於鵬飛 柴佳園 李俊峰 王康 劉文洪

結(jié)核病作為由結(jié)核分枝桿菌感染導(dǎo)致的傳染性疾病，對(duì)人類的生命健康造成了巨大威脅[1]，目前中國(guó)結(jié)核病防治形勢(shì)同樣嚴(yán)峻[2]。異煙肼和利福平是治療結(jié)核病的一線藥物，兩者聯(lián)用效果更佳，但兩者聯(lián)用會(huì)導(dǎo)致肝損傷[3-4]。因此，急需尋求一種藥物在治療肺結(jié)核的同時(shí)能有效降低異煙阱和利福平一線抗結(jié)核藥物導(dǎo)致的肝損傷。青藤堿提取自中藥青藤，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、免疫抗炎等功能。研究表明，青藤堿能對(duì)人體肝臟星狀細(xì)胞的增殖和凋亡產(chǎn)生調(diào)控作用[5]，能夠治療刀豆蛋白A（concanavalin A，Con A）導(dǎo)致的免疫性肝損傷[6]等。本研究探討青藤堿對(duì)異煙肼和利福平聯(lián)用致小鼠肝臟損傷的保護(hù)作用，從而為開發(fā)和尋找保護(hù)肝損傷藥物提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3～8周雄性清潔級(jí)ICR小鼠60只，體重18～22 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙江）2015-0009，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心喂養(yǎng)。動(dòng)物房環(huán)境：溫度（23±3）℃，濕度50%～70%，12 h晝夜循環(huán)。小鼠自由飲水及進(jìn)食。

1.2 藥品、試劑與儀器 青藤堿 [CAS號(hào)：115-53-7，純度：高效液相色譜（HPLC）≥98%，批號(hào)：Dasf200329]購(gòu)自南京道斯夫生物科技有限公司；異煙肼（規(guī)格：100 mg，批號(hào)：T20C081）購(gòu)自杭州民生藥業(yè)有限公司；利福平（規(guī)格：0.15 g，批號(hào)：1908021）購(gòu)自沈陽(yáng)紅旗制藥有限公司；聯(lián)苯雙酯（規(guī)格：1.5 mg，批號(hào)：A02J191005）購(gòu)自萬(wàn)邦德制藥集團(tuán)股份有限公司；AST試劑盒（批號(hào)：20200713）、ALT 試劑盒（批號(hào)：20200712）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號(hào)：20200715）、TG 試劑盒（批：20200712）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒（批號(hào)：20200710）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號(hào)：20200713）、考馬斯藍(lán)蛋白試劑盒（批號(hào)：20200712）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；高速離心機(jī)（型號(hào)：FC5718）購(gòu)自上海安亭儀器有限公司；電子天平（型號(hào)：JA2003N）購(gòu)自上海菁華科技儀器有限公司；光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：DM300）、石蠟切片機(jī)（型號(hào)：RM2265）均購(gòu)自德國(guó)徠卡公司。

1.3 分組造模和給藥 采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只小鼠分為正常對(duì)照組、模型組、青藤堿低劑量組、青藤堿中劑量組、青藤堿高劑量組和聯(lián)苯雙酯組6組，每組10只。除正常對(duì)照組外，其余各組給予異煙肼（100 mg/kg，溶于20 ml 0.9%氯化鈉注射液）和利福平（100 mg/kg，溶于20 ml 0.9%氯化鈉注射液）灌胃建立肝損傷小鼠病理模型[7]；正常對(duì)照組給予20 ml 0.9%氯化鈉注射液灌胃。造模2 h后，正常對(duì)照組和模型組分別給予蒸餾水（20 ml/kg）灌胃，青藤堿低、中、高劑量組分別給予青藤堿 50、100、150 mg/kg（均溶于 4 ml蒸餾水）灌胃，聯(lián)苯雙酯組給予聯(lián)苯雙酯（200 mg/kg，溶于4 ml蒸餾水）灌胃，各組均連續(xù)給藥，1次/d，連續(xù)10 d。

1.4 檢測(cè)材料收集與處理 所有動(dòng)物末次灌胃后禁水禁食24 h，稱體質(zhì)量。壓迫小鼠頸部?jī)蓚?cè)，使眶后靜脈叢充血，持玻璃毛細(xì)血管從小鼠左側(cè)內(nèi)眥部刺入取血。脊椎脫臼法處死，開腹、取肝臟，清洗干凈、擦干、稱肝質(zhì)量。肝臟指數(shù)=肝質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。切大約 0.5 g肝右葉制備肝勻漿，在0.9%氯化鈉溶液中漂洗干凈，剝除表面附著的結(jié)締組織并用濾紙拭干，用移液管量取9倍于肝臟體積的0.9%氯化鈉溶液預(yù)冷，在冰水浴中用眼科小剪盡快剪碎組織塊并利用組織勻漿機(jī)勻漿，3 000 rpm離心10 min，取上清液，待測(cè)。

1.5 生化指標(biāo)檢測(cè) 采用比色法測(cè)定血清ALT、AST、TG水平以及肝勻漿中MDA含量、SOD活性及GSH含量。嚴(yán)格遵照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。

1.6 肝組織形態(tài)學(xué)變化觀察 從肝左外葉中取材，10%甲醛固定后，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯處理后，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察肝組織形態(tài)學(xué)變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，方差齊時(shí)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。偏態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肝臟指數(shù)比較 與模型組比較，青藤堿中、高劑量組和聯(lián)苯雙酯組肝臟指數(shù)均下降（均P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠肝臟指數(shù)比較

