李秋瑩，徐瑾秀，朱金帥，林 洪，孫 彤，勵(lì)建榮*

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧錦州121013 2 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州121013 3 中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島266100）

水產(chǎn)品口感鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)，然而，水產(chǎn)品極易腐敗變質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于微生物的生長(zhǎng)和入侵是導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗的主要因素[1]，因此水產(chǎn)品的保鮮過(guò)程中對(duì)微生物的抑制十分重要。低溫保鮮技術(shù)是使用最早，也是應(yīng)用最廣的水產(chǎn)品保鮮技術(shù)[2]。低溫會(huì)使微生物的生理機(jī)能發(fā)生重要的變化，比如膜流動(dòng)性降低，核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增強(qiáng)，轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白折疊的效率降低等[3]。在低溫下有些微生物仍能以一定的生長(zhǎng)速率生長(zhǎng)，即使生長(zhǎng)較慢。腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）是一種耐冷菌，在0 ℃下也能生長(zhǎng)、繁殖，其在有氧冷凍或冷藏狀態(tài)下是多種水產(chǎn)品的特定腐敗菌[4]，引起冷藏水產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)，這嚴(yán)重降低了水產(chǎn)品的品質(zhì)，極有可能導(dǎo)致食品安全問(wèn)題。鑒于水產(chǎn)品保鮮的重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值，深入了解腐敗希瓦氏菌低溫適應(yīng)的分子機(jī)制，可以輔助預(yù)測(cè)腐敗菌在冷藏食品中的行為，便于進(jìn)行更準(zhǔn)確的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和防范。

研究發(fā)現(xiàn)，微生物在低溫作用下會(huì)產(chǎn)生冷應(yīng)激反應(yīng)，生成一系列的抗低溫蛋白，稱為冷激蛋白（Cold shock protein，CSPs）[5]。細(xì)菌冷激蛋白是一類包含核酸結(jié)合冷休克結(jié)構(gòu)域的高度保守的小分子蛋白（～7.4 ku），可以作為分子伴侶與單鏈DNA或單鏈RNA 結(jié)合，阻止DNA 或RNA 在低溫下形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄和翻譯[6]。此外，冷激蛋白還參與細(xì)菌的多個(gè)生理生化過(guò)程，如：細(xì)胞膜的流動(dòng)性，細(xì)菌正常生長(zhǎng)與分化，營(yíng)養(yǎng)脅迫，細(xì)菌的毒力等。冷激蛋白對(duì)細(xì)菌在低溫時(shí)恢復(fù)生長(zhǎng)和發(fā)揮細(xì)胞各種功能是非常重要的[7-9]，是解析微生物低溫適應(yīng)機(jī)制的關(guān)鍵蛋白。然而，目前關(guān)于腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的研究鮮有報(bào)道。

細(xì)菌通常具有多個(gè)冷激蛋白，且冷激蛋白的作用規(guī)律十分復(fù)雜，并非所有冷激蛋白都受低溫誘導(dǎo)表達(dá)[10]。通過(guò)對(duì)NCBI（National center for biotechnology information）數(shù)據(jù)庫(kù)中腐敗希瓦氏菌模式菌株的全基因組序列檢索，發(fā)現(xiàn)腐敗希瓦氏菌中存在3 個(gè)典型冷激蛋白，目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)其主要冷激蛋白及相關(guān)功能的研究。本文以水產(chǎn)品的腐敗希瓦氏菌為研究對(duì)象，通過(guò)PCR 擴(kuò)增獲得水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌的3 個(gè)冷激蛋白基因序列，在此基礎(chǔ)上通過(guò)生物信息學(xué)分析腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能特性等，旨在為冷激蛋白在腐敗希瓦氏菌低溫適應(yīng)過(guò)程中的功能研究，以及對(duì)水產(chǎn)品中腐敗希瓦氏菌的抑制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腐敗希瓦氏菌為本實(shí)驗(yàn)室自腐敗的冷藏大菱鲆中分離所得，于-80 ℃保藏。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polemerase chain reaction，PCR）引物委托生工生物工程（上海）技術(shù)服務(wù)有限公司合成。EasyTaqRDNA Polymerase，北京全是金生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、GeneRed 核酸染料，天根生化科技（北京）有限公司；Biowest 瓊脂糖、LB 營(yíng)養(yǎng)瓊脂、LB 營(yíng)養(yǎng)肉湯，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

