尼亞菌中QS 調(diào)控基因luxI、luxR 的表達(dá)量明顯不同，低溫條件（10 ℃）下其表達(dá)量最高，而高于最適溫度（28 ℃）時(shí)表達(dá)量降低[14]。溫和氣單胞菌在水產(chǎn)品貯藏過(guò)程中可能受到各種環(huán)境脅迫，如溫度、滲透壓、pH 值和營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的改變。然而，目前關(guān)于不同環(huán)境條件對(duì)溫和氣單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)表達(dá)的影響研究較少。

本文通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)不同環(huán)境條件下（溫度、pH 值、NaCl 濃度、碳源、氮源）大菱鲆源溫和氣單胞菌luxI/luxR 基因（NCBI Reference Sequence：WP_101529659.1；WP_00 5335753.1）的表達(dá)情況，旨在探究環(huán)境因素對(duì)群體感應(yīng)調(diào)控機(jī)制的影響，為抑制溫和氣單胞菌的致腐能力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株及培養(yǎng)條件

溫和氣單胞菌從腐敗大菱鲆中分離并鑒定，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 主要試劑與儀器

瓊脂糖、DNA Maker、Ezup 柱式細(xì)菌基 因組總DNA 提取試劑盒、Taq PCR Master Mix（2×，red dye），上海生工生物工程有限公司；LB 肉湯，青島海博生物技術(shù)有限公司。

Legend Micro21R 臺(tái)式微量離心機(jī)，美國(guó)Thermo 公司；MLS-3030CH 立式壓力滅菌鍋，廣州三洋電機(jī)有限公司；MS105UD 電子分析天平，瑞士梅特勒-托利儀器有限公司；PCR 儀，德國(guó)Eppendorf 公司；Ge1Doc XR+全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)、CFX ConnectTM熒光定量PCR 檢測(cè)系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化 將溫和氣單胞菌過(guò)夜活化后，按1∶100 的體積比接種于LB 液體培養(yǎng)基中，28℃，160 r/min 培養(yǎng)12～16 h。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)及合成 以溫和氣單胞菌16S rRNA 為內(nèi)參基因，luxI/luxR 為目的基因，使用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)引物。將所得引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息見(jiàn)表1和表2。

表1 溫和氣單胞菌luxI/luxR 基因引物序列Table 1 The primers of luxI/luxR gene of Aeromonas sobria

表2 溫和氣單胞菌luxI/luxR 基因RT-qPCR 引物序列Table 2 The primers of luxI/luxR gene of Aeromonas sobria by RT-qPCR

1.3.3 DNA 提取 使用Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒提取細(xì)菌總DNA，具體步驟如下：

1）將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液分裝至1.5 mL 離心管，8 000 r/min 室溫（25 ℃）離心1 min，棄上清液。

2）加入180 μL 消化緩沖液，再加入20 μL蛋白酶K，振蕩混勻，56 ℃水浴1 h 至細(xì)胞完全裂解。

3）加入200 μL BD 緩沖液，充分混勻，再加入等量的無(wú)水乙醇，顛倒數(shù)次混勻。

4）將吸附柱放入收集管中，將上步所得溶液加入吸附柱中，靜置2 min，12 000 r/min 室溫離心1 min，倒掉收集管中的廢液。

5）將吸附柱放回收集管，加入500 μL 含有異丙醇的PW 溶液，10 000 r/min 室溫離心30 s，倒掉濾液。

6）將吸附柱放回收集管，加入500 μL 含有無(wú)水乙醇的清洗溶液，10 000 r/min 室溫離心30 s，倒掉濾液。

7）將吸附柱重新放回收集管中，12 000 r/min室溫離心2 min，去除殘留的清洗溶液。

8）取出吸附柱，轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入100 μL CE 緩沖液，靜置3 min，12 000 r/min 室溫離心2 min。提取的DNA 于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 引物適用性檢測(cè) 按上述方法提取溫和氣單胞菌DNA，以50 μL PCR 體系進(jìn)行擴(kuò)增（DNA模板1 μL；上游引物2 μL；下游引物2 μL；Taq PCR Master Mix 25 μL；無(wú)菌ddH2O 20 μL）。反應(yīng)參數(shù)為94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，58℃退火30 s，72 ℃延伸95 s，共30 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.3.5 RNA 提取及質(zhì)量檢測(cè)

