杜菊梅，阮 俊，宋 媛，陳 琴，易和平，王鳳洋

(1.宜昌市優(yōu)撫醫(yī)院精神科，湖北 宜昌 443005；2.三峽大學(xué)第二人民醫(yī)院心理科，湖北 宜昌 443005；3.宜昌市中心人民醫(yī)院感染科，湖北 宜昌 443005；4.武漢科技大學(xué)附屬醫(yī)院精神科，湖北 武漢 430000)

抑郁癥是一類嚴(yán)重的精神疾病，主要表現(xiàn)為患者長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)的情緒低落，已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)的一種常見病，影響了大約3.5億人[1-2]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的預(yù)測(cè)，抑郁癥的發(fā)病率每年約增加113%，將成為世界第二大疾病[3]。研究表明，先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)與神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)回路相互作用，可影響抑郁癥的發(fā)生[4-5]。許多臨床報(bào)告表明，與正常受試者相比，抑郁癥受試者存在較高濃度的促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)[6-7]。因此，控制神經(jīng)炎癥，恢復(fù)神經(jīng)營養(yǎng)蛋白和神經(jīng)遞質(zhì)的功能可成為抗抑郁治療的新方向。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)在多種免疫細(xì)胞中廣泛表達(dá)，并作為重要的信號(hào)分子參與NF-κB和MAPK等炎癥途徑的激活[8]。研究表明，miRNA-194可通過靶向TRAF6抑制脂多糖誘導(dǎo)的椎間盤髓核細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)[9]。本研究通過檢測(cè)慢性不可預(yù)知性輕度應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress ，CUMS)海馬中神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)營養(yǎng)因子和炎性因子的變化，研究敲低TRAF6對(duì)抑郁大鼠的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

健康SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，5～6周齡，體質(zhì)量為(180±20)g，購自海軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)2021-0003。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在溫度(24±2)℃、濕度50%左右的12 h/12 h光—暗環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。TRIzol試劑購自中國賽默飛世爾公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-6，IL-10)、TNF-α、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自美國R&D公司，5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、5-羥吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA)ELISA試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所有限公司，RIPA裂解緩沖液、蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒購自北京索萊寶公司，BCA試劑盒購自上海碧云天公司，GAPDH、Bax、Bcl-2、Caspase3一抗購自英國Abcam公司，TRAF6、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(glutamate transporter-1，GLT-1)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)抗體及辣根酶標(biāo)記二抗購自北京博奧森公司，ECL發(fā)光液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)購自上海密理博公司，血脂生化檢測(cè)試劑盒購自上海透景診斷科技有限公司，TUNEL試劑盒購自美國Sigma公司，Nanodrop 2000購自美國賽默飛世爾公司。

1.2 CUMS抑郁大鼠模型構(gòu)建

將40只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組(CUMS組)、CUMS+shRNA-NC組、CUMS+TRAF6-shRNA組，每組10只。對(duì)照組每籠2只飼養(yǎng)，正常飲食飲水；其他3組每籠1只飼養(yǎng)，35 d內(nèi)隨機(jī)接受以下刺激：傾斜45° 24 h；4 ℃冰水游泳5 min；禁食禁水24 h；夾尾2 min；潮濕墊料24 h；擁擠24 h(每籠10只)；束縛應(yīng)激6 h。每天接受其中1種應(yīng)激源，連續(xù)2 d不重復(fù)相同刺激。通過大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)時(shí)間及生化指標(biāo)(神經(jīng)遞質(zhì)水平)判斷模型是否成功建立。

1.3 立體定向注射

CUMS刺激5周后，CUMS+shRNA-NC組、CUMS+TRAF6-shRNA組大鼠分別注射慢病毒包被的shRNA-NC和TRAF6-shRNA序列(上海吉瑪基因)。用10%水合氯醛(250 mg/kg)腹腔麻醉大鼠，然后置于立體定向框架內(nèi)。根據(jù)Shen等[10]的研究方法，將純化的高滴度shRNA-NC和TRAF6-shRNA慢病毒包裝溶液以1 μL/min的注射速率在囪前后4.8 mm，中外側(cè)±2.5 mm，背腹側(cè)-3.5 mm處鉆孔注射慢病毒包裝溶液，注射完畢后針在注射部位保持5 min防止返流,所有大鼠術(shù)后繼續(xù)觀察飼養(yǎng)5 d。

