吳杉杉 王俏洋 江佳星

脫落細胞學檢查憑借著取材方法快速、簡單、創(chuàng)傷小等優(yōu)勢已經(jīng)成為病理檢查的常規(guī)方法之一，但傳統(tǒng)的細胞學涂片常常因為細胞量不足、細胞易出現(xiàn)退變及結構不清等原因，導致細胞學診斷的困難[1-3]。目前薄層液基細胞學檢查雖然改善了傳統(tǒng)細胞學的制片質量，但此檢查方法處理的細胞樣本不易獲得細胞排列方式和背景對照細胞，導致難以鑒別可疑和高分化癌細胞以及反應性間皮細胞和間皮瘤[4-6]。隨著分子病理檢測技術、免疫組化抗體檢測技術的廣泛應用，體腔積液樣本可以提供更多的有效信息[3，7]，但不管是常規(guī)涂片還是液基制片，均不能進行后續(xù)的免疫組化及分子檢測，而細胞蠟塊可以明確積液中細胞成分的分化來源以及性質，也可以為后續(xù)相關檢測提供源源不斷的樣本數(shù)量，為靶向治療提供可靠的依據(jù)。本研究采用3種不同的固定方法，對同一漿膜腔積液提供的細胞蠟塊進行制作，以尋求最佳固定方法，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 收集2020年1至4月浙江省臺州醫(yī)院病理科送檢的胸腹水標本60例，其中胸水標本32例，腹水標本28例；男37例，女23例；年齡 32～89（62.60±11.84）歲。

1.2 試劑 10%中性緩沖甲醛購自寧波同盛生物科技有限公司；薄層液基細胞學檢查指定保存液購自美國BD公司；細胞蠟塊制作試劑盒購自廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司。按需要選擇細胞角蛋白（CK，克隆號：AE1/AE3）、CK7（克隆號：OV-TL12/30）、CK20（克隆號：Ks20.8）、微管素（Villin，克隆號：CWWB1）、癌胚抗原（CEA，克隆號：CoL-1）、尾型同源盒轉錄因子 2（Cdx-2，克隆號：EPR2764Y）、甲狀腺轉錄因子（TTF-1，克隆號：SPT24）、鈣結合蛋白（CR，克隆號：MX027）等抗體，一抗試劑購自福州邁新公司，二抗以及DAB顯色系統(tǒng)購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞蠟塊制作法 （1）臨床送檢的新鮮體液標本，量為200～500 ml。將其于陰涼處或4℃冰箱內靜置10 min，然后將上1/3的上清液倒入廢液桶，將剩余體液倒入標記好1、2、3的3個50ml尖底離心管，各約50 ml，2 500 r/min離心10 min，然后將上清液倒入廢液桶。若標本細胞量過少，無需靜置后倒去上清液，直接采用多次離心（2 500 r/min）輕輕吸棄上清液的方法，富集細胞后保留沉淀。若標本為血性標本，將標本倒入離心管內首次離心，2 500 r/min離心10 min，緩慢傾倒上清液，再加適量冰醋酸乙醇溶液（95%乙醇95 ml+冰醋酸5 ml）于離心管內，充分振蕩混勻，以混合液為淺紅色為佳，再次離心（2 500 r/min）10 min，緩慢傾倒上清液。繼而對每管進行相應的制作處理。（2）1號離心管中加入10%中性緩沖甲醛10 ml，振蕩，于陰涼處或4℃冰箱內靜置2 h后2 500 r/min離心10 min，緩慢傾倒上清液，再加入95%乙醇5 ml后振蕩，于陰涼處或4℃冰箱內靜置1 h后2 500 r/min離心10 min。2號離心管中加入薄層液基細胞學檢查指定保存液10 ml，充分振蕩，于陰涼處或4℃冰箱內靜置2 h后2 500 r/min離心10 min，緩慢傾倒上清液。3號離心管中滴加細胞蠟塊制作試劑盒的試劑A 1～3滴，充分振蕩混勻，2 500 r/min離心10 min，若上清液較多，吸棄多余的上清液，然后滴加試劑B 2～3滴，輕輕晃動離心管，靜置30 s。（3）用軟吸管將離心管底部的沉淀物吸出，置于包埋紙上，包好，放入包埋盒中，放入自動脫水機中與常規(guī)組織一起進行脫水。待處理結束后，取出組織塊，打開包埋紙，用鑷子將細胞塊輕輕夾到包埋模具中間，行常規(guī)石蠟包埋，盡量使細胞都平鋪在模具底部，制成細胞蠟塊。

1.3.2 切片與烤片 將細胞富集蠟塊放入-28℃冰箱冷凍室中，持續(xù)冷藏放置10 min后進行常規(guī)切片，注意常規(guī)粗修時不要過度修片，切片厚度為3 μm，均切數(shù)張備用，置入80℃烤箱烤片15 min。

1.3.3 常規(guī)HE和免疫組化染色 二甲苯脫蠟，梯度乙醇至水化后，一張切片進行常規(guī)HE染色，其余切片根據(jù)需要不同而選擇不同的抗體進行免疫組化染色。按照一抗及二抗試劑要求，進行PowerVision二步染色法。經(jīng)過抗原熱修復、阻斷內源性過氧化物酶、一抗37℃孵育、二抗孵育、DAB顯色等步驟后行蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，櫻花薄膜膠帶封片，顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 HE染色結果 采用10%中性緩沖甲醛與95%乙醇固定的富集細胞塊，HE染色鮮艷，細胞輪廓清晰，細胞排列清楚可見，腫瘤細胞的核仁比較明顯，并且腫瘤細胞與周圍正常的間皮細胞對比明顯，背景干凈（圖1a）；薄層液基細胞學檢查指定保存液固定的細胞塊HE染色偏紅，細胞排列方式基本可見，細胞核保存欠佳，部分核有固縮現(xiàn)象（圖1b）；細胞蠟塊制作試劑盒固定的細胞塊細胞量偏少，HE染色細胞輪廓較模糊，細胞核有重疊現(xiàn)象（圖1c）。