1）將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液分裝至1.5 mL 離心管，10 000 r/min 離心2 min，棄上清液，加入1 mL Trizol 混勻，室溫放置5 min，以充分裂解。

2）加入1/5 體積量的氯仿，搖晃20 s，靜置3 min，12 000 r/min 離心15 min（4 ℃），將上層無(wú)色液體轉(zhuǎn)移至新的離心管中。

3）加入500 μL 異丙醇，靜置10 min，12 000×g 離心10 min（4 ℃），棄上清液。

4）加入1 mL 75%預(yù)冷乙醇（DEPC 水配制），顛倒混勻，7 500 r/min 離心5 min（4 ℃），棄上清液，靜置5～10 min，即得到純化的RNA。

1.3.6 cDNA 合成 使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒（美國(guó)THERMO SCIENTIFIC 公司）將提取的總RNA 轉(zhuǎn)錄成cDNA。

第1 步反轉(zhuǎn)錄體系為：RNA 模板 1 ng；oligo（dT）18 Primers 2 μL；RNase-free Water 9 μL。反轉(zhuǎn)錄條件：65 ℃5 min；4 ℃2 min；4 ℃∞。

第2 步反轉(zhuǎn)錄體系為：第1 步RNA 變性溶液12 μL；5X 反應(yīng)緩沖液4 μL；RiboLock RNA 酶抑制劑1 μL；10 mmol/L dNTP 混合液2 μL；RevertAid M-MuLV 1 μL。反轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃60 min；70 ℃5 min；4 ℃2 min；4 ℃∞。

1.3.7 熒光定量PCR 將獲得的cDNA 溶液進(jìn)行稀釋，以20 μL 體系進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增（cDNA 5 μL；上游引物0.5 μL；下游引物0.5 μL；2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL；無(wú) 菌ddH2O 4 μL），建立熔解曲線，所得數(shù)據(jù)跟據(jù)方程2-△△Ct計(jì)算分析基因表達(dá)量的差異。反應(yīng)參數(shù)為95 ℃3 min，95 ℃10 s，55 ℃20 s，72 ℃20 s，于75℃停留5 s，收集熒光信號(hào)，共40 個(gè)循環(huán)并在65～95 ℃范圍內(nèi)建立熔解曲線。

表達(dá)量計(jì)算公式：

△Ct（試驗(yàn)組）=Ct（目標(biāo)，試驗(yàn)組）-Ct（內(nèi)參，試驗(yàn)組）

△Ct（計(jì)算）=Ct（目標(biāo)，計(jì)算）-Ct（內(nèi)參，計(jì)算）

△△Ct=△Ct（試驗(yàn)組）-△Ct（計(jì)算）

基因表達(dá)量=2-△△Ct

1.4 不同環(huán)境因素對(duì)溫和氣單胞菌luxI/luxR 基因表達(dá)情況的影響

1.4.1 不同溫度對(duì)溫和氣單胞菌luxI/luxR 基因表達(dá)情況的影響 將溫和氣單胞菌過(guò)夜活化后，按1∶1 000 體積比接種于LB 液體培養(yǎng)基中，分別于不同溫度（4，15，28，37 ℃）下，160 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h。以LB 液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照組，按照1.3節(jié)方法測(cè)定luxI 及l(fā)uxR 基因表達(dá)量。

1.4.2 不同pH 值對(duì)溫和氣單胞菌luxI/luxR 基因表達(dá)情況的影響 將溫和氣單胞菌過(guò)夜活化后，按1∶1 000 體積比接種于不同pH 值（5.0，6.0，7.0，8.0，9.0）的LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，同上述方法測(cè)定luxI 及l(fā)uxR 基因表達(dá)量。

1.4.3 不同碳源對(duì)溫和氣單胞菌luxI/luxR 基因表達(dá)情況的影響 參考Zimmer 等[15]方法配制AB培養(yǎng)基，3 g/L K2HPO4，1 g/L NH4Cl，0.3 g/L MgSO4·7H2O，0.15 g/L KCl，1 g/L NaH2PO4，0.01 g/L CaCl2，0.0025 g/L FeSO4·7H2O，酪蛋白水解氨基酸5 g/L，碳源（5 g/L）：葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、乳糖和麥芽糖。將溫和氣單胞菌過(guò)夜活化后，按1∶1 000 體積比接種于含有不同碳源的AB 培養(yǎng)基中，28 ℃，160 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，同上述方法測(cè)定luxI 及l(fā)uxR 基因表達(dá)量。