1.4 血漿和海馬組織樣本收集

1.3項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)完成后，大鼠禁食12 h，隨后用10%水合氯醛(250 mg/kg)對(duì)各組大鼠實(shí)施安樂死。從腹主動(dòng)脈采集血液，分離血清，于-80 ℃儲(chǔ)存，用于檢測(cè)生化指標(biāo)和炎性因子含量(每組保存8份樣品)。將大腦組織迅速取出，置于冰上，分離海馬區(qū)組織，每組分別取5只大鼠的海馬組織保存于4%多聚甲醛溶液，用于病理研究，另5只大鼠的海馬組織用液氮快速冷凍后于-80 ℃保存，用于檢測(cè)基因的表達(dá)。

1.5 RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mRNA表達(dá)

使用TRIzol試劑提取海馬組織總RNA，用Nanodrop 2000測(cè)定RNA的純度和濃度。取等質(zhì)量的總RNA作為模板，根據(jù)說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。通過2-ΔΔct法計(jì)算基因表達(dá)水平，以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參。引物序列如下：TRAF6上游引物5’-TCATAATGTTAACCTCTCTT-3’，下游引物5’-TGTCTTACTAGGCGCCCCTC-3’；β-actin上游引物5’-GCCTCCCGCGCGCGCACTAG-3’，下游引物5’-AAAGGCAAACGCTGGCCCGG-3’。

1.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

使用RIPA裂解緩沖液提取海馬組織總蛋白，用Nanodrop 2000測(cè)量蛋白濃度并調(diào)平，用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜用含有5%脫脂牛奶的TBST緩沖液封閉1 h，然后與一抗(TRAF6 1∶1 000，GLT-1 1∶1 000，BDNF 1∶1 000，Bax 1∶1 000，Bcl-2 1∶1 000，Caspase3 1∶1 000和GAPDH 1∶1 000)于4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次，并與HRP偶聯(lián)的二抗IgG (1∶3 000) 于37 °C孵育2 h。使用ECL曝光成像并用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.7 ELISA實(shí)驗(yàn)

按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-6、IL-10、iNOS和血清神經(jīng)遞質(zhì)5-HT和5-HIAA的含量。

1.8 血脂生化檢測(cè)

按血脂生化試劑盒說明書酶法測(cè)定大鼠血清中總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterin，HDL-c)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterin，LDL-c)水平。

1.9 HE染色觀察海馬神經(jīng)元病理變化

將大腦海馬區(qū)組織用4%多聚甲醛溶液固定后，常規(guī)脫水制成石蠟切片，然后脫蠟、HE染色、1%鹽酸酒精分化、0.6%氨水返藍(lán)、0.5%伊紅液染色，接著常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，在400倍顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞損傷情況。

1.10 TUNEL染色海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況

將石蠟切片脫蠟，按照TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒的操作進(jìn)行染色，封片后使用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 shRNA敲低TRAF6效率驗(yàn)證

與對(duì)照組比較，CUMS組大鼠海馬區(qū)TRAF6 mRNA和蛋白表達(dá)水平較高(P<0.05)；與CUMS組比較，CUMS+TRAF6-shRNA組大鼠海馬區(qū)TRAF6 mRNA和蛋白表達(dá)水平較低(P<0.05)；CUMS+shRNA-NC組與CUMS組比較則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示TRAF6-shRNA干擾成功(圖1)。

2.2 敲低TRAF6對(duì)CUMS大鼠海馬區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組比較，CUMS組大鼠海馬區(qū)GLT-1和BDNF表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，血清中5-HT和5-HIAA水平明顯較低(P<0.05)；與CUMS組比較，CUMS+TRAF6-shRNA組大鼠海馬區(qū)GLT-1和BDNF表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，血清中5-HT和5-HIAA水平明顯較高(P<0.05)；CUMS+shRNA-NC組與CUMS組各指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2、表1。