圖1 HE染色所見（a：10%中性緩沖甲醛和95%乙醇聯(lián)合固定；b：薄層液基細胞學檢查指定保存液固定；c：細胞蠟塊制作試劑盒固定；×400）

2.2 免疫組化標記結果 實驗得出10%中性緩沖甲醛和95%乙醇聯(lián)合固定的細胞富集蠟塊的免疫抗體標志物表達效果最好，抗體標記清晰易判，背景干凈（圖2ab）；薄層液基細胞學檢查指定保存液固定、細胞蠟塊制作試劑盒固定的細胞蠟塊免疫標記染色效果均欠佳，抗體標記稍減弱（圖2c-f）。

圖2 免疫組化染色所見[a：10%中性緩沖甲醛和95%乙醇聯(lián)合固定細胞角蛋白（CK）表達定位準確，結果（+++）；b：10%中性緩沖甲醛和95%乙醇聯(lián)合固定鈣結合蛋白（CR）表達定位準確，結果（+++）；c：薄層液基細胞學檢查指定保存液固定CK表達定位準確，結果（+）；d：薄層液基細胞學檢查指定保存液固定CR表達定位準確，結果（+）；e：細胞蠟塊制作試劑盒固定CK表達定位準確，結果（+）；f：細胞蠟塊制作試劑盒固定CR表達定位準確，結果（+）；×400]

3 討論

發(fā)生在全身或胸腹腔內的惡性腫瘤和（或）惡性病變引起胸腔、腹腔的臟層和（或）壁層胸腹膜發(fā)生彌漫性病變，繼而導致體腔內液體異常增多的現(xiàn)象，被稱為惡性胸腹水，在臨床上較為常見[8-9]。目前對臨床送檢的體腔積液的檢測方式通常有以下幾種：第一，普通細胞涂片，操作簡單，報告時間短，是幾乎所有病理科都常規(guī)開展的項目，但與制片人員的技術水平密切相關，細胞取樣層選擇不當、涂片厚薄不均等均會影響病理診斷；第二，薄層液基細胞學制片術，尤其在樣本細胞量比較少的時候，可以通過此方法得到相對理想的高質量涂片，但試劑與儀器成本較高，在小型醫(yī)院開展的難度相對較大[10]；第三，細胞蠟塊技術，具有保存細胞新鮮、抗原保留完整等優(yōu)點，且可進行多次切片，用于原位雜交、免疫組化染色、分子檢測、藥物分析、臨床實驗等，可提高細胞學診斷的陽性率，也可幫助判斷細胞的來源、分型，有利于評估患者預后[11-12]。

近年來，已有多種細胞蠟塊的制作方法[5，13-15]，同時很多廠家也生產出了細胞蠟塊制作試劑盒，但關于分析不同固定方法對細胞蠟塊制作效果影響的文章較少。本研究對同一漿膜腔積液應用3種不同的固定方法進行細胞蠟塊的制作。首先，10%中性緩沖甲醛和95%乙醇聯(lián)合固定法，10%中性緩沖甲醛液為交聯(lián)劑，可以與蛋白質相互交聯(lián)而發(fā)生沉淀，從而較好地保持細胞的完整性，穿透性較好，使細胞收縮小，對大多數(shù)抗原物質保存較好，但存在細胞不易凝結成塊的缺點，而聯(lián)合使用95%乙醇剛好彌補了這一點，95%乙醇為脂溶性有機溶劑，可幫助細胞沉淀凝固成塊，便于細胞塊的制作。實驗得出此聯(lián)合固定法得到的細胞蠟塊HE染色鮮艷，能清楚地展現(xiàn)完整的細胞形態(tài)與結構，免疫組化標記較為容易判別。其次，薄層液基細胞學檢查指定保存液，是一種以乙醇為基礎的紅色固定劑，其主要成分可以溶解紅細胞并沉淀蛋白，并含有脂肪酸，實驗過程中發(fā)現(xiàn)此方法固定后細胞不易取樣包埋，而且所得的蠟塊HE染色中伊紅深染偏紅，部分細胞空泡化，部分核有固縮現(xiàn)象，免疫組化標記效果欠佳。分析原因是固定液中的脂肪酸被醇類變性，會影響蛋白質形成超聚集體，不利于包埋等操作，并且可能影響后續(xù)的染色。最后，細胞蠟塊制作試劑盒，試劑A的作用是迅速殺死細胞，使其固定，試劑B與樣本混合后成半流體狀，脫水后呈沙粒狀。實驗結果顯示此方法得到的細胞塊細胞量偏少，HE染色細胞輪廓不清，部分細胞核重疊比較嚴重，免疫組化標記效果欠佳。并且從成本角度考慮，薄層液基細胞學檢查指定保存液和細胞蠟塊制作試劑盒成本較高，而10%中性甲醛與95%乙醇是普通及價廉的試劑，相對而言，前兩者檢查費用昂貴，患者經(jīng)濟壓力較重，在許多小型醫(yī)院無法開展，后者更容易開展。

綜上所述，本文應用3種不同固定方法對同一體腔積液制作細胞富集塊時進行固定處理，通過觀察3者細胞蠟塊HE染色和免疫標記定位效果的差異，得出10%中性緩沖甲醛和95%乙醇聯(lián)合固定效果比較滿意，且對抗原的影響較小，因此該法值得廣為推薦。