防蒸發(fā)梯度PCR，美國(guó)Eppendrof 公司；凝膠電泳及配套設(shè)備，美國(guó)Bio-Bad 公司；微量冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo 公司。

1.3 菌種鑒定及冷激蛋白基因的克隆與測(cè)序

活化本實(shí)驗(yàn)室保藏的腐敗希瓦氏菌，按照基因組DNA 提取試劑盒的操作步驟提取基因組DNA，利用細(xì)菌16S rRNA 基因通用引物27F 和1492R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得腐敗希瓦氏菌的16S rRNA 基因（表1）[11]。采用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） 檢索近緣腐敗希瓦氏菌菌株基因組信息（GenBank：CP002457.1），依據(jù)注釋冷激蛋白基因及其上、下游序列，設(shè)計(jì)引物（表1），進(jìn)行冷激蛋白的Csp1589，Csp1376 和Csp2252 基因的擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增條件為94 ℃5 min；94 ℃30 s，Tm℃30 s（詳見(jiàn)表1），72 ℃45 s，循環(huán)30 次。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至上海生工測(cè)序。

表1 菌種鑒定及冷激蛋白基因擴(kuò)增的引物Table 1 Primers of strain identification and cold shock protein gene amplification

1.4 系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建

自NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得大腸桿菌（NC_000913.3）的9 個(gè)冷激蛋白（CspA～I(xiàn)），以FASTA file 形式保存。通過(guò)軟件Clustal X 對(duì)測(cè)序所得腐敗希瓦氏菌冷激蛋白和大腸桿菌的冷激蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，并用Mega7.0 中的鄰接法 （Neighbor-jioning method，NJ）為其構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，步長(zhǎng)值（Bootstrap values）為1 000[12]。

1.5 冷激蛋白的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)

用ExPASy 網(wǎng)站中的一個(gè)工具ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）來(lái)預(yù)測(cè)腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的基本生理、生化特征，用PSORT www Server 中的PSORT Prediction 工具預(yù)測(cè)冷激蛋白細(xì)胞定位，用TMHMM Server 2.0 預(yù)測(cè)冷激蛋白跨膜區(qū)域，用SignalIP 5.0 在線預(yù)測(cè)冷激蛋白信號(hào)肽，用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）預(yù)測(cè)冷激蛋白結(jié)構(gòu)域的構(gòu)成及其功能，用在線軟件NCBI Conserved Domain Search 進(jìn)行其氨基酸保守序列分析。

1.6 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與模型質(zhì)量評(píng)估

使 用PSIPRED （http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/） 預(yù)測(cè)腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。將腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org）網(wǎng)站進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)[13]。將構(gòu)建的蛋白三級(jí)模型用PROCHECK 和Verify3D 進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估[14-16]。PROCHECK 和Verify3D 是SAVES v5.0（http：//servicesn.mbi.ucla.edu/SAVES/）中的結(jié)構(gòu)評(píng)估服務(wù)。

1.7 互作蛋白及配體結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)

用STRING（https：//string-db.org/）工具確定在活體內(nèi)與腐敗希瓦氏菌冷激蛋白存在相互作用的蛋白。這種相互作用既包括蛋白質(zhì)之間直接的物理相互作用，也包括蛋白質(zhì)之間間接的功能相關(guān)性[17]。將從SWISS-MODEL 得到的模型文件輸入COACH （https：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/COACH/），以預(yù)測(cè)腐敗希瓦氏菌冷激蛋白潛在的配體結(jié)合位點(diǎn)[18-19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷激蛋白基因的克隆

通過(guò)16S 測(cè)序結(jié)果的比對(duì)分析確定該菌為腐敗希瓦氏菌。以這株水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌的基因組DNA 為模板，用相應(yīng)引物對(duì)冷激蛋白基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，然后用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物[19]，結(jié)果如圖1所示。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度在500 bp 左右，與預(yù)期的產(chǎn)物大小相符。將PCR 產(chǎn)物送至上海生工測(cè)序，并將測(cè)序序列用ORF Finder 軟件和Blast 分析。使用ORF Finder軟件的結(jié)果表明，克隆的基因片段都有完整的開放閱讀框 （ORF），3 個(gè)冷激蛋白基因Csp1589，Csp1376 和Csp2252 的ORF 長(zhǎng)度分別為210，210，207 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，分別編碼69，69，68 個(gè)氨基酸。Blast 結(jié)果表明，水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌的3 個(gè)冷激蛋白基因與腐敗希瓦氏菌模式菌株的3 個(gè)冷激蛋白基因的序列相似性均達(dá)100%，說(shuō)明冷激蛋白高度保守。