表1 ELISA檢測(cè)大鼠血清中5-HT和5-HIAA的水平

2.3 敲低TRAF6對(duì)CUMS大鼠血清脂代謝的影響

與對(duì)照組比較，CUMS組大鼠海馬區(qū)TC、TG和LDL-c水平明顯較高(P<0.05)，HDL-c水平明顯較低(P<0.05)；與CUMS組比較，CUMS+TRAF6-shRNA組TC、TG和LDL-c水平明顯較低(P<0.05)，HDL-c水平明顯較高(P<0.05)；CUMS+shRNA-NC組與CUMS組各指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.4 敲低TRAF6對(duì)CUMS大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響

對(duì)照組正常海馬神經(jīng)元呈圓形，結(jié)構(gòu)清晰完整，排列良好；CUMS組海馬神經(jīng)元核固縮，染色加深，呈不規(guī)則、多邊形和梭形，且神經(jīng)元數(shù)量減少，排列松散。與CUMS組比較，CUMS+TRAF6-shRNA組大部分神經(jīng)元完整，很少有核固縮；CUMS+shRNA-NC組神經(jīng)元形態(tài)與數(shù)量與CUMS組相似(圖3)。

2.5 敲低TRAF6對(duì)CUMS大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組比較，CUMS組細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著較多(P<0.05)，Bax/Bcl-2及cleaved Caspase3/Caspase3比值明顯上調(diào)(P<0.05)；與CUMS組比較，CUMS+TRAF6-shRNA組細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯較少(P<0.05)，Bax/Bcl-2及cleaved Caspase3/Caspase3比值顯著下調(diào)(P<0.05)；CUMS+shRNA-NC組與CUMS組細(xì)胞凋亡數(shù)目、Bax/Bcl-2、cleaved Caspase3/Caspase3比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

表2 大鼠血清TC、TG、LDL-c和HDL-c的水平

a:對(duì)照組；b：CUMS組；c：CUMS+shRNA-NC組；d:CUMS+TRAF6-shRNA組

a：TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡(×400)；b：Western blot檢測(cè)凋亡蛋白的表達(dá)；c:Bax/Bcl-2和cleaved Caspase3/Caspase3蛋白比值

2.6 敲低TRAF6對(duì)CUMS大鼠血清中炎性因子表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，CUMS組血清中TNF-α、iNOS、IL-6和IL-10的水平均明顯上調(diào)(P<0.05)；與CUMS組比較，CUMS+TRAF6-shRNA組中TNF-α、iNOS和IL-6水平下調(diào)(P<0.05)，IL-10水平上調(diào)(P<0.05)；CUMS+shRNA-NC組與CUMS組炎性因子水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 大鼠血清中炎性因子表達(dá)水平

3 討論

CUMS誘導(dǎo)的大鼠抑郁模型模擬了多種慢性生活壓力引發(fā)的抑郁癥，已被廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)藥物的抗抑郁作用[11]。單胺類氧化酶抑制劑可通過抑制突觸間隙中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的降低，防止單胺類缺乏導(dǎo)致抑郁發(fā)生[12]。其中，5-HT活性降低被認(rèn)為與重度抑郁癥的發(fā)展有關(guān)[13]。但有證據(jù)表明缺乏神經(jīng)營養(yǎng)因子是抑郁癥的另一個(gè)發(fā)病機(jī)制，BDNF是介導(dǎo)中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元可塑性、遷移和存活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，抑郁患者的BDNF水平異常低[14-16]。此外，谷氨酸過量也與重度抑郁癥的發(fā)生有關(guān)，GLT-1可降低突觸間隙谷氨酸水平，避免過高濃度的谷氨酸對(duì)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的興奮毒性作用[17]。本研究通過CUMS構(gòu)建大鼠抑郁模型，結(jié)果顯示，CUMS組大鼠血清中GLT-1、BDNF、5-HT及其代謝產(chǎn)物5-HIAA的表達(dá)水平均顯著下調(diào)，表明大鼠抑郁模型構(gòu)建成功；敲低TRAF6可顯著上調(diào)CUMS大鼠海馬區(qū)BDNF、GLT1蛋白及血清中5-HT和5-HIAA的表達(dá)水平，提示敲低TRAF6可促進(jìn)抑郁大鼠血清中低水平的神經(jīng)遞質(zhì)恢復(fù)。