1.4.4 不同氮源對(duì)溫和氣單胞菌luxI/luxR 基因表達(dá)情況的影響 將溫和氣單胞菌過(guò)夜活化后，按1∶1 000 體積比接種于含2%氮源（酵母浸粉、胰蛋白胨、牛肉膏、氯化銨、脲素）的LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，160 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，然后同上述方法測(cè)定luxI 及l(fā)uxR 基因表達(dá)量。

1.4.5 不同NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)溫和氣單胞菌luxI/luxR 基因表達(dá)情況的影響 將溫和氣單胞菌過(guò)夜活化后，按1∶1 000 體積比接種于不同NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.5%，1%，2%，3%，4%，5%）的LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，160 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，同上述方法測(cè)定luxI 及l(fā)uxR 基因表達(dá)量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，Origin 8.5 進(jìn)行繪圖處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫和氣單胞菌群體感應(yīng)luxI/luxR 基因的驗(yàn)證

利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物。將擴(kuò)增成功的PCR 產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序，然后將所得序列與NCBI 上GeneBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的己有序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析。圖1為luxI/luxR 基因瓊脂糖凝膠電泳圖。從圖中可以觀察到在預(yù)期大小處有明亮且單一的條帶，無(wú)引物二聚體出現(xiàn)。將測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST 比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)相似度高達(dá)99%以上，表明擴(kuò)增產(chǎn)物與目的序列的一致性。

圖1 溫和氣單胞菌luxI/luxR 基因特異性引物PCR 擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Agarose electrophoresis of Aeromonas sobria luxI/luxR genes amplification on products for ordinary PCR

2.2 熒光定量PCR 引物檢測(cè)

2.2.1 引物特異性檢測(cè) 以cDNA 作為模板進(jìn)行普通PCR 擴(kuò)增，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果如圖2所示，所設(shè)計(jì)的引物在樣品中均擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段，條帶單一且明亮，無(wú)引物二聚體，說(shuō)明引物特異性良好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 溫和氣單胞菌luxI/luxR 基因熒光定量引物PCR 擴(kuò)增電泳圖Fig.2 Agarose electrophoresis of Aeromonas sobria genes amplification on products for qPCR

2.2.2 熒光定量PCR 擴(kuò)增曲線及引物特異性分析 將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 作為模板，使用所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，建立的熔解曲線如圖3所示。在熒光定量PCR 試驗(yàn)中，SYBR Green 熒光染料只與雙鏈DNA 結(jié)合發(fā)出熒光，隨著特異性PCR 產(chǎn)物的指數(shù)擴(kuò)增，其熒光信號(hào)強(qiáng)度同步增加，而該染料也可能與非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，從而干擾試驗(yàn)結(jié)果，因此需要通過(guò)對(duì)熔解曲線進(jìn)行分析以確定引物特異性。由圖可知，各熔解曲線均只出現(xiàn)了單一的信號(hào)峰，沒(méi)有產(chǎn)生非特異性條帶及引物二聚體，說(shuō)明各引物具有良好的特異性，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 不同環(huán)境因素對(duì)溫和氣單胞菌luxI/luxR 基因表達(dá)情況的影響

圖3 溫和氣單胞菌基因熒光定量PCR 熔解曲線Fig.3 The melting curves of real-time PCR for gnens of Aeromonas sobria

2.3.1 不同溫度對(duì)溫和氣單胞菌luxI/luxR 基因表達(dá)情況的影響 溫度作為調(diào)節(jié)微生物生長(zhǎng)代謝與活力的重要因素，可直接影響細(xì)胞的生理功能，溫度過(guò)低會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)，過(guò)高則會(huì)導(dǎo)致死亡[16]。圖4所示為不同溫度條件下溫和氣單胞菌luxI/luxR 基因的表達(dá)情況。由圖可知，溫度為37℃時(shí)luxI/luxR 的表達(dá)量最低，僅為28 ℃條件下（對(duì)照組）的49.32%和36.34%。而15 ℃低溫條件下luxI/luxR 基因表達(dá)量最高，分別為對(duì)照組的214.17%和196.72%。此外，在4 ℃冷藏條件下，luxI/luxR 基因的表達(dá)量也能達(dá)到較高水平。因此，適當(dāng)?shù)牡蜏貤l件有利于luxI/luxR 基因的表達(dá)，而當(dāng)溫度升高時(shí)，2 種基因的表達(dá)能力下降。這可能是由于溫和氣單胞菌是1 種嗜冷菌，低溫脅迫刺激了其QS 系統(tǒng)，進(jìn)而通過(guò)調(diào)控QS 相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)抵抗不利環(huán)境。研究表明，副溶血弧菌中III型分泌系統(tǒng)相關(guān)毒力基因（vcrD1，vopS，vopD1）在16 ℃時(shí)表達(dá)量最高，37 ℃時(shí)基因表達(dá)量有所下降，這與本試驗(yàn)結(jié)果類似[17]。