2.2 系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建

使用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建腐敗希瓦氏菌和大腸桿菌的冷激蛋白的系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果如圖2所示。水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌的冷激蛋白基因Csp1589 和Csp1376 與大腸桿菌的冷激蛋白基因CspA 聚類在同一類群，表明它們之間的有較高的相似性和較近的親緣關(guān)系。大腸桿菌CspA 為主要的冷誘導(dǎo)蛋白，低溫下大量表達(dá)[7，20-21]。初步推測(cè)Csp1589 和Csp1376 在腐敗希瓦氏菌對(duì)低溫脅迫的適應(yīng)中起關(guān)鍵作用。腐敗希瓦氏菌的冷激蛋白基因Csp2252 與大腸桿菌的冷激蛋白基因CspD位于同一分枝，大腸桿菌CspD 在營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)大量表達(dá)并能結(jié)合單鏈DNA，從而抑制染色體的復(fù)制[22]，因此腐敗希瓦氏菌的冷激蛋白基因Csp2252可能與細(xì)胞生長(zhǎng)分化有關(guān)。

2.3 冷激蛋白的理化特點(diǎn)

圖1 冷激蛋白基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of PCR amplification products of CSPs genes

圖2 冷激蛋白系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.2 Phylogenetic analysis of the CSPs

利用ProtParam 預(yù)測(cè)腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的基本生理、生化特征，結(jié)果見(jiàn)表2。預(yù)測(cè)的腐敗希瓦氏菌冷激蛋白是由68～69 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，分子質(zhì)量在7.4 ku 左右的小分子蛋白，且其帶負(fù)電荷的氨基酸的量大于帶正電荷氨基酸的量，即酸性氨基酸的量大于堿性氨基酸的量，PI 小于7，說(shuō)明這些蛋白質(zhì)都是酸性蛋白質(zhì)，符合CSPs 的特點(diǎn)[23-24]。蛋白質(zhì)的總平均親水性為負(fù)數(shù)，說(shuō)明測(cè)定的蛋白皆為親水性蛋白[25]。由不穩(wěn)定系數(shù)可知，除Csp2252 外，蛋白質(zhì)在體外的穩(wěn)定性都較好，在大腸桿菌體內(nèi)的半衰期大于10 h。PSORT 預(yù)測(cè)腐敗希瓦氏菌冷激蛋白皆定位于細(xì)胞質(zhì)。TMHMM預(yù)測(cè)結(jié)果顯示腐敗希瓦氏菌冷激蛋白均不存在α螺旋跨膜，是非跨膜蛋白。SignalIP 預(yù)測(cè)結(jié)果表明腐敗希瓦氏菌冷激蛋白不存在信號(hào)肽，不能分泌到胞外。推測(cè)腐敗希瓦氏菌的3 個(gè)冷激蛋白均為非分泌型、非跨膜蛋白，冷激蛋白在腐敗希瓦氏菌細(xì)胞質(zhì)中合成后不進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，而是保留在細(xì)胞基質(zhì)中發(fā)揮作用。