臨床研究表明，抑郁癥患者更易出現(xiàn)血脂代謝紊亂的狀況，即TG、TC、LDL-c含量偏高和HDL-c含量偏低[18-19]。本研究結(jié)果顯示，CUMS組大鼠血清中TG、TC和LDL-c含量顯著高于對(duì)照組，HDL-c含量顯著低于對(duì)照組；CUMS+TRAF6-shRNA組大鼠血清中TG、TC和LDL-c含量明顯低于CUMS組，HDL-c含量明顯高于CUMS組，提示敲低TRAF6的表達(dá)可使CUMS引起的大鼠血清參數(shù)紊亂恢復(fù)正常。

海馬體是大腦對(duì)壓力反應(yīng)最脆弱的區(qū)域之一，事實(shí)上，慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的海馬結(jié)構(gòu)重塑和功能損傷(包括突觸可塑性改變、神經(jīng)發(fā)生減少、樹突狀萎縮增加和神經(jīng)元凋亡增加)都與抑郁癥和認(rèn)知缺陷有關(guān)[20]。本研究觀察到CUMS組大鼠海馬神經(jīng)元核固縮，染色加深，呈不規(guī)則、多邊形和梭形，且神經(jīng)元數(shù)量減少，排列松散；海馬區(qū)細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著增加，Bax/Bcl-2及cleaved Caspase3/Caspase3比值明顯上調(diào)；與CUMS組相比，CUMS+TRAF6-shRNA組大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰完整，排列良好，很少有核固縮，而且細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著減少，Bax/Bcl-2和cleaved Caspase3/Caspase3比值表達(dá)明顯下調(diào)。由此推測(cè)，敲低TRAF6可逆轉(zhuǎn)抑郁引起的海馬損傷及細(xì)胞凋亡。

研究已證實(shí)炎性因子的過度分泌與下丘腦—垂體—腎上腺軸功能障礙有關(guān)，并直接誘導(dǎo)糖皮質(zhì)激素分泌，這種反應(yīng)與抑郁癥的發(fā)生有關(guān)[21]。炎癥因子分為促炎癥因子和抑炎癥因子，促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β在抑郁患者和抑郁動(dòng)物模型的血清、腦脊液和海馬中表達(dá)增加，會(huì)負(fù)反饋調(diào)節(jié)抑炎癥因子IL-10，使其表達(dá)降低，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[22-23]。本研究結(jié)果表明CUMS可誘導(dǎo)促炎癥因子TNF-α、iNOS、IL-6的表達(dá)升高。敲低TRAF6能下調(diào)CUMS大鼠促炎性因子TNF-α、iNOS和IL-6的表達(dá),同時(shí)促進(jìn)大鼠機(jī)體的自我免疫調(diào)節(jié)抑制炎癥反應(yīng)，從而使得IL-10的表達(dá)也升高。由于本研究檢測(cè)時(shí)間與大鼠敲低TRAF6發(fā)生炎癥較為接近，大鼠機(jī)體免疫尚未完全控制炎癥，因此大鼠體內(nèi)的抗炎因子表達(dá)也顯著升高。

綜上所述，在CUMS大鼠中，敲減TRAF6的表達(dá)具有較好的抗抑郁作用，可減輕海馬神經(jīng)元損傷，恢復(fù)神經(jīng)遞質(zhì)和血脂代謝的正常水平，抑制神經(jīng)元凋亡和神經(jīng)炎癥反應(yīng)。