2.3.2 不同pH 值對(duì)溫和氣單胞菌luxI/luxR 基因表達(dá)情況的影響 pH 值對(duì)維持微生物細(xì)胞正常的生長(zhǎng)代謝具有重要作用，其影響著細(xì)胞膜所帶的電荷、酶活性及膜運(yùn)輸?shù)鞍椎墓δ?，不同微生物?duì)環(huán)境中pH 值的耐受性有所差異[18-19]。如圖5所示，相較于其它pH 值條件而言，pH=8 條件下luxI/luxR 基因表達(dá)量最高。在pH=5 條件下，luxI/luxR 基因表達(dá)量分別為pH=7 條件下（對(duì)照組）的39.83%和56.80%，且當(dāng)pH=9 時(shí)luxI/luxR 基因表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的36.98%和47.24%。結(jié)果表明，中性條件對(duì)溫和氣單胞菌luxI/luxR 基因的表達(dá)情況影響較小，而酸堿性較強(qiáng)條件下luxI/luxR 基因的表達(dá)受到抑制。研究發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌中溶血素（ahH）、氣溶素（aerA）、外膜蛋白（omP）和粘附素（ahA）這4 種毒力基因在中性及偏酸性條件下均可表達(dá)，而在堿性條件下只有ahH 基因能夠表達(dá)[20]。Medina-Martínez 等[21]也報(bào)道了氣單胞菌屬在堿性條件下AHL 分泌量較少且不穩(wěn)定，均與本研究結(jié)果相似。

圖4 不同溫度對(duì)溫和氣單胞菌luxI/luxR 基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.4 Effect of different temperature on luxI/luxR gene expression in Aeromonas sobria

圖5 不同pH 值對(duì)溫和氣單胞菌luxI/luxR 基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.5 Effect of different pH value on luxI/luxR gene expression in Aeromonas sobria

2.3.3 不同NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)溫和氣單胞菌luxI/luxR 基因表達(dá)情況的影響 滲透壓對(duì)于微生物維持正常的生理功能具有重要作用，鹽濃度過(guò)高會(huì)使環(huán)境中的滲透壓增加，易造成細(xì)胞失水及細(xì)胞質(zhì)濃縮，對(duì)生長(zhǎng)與代謝造成脅迫[22]。因此，本文探究不同NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)溫和氣單胞菌luxI/luxR基因表達(dá)量的影響。如圖6所示，NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，luxI/luxR 基因表達(dá)量最高。隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增大，luxI/luxR 基因表達(dá)量逐漸下降。當(dāng)NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，luxI/luxR 基因表達(dá)量最低，僅為NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%時(shí)（對(duì)照組）的27.04%和12.04%。由此可知，鹽濃度能夠影響溫和氣單胞菌luxI 及l(fā)uxR 基因的表達(dá)情況，且低鹽濃度條件有利于2 種基因的表達(dá)，而高鹽濃度會(huì)抑制2 種基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，單增李斯特菌中毒力基因inlB 在NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為1.5%～2.0%時(shí)可高效表達(dá)，而NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%以上毒力基因inlB 的表達(dá)受到抑制，這與本研究結(jié)果相似[23]。