表2 冷激蛋白的理化性質(zhì)分析Table 2 Analysis of the psysicochemical property of the CSPs

2.4 冷激蛋白的氨基酸保守序列及結(jié)構(gòu)域分析

將腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的氨基酸序列提交至CD service，檢測(cè)結(jié)果顯示：腐敗希瓦氏菌的冷激蛋白Csp1589、Csp1376 和Csp2252 都具有DNA 結(jié)合位點(diǎn)和RNA 結(jié)合基序，且同屬于類S1總科。類S1 總科是一類包含與核糖體蛋白S1 的RNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域相似的結(jié)構(gòu)域的蛋白合集[26]。這種結(jié)構(gòu)最初在S1 核糖體蛋白中被發(fā)現(xiàn)，目前已在多種RNA 相關(guān)蛋白中被發(fā)現(xiàn)。SMART 預(yù)測(cè)結(jié)果表明：腐敗希瓦氏菌的3 個(gè)冷激蛋白都包含冷休克結(jié)構(gòu)域（Cold shock domain，CSD），冷休克結(jié)構(gòu)域?qū)儆陬怱1 總科這個(gè)超級(jí)家族，且其從原核生物到高等真核生物高度保守，具有RNA 分子伴侶功能[27-28]。包含冷休克結(jié)構(gòu)域的蛋白可以參與多種細(xì)胞生理生化過(guò)程，包括對(duì)低溫的適應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)脅迫、細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程等[29]。此外，由圖3可知腐敗希瓦氏菌的冷激蛋白Csp1589 和Csp1376 屬于保守蛋白結(jié)構(gòu)域家族CspC，是冷誘導(dǎo)蛋白，因此推測(cè)Csp1589 和Csp1376 與細(xì)菌對(duì)低溫的適應(yīng)性有關(guān)；而腐敗希瓦氏菌Csp2252 不屬于CspC 家族，其可能參與其它的細(xì)胞過(guò)程，這個(gè)結(jié)果與上述系統(tǒng)發(fā)生樹的結(jié)果一致。

圖3 腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的氨基酸保守序列Fig.3 Amino acid conserved sequence of S.putrefaciens CSPs

2.5 冷激蛋白的結(jié)構(gòu)分析

為更好了解冷激蛋白潛在的生物功能，分析其蛋白的空間結(jié)構(gòu)。將水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的氨基酸序列提交到PSIPRED 預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果見(jiàn)圖4。典型的冷激蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)包含5 個(gè)β 折疊[24]，預(yù)測(cè)得到的二級(jí)結(jié)構(gòu)與這個(gè)結(jié)果大致相符，Csp1589 和Csp1376 二級(jí)結(jié)構(gòu)的最后一個(gè)β 折疊出現(xiàn)斷層，這可能是天冬酰胺預(yù)測(cè)可信度太低所致。

圖4 腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 Secondary structure of S.putrefaciens CSPs

圖5 腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)評(píng)估Fig.5 Tertiary structure and structure assessment of S.putrefaciens CSPs

將冷激蛋白的氨基酸序列提交SWISS-MODEL 網(wǎng)站，根據(jù)序列相似性及模型質(zhì)量分別選取1mjc 的A 鏈、5xv9 的A 鏈、3i2z 的B 鏈作為Csp1589、Csp1376 和Csp2252 的模板建模。然后，用PROCHECK 和verify3D 對(duì)所建三級(jí)模型進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。構(gòu)建的腐敗希瓦氏菌冷激蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)都包含5 個(gè)反向平行的β 鏈，其形成了一個(gè)桶狀結(jié)構(gòu)，符合冷激蛋白的已知特征[24]。由拉氏構(gòu)象圖可看出，對(duì)于Csp1589 蛋白模型，氨基酸處于有利區(qū)域、額外允許區(qū)域、一般允許區(qū)域以及不允許區(qū)域的量分別為88.9%，11.1%，0%和0%。對(duì)于Csp1376 型蛋白模型，對(duì)應(yīng)值分別為92.7%，7.3%，0.0%和0.0%。對(duì)于Csp2252 型蛋白模型，對(duì)應(yīng)值分別為96.1%，3.9%，0.0%和0.0%，氨基酸全部處于有利區(qū)域和額外允許區(qū)域，模型質(zhì)量較好。在Verify3D 結(jié)果中，對(duì)于Csp1589、Csp1376 和Csp2252 模型，平均分≥0.2 的氨基酸的量分別是和100%，89.86%和100%，平均分≥0.2 的氨基酸的量達(dá)到80%就認(rèn)為蛋白三級(jí)模型是合格的，因此，以verify3D 結(jié)果來(lái)看，這3 個(gè)模型均具有較好的質(zhì)量。