2.2 各組小鼠血清ALT、AST、TG水平比較 與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清ALT和AST水平均升高（均P＜0.01）。與模型組比較，青藤堿高劑量組和聯(lián)苯雙酯組小鼠血清 ALT、AST、TG 水平均降低（均 P＜0.05），青藤堿中劑量組小鼠血清AST、TG水平均降低（均P＜0.05），見表 2。

表2 各組小鼠血清ALT、AST、TG水平比較

2.3 各組小鼠肝勻漿SOD活性及GSH、MDA水平比較與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠肝勻漿中SOD水平降低（P＜0.01）。與模型組比較，青藤堿高劑量組小鼠肝勻漿中SOD活性升高（P＜0.01）；青藤堿中、高劑量組小鼠肝勻漿中GSH水平均升高（均P＜0.01）；青藤堿低、中、高各劑量組小鼠肝勻漿中MDA水平均降低（均P＜0.01），見表 3。

表3 各組小鼠肝勻漿SOD活性及GSH、MDA水平比較

2.4 各組小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)變化比較 肉眼觀察：正常對(duì)照組小鼠肝顏色為紅褐色，大小形態(tài)正常，質(zhì)地柔軟、光滑；模型組小鼠肝損傷體積變大，色澤暗黃，肝緣圓鈍；青藤堿各劑量組和聯(lián)苯雙酯組小鼠肝有輕微的水腫表現(xiàn)，質(zhì)地柔軟，色澤紅褐。光鏡下觀察：正常對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝索排列規(guī)則，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，界限清晰，以中央靜脈為中心，肝臟細(xì)胞排列呈放射狀，肝細(xì)胞核大且圓，分布均勻；模型組小鼠肝組織損傷嚴(yán)重，肝索排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)不清，界限模糊，肝組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；青藤堿各劑量組肝小葉結(jié)構(gòu)接近正常，肝細(xì)胞排列較為整齊，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肝損傷程度隨著青藤堿劑量的增加而減輕，較模型組有所改善；聯(lián)苯雙酯組小鼠可見肝細(xì)胞輕度破壞，較模型組肝小葉結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)得到改善，炎癥細(xì)胞量有所下降（圖1，見插頁(yè)）。

圖1 各組小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察所見（a：正常對(duì)照組；b：模型組；c：聯(lián)苯雙酯組；d：青藤堿低劑量組；e：青藤堿中劑量組；f：青藤堿高劑量組；HE染色，×200）

3 討論

近年來(lái)關(guān)于青藤堿的研究表明其在肝損傷領(lǐng)域具有一定的治療效果。朱昱豪等[8]研究發(fā)現(xiàn)青藤堿能夠減弱Con A導(dǎo)致的免疫性肝損傷，減輕肝臟受損狀況并且降低血清中ALT、AST水平。郭華等[9]研究發(fā)現(xiàn)青藤堿能減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)并且對(duì)炎癥反應(yīng)具有療效。尹曉剛等[10]研究發(fā)現(xiàn)青藤堿具有抑制大鼠過(guò)氧化物和抗脂質(zhì)過(guò)氧化的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇青藤堿作為一種可能的肝損傷治療藥物進(jìn)行研究。

長(zhǎng)期大量使用異煙肼和利福平治療結(jié)核病會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的藥物不良反應(yīng)，尤其會(huì)引起使用者藥物性肝臟損傷[11-12]。韓悅等[13]利用HE染色研究異煙肼與利福平聯(lián)用之后肝組織形態(tài)，發(fā)現(xiàn)藥物性肝損傷后肝細(xì)胞病變顯著，隨著抗損傷藥物使用劑量的增加，這種損傷明顯減輕，同時(shí)肝臟指數(shù)也得到改善。本研究顯示，模型組小鼠肝組織中有大量炎性細(xì)胞，隨著青藤堿劑量的增加，肝臟細(xì)胞的病變逐漸減輕，炎癥反應(yīng)得到緩解，同時(shí)青藤堿能夠使小鼠肝臟指數(shù)下降。王翠榮等[14]研究發(fā)現(xiàn)異煙肼與利福平聯(lián)用會(huì)導(dǎo)致肝臟損傷小鼠上層血清液中ALT、AST水平升高，而ALT與AST是檢驗(yàn)肝臟組織損害常用的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠ALT及AST水平較高，青藤堿給藥后ALT及AST水平降低，同時(shí)隨劑量增加而降低。王翠榮等[14]研究還發(fā)現(xiàn)肝受損小鼠肝臟勻漿SOD與谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）水平降低，MDA水平升高。金華等[15]研究發(fā)現(xiàn)肝臟急性受損小鼠可能與其體內(nèi)氧自由基作用和肝組織細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)度氧化反應(yīng)被抑制有關(guān)。MDA水平可以提示肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)度氧化度，GSH與氧自由基清除有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，青藤堿給藥后肝勻漿中SOD活性與GSH水平升高，MDA水平降低，可能與青藤堿能夠使氧自由基減少與抑制脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)。

綜上所述，青藤堿能夠保護(hù)異煙肼和利福平聯(lián)用而導(dǎo)致的小鼠肝損傷，但青藤堿對(duì)慢性藥物性肝炎的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。