2.3.4 不同碳源對(duì)溫和氣單胞菌luxI/luxR 基因表達(dá)情況的影響 碳源是微生物生命活動(dòng)中不可缺少的物質(zhì)，為細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝提供所需的能量[24]。因此，本文研究不同碳源對(duì)溫和氣單胞菌群體感應(yīng)luxI/luxR 基因表達(dá)情況的影響。如圖7所示，葡萄糖為碳源時(shí)，luxI/luxR 基因表達(dá)量最高，分別為260.90%和145.34%。而當(dāng)木糖為碳源時(shí)，luxI/luxR 基因表達(dá)量最低，僅為22.34%和19.89%。其中，luxI 基因?qū)Σ煌荚吹睦媚芰σ来螢椋浩咸烟牵菊崽牵钧溠刻牵救樘牵竟牵灸咎?；luxR 基因?qū)Σ煌荚吹睦媚芰σ来螢椋浩咸烟牵救樘牵菊崽牵钧溠刻牵竟牵灸咎恰Ｒ虼?，不同碳源能夠影響溫和氣單胞菌luxI/luxR 基因的表達(dá)，且對(duì)luxI 基因表達(dá)量的影響較為明顯。本實(shí)驗(yàn)室前期探究了不同碳源對(duì)溫和氣單胞菌分泌AHLs 的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以葡萄糖、蔗糖和麥芽糖為碳源時(shí)，分泌AHLs 能力最強(qiáng)，與本研究結(jié)果呈一致性[13]。

圖6 不同氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)溫和氣單胞菌luxI/luxR基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.6 Effect of different sodium chloride mass fractions on luxI/luxR gene expression in Aeromonas sobria

圖7 不同碳源對(duì)溫和氣單胞菌luxI/luxR 基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.7 Effect of different carbon sources on luxI/luxR gene expression in Aeromonas sobria

2.3.5 不同氮源對(duì)溫和氣單胞菌luxI/luxR 基因表達(dá)情況的影響 氮源作為微生物生長(zhǎng)代謝的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供能源，不同細(xì)菌對(duì)不同氮源的利用率有所差異[25]。圖8所示為不同氮源對(duì)溫和氣單胞菌luxI/luxR 基因表達(dá)情況的影響。從圖中可以看出，當(dāng)胰蛋白胨為氮源時(shí)，luxI/luxR 基因相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高，分別為150.23%和208.89%。而當(dāng)脲素為氮源時(shí)，luxI/luxR 基因相對(duì)表達(dá)量最低，分別為42.40%和22.51%。其中，luxI 基因?qū)Σ煌吹睦媚芰σ来螢椋阂鹊鞍纂耍韭然@＞牛肉膏＞酵母浸粉＞脲素；luxR 基因?qū)Σ煌吹睦媚芰σ来螢椋阂鹊鞍纂耍韭然@＞酵母浸粉＞牛肉膏＞脲素。由此可知，胰蛋白胨為溫和氣單胞菌培養(yǎng)的最佳氮源，可明顯促進(jìn)luxI/luxR 基因的表達(dá)能力。研究發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌以胰蛋白胨為氮源時(shí)，其毒力因子胞外蛋白酶的產(chǎn)量最高，這與本研究所得結(jié)果類似[26]。

3 結(jié)論

圖8 不同氮源對(duì)溫和氣單胞菌luxI/luxR 基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.8 Effect of different nitrogen sources on luxI/luxR gene expression in Aeromonas sobria

本研究以溫和氣單胞菌QS 調(diào)控基因luxI/luxR 為研究對(duì)象，探究了不同環(huán)境條件對(duì)該基因表達(dá)情況的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溫和氣單胞菌luxI/R系統(tǒng)的表達(dá)情況受環(huán)境因素調(diào)控，當(dāng)受到環(huán)境脅迫時(shí)，可通過(guò)QS 系統(tǒng)調(diào)節(jié)其生物行為。適當(dāng)?shù)蜏兀?5 ℃）及弱堿（pH＝8）條件有利于luxI/luxR 基因的表達(dá)，而高溫（37 ℃）及強(qiáng)酸堿性（pH＝5 或9）使2 種基因的表達(dá)受到抑制。此外，隨著NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，2 種基因的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。不同碳源條件下luxI/luxR 基因的表達(dá)情況明顯不同，其中在以葡萄糖為碳源時(shí)，2 種基因的表達(dá)水平最高，且luxI 基因?qū)μ荚吹拿舾谐潭蕊@著高于luxR基因。不同氮源條件下luxI 基因表達(dá)情況依次為胰蛋白胨＞氯化銨＞牛肉膏＞酵母浸粉＞脲素，而luxR 基因表達(dá)情況依次為胰蛋白胨＞氯化銨＞酵母浸粉＞牛肉膏＞脲素。本文主要研究了環(huán)境條件對(duì)溫和氣單胞菌QS 相關(guān)基因luxI/luxR 表達(dá)情況的影響，為進(jìn)一步探究環(huán)境因素對(duì)溫和氣單胞菌QS 系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用提供理論基礎(chǔ)。