2.6 冷激蛋白的互作蛋白及配體結(jié)合位點(diǎn)分析

利用STRING 和COACH 網(wǎng)站對(duì)腐敗希瓦氏菌冷激蛋白進(jìn)行分析，得到如圖6所示與其緊密作用的蛋白質(zhì)和潛在的配體結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)于腐敗希瓦氏菌冷激蛋白 Csp1589、Csp1376 和Csp2252，STRING 分別檢測(cè)到5，4，10 個(gè)與其相互作用的蛋白（圖6）。與冷激蛋白Csp1589 存在相互作用的蛋白是組氨酸激酶（ABP76854.1）、甲基轉(zhuǎn)移酶（ABP75296.1）、DNA 聚合酶1（polA）、多功能融合蛋白（trpC）、伴侶蛋白（htpG）。與冷激蛋白Csp1376 存在相互作用的蛋白是組氨酸激酶（ABP76854.1）、DNA 聚合酶1（polA）、多功能融合蛋 白（trpC）、伴 侶 蛋 白（htpG）。與 冷 激 蛋 白Csp2252 存在相互作用的蛋白是依賴ATP 的Clp蛋白酶（ABP75948.1）、依賴ATP 的Clp 蛋白酶適配蛋白（ClpS）、組氨酸激酶（ABP76854.1）、DNA聚合酶1（polA）、多功能融合蛋白（trpC）、組氨酸-磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶（hisC）、磷酸庚糖異構(gòu)酶（gmhA）、含有CBS 結(jié)構(gòu)域的蛋白（ABP76571.1）、氮調(diào)控蛋白PtsN（ABP74443.1）、伴侶蛋白（htpG）。其中組氨酸激酶是一個(gè)磷酸化組氨酸保守殘基的信號(hào)傳導(dǎo)酶家族，參與構(gòu)成雙組分信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)。雙組分信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)可以感應(yīng)環(huán)境變化，應(yīng)對(duì)環(huán)境變化引起的負(fù)面效應(yīng)[30]，研究表明一些雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)參與了細(xì)菌的低溫適應(yīng)過(guò)程[10]，推測(cè)腐敗希瓦氏菌冷激蛋白與細(xì)胞對(duì)逆境的適應(yīng)有關(guān)。DNA聚合酶是DNA 復(fù)制的重要酶，冷激蛋白可能與DNA 復(fù)制有關(guān)。冷激蛋白作為一種伴侶蛋白，可能與伴侶蛋白htpG 存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。從分析結(jié)果可推測(cè)相較Csp1589 和Csp1376，腐敗希瓦氏菌冷激蛋白Csp2252 的功能可能更為復(fù)雜。在許多重要的生命活動(dòng)中，蛋白質(zhì)功能的執(zhí)行依賴于蛋白質(zhì)與配體的相互作用，對(duì)于蛋白質(zhì)配體結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)具有重要的意義[31]。例如：把小分子放到目的蛋白的配體結(jié)合位點(diǎn)，優(yōu)化配體構(gòu)象和位置，使之和目的蛋白有最佳的結(jié)合作用，就有可能發(fā)現(xiàn)抑制該蛋白的化合物。對(duì)于腐敗希瓦氏菌冷激蛋白Csp1589、Csp1376 和Csp2252，其分別預(yù)測(cè)到2，2，1 個(gè)可能性較高的配體結(jié)合位點(diǎn)（圖6）。

圖6 腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的互作蛋白及其潛在的配體結(jié)合位點(diǎn)Fig.6 Protein and protein interaction and potential ligand binding site of S.putrefaciens CSPs

3 結(jié)論

冷激蛋白是解析細(xì)菌低溫適應(yīng)的關(guān)鍵蛋白之一。本研究成功擴(kuò)增了水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌的3個(gè)冷激蛋白基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能方面的相關(guān)進(jìn)展。腐敗希瓦氏菌冷激蛋白均為親水的小分子酸性蛋白質(zhì)，皆位于細(xì)胞質(zhì)，為非分泌型、非跨膜蛋白，都存在冷激蛋白特有的冷休克結(jié)構(gòu)域，存在DNA 結(jié)合位點(diǎn)和RNA 結(jié)合基序（motif），能與單鏈DNA 和單鏈RNA 結(jié)合。腐敗希瓦氏菌冷激蛋白Csp1589和Csp1376 與大腸桿菌冷激蛋白CspA 親緣關(guān)系較近，可能在腐敗希瓦氏菌低溫適應(yīng)過(guò)程中起重要作用。冷激蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)均符合冷激蛋白家族的特征，其可靠的三級(jí)模型可用于各種對(duì)接和藥物靶向研究。通過(guò)蛋白互作和配體結(jié)合位點(diǎn)的分析，對(duì)其功能有更深的了解，為后續(xù)驗(yàn)證冷激蛋白在腐敗希瓦氏菌低溫適應(yīng)過(guò)程中的功能，以及水產(chǎn)品中腐敗希瓦氏菌冷激蛋白抑制劑的篩選奠定基礎(chǔ)。