李曉君，江 娟，馮紅剛，馮 麗，江 明

(1.襄陽市第一人民醫(yī)院/湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院健康體檢科，湖北 襄陽 441002；2.襄陽市中心醫(yī)院/湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院心胸外科，湖北 襄陽 441002；3.武漢科技大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，湖北 武漢 430064)

肺癌是世界上常見的致命性惡性腫瘤之一。每年新發(fā)病例超過20萬，死亡率非常高[1]。大多數(shù)肺癌是非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其特征是發(fā)展迅速、轉(zhuǎn)移風(fēng)險高以及對治療的抵抗力強(qiáng)[2]。盡管臨床在外科切除、化學(xué)療法和放射療法方面已經(jīng)取得了持續(xù)的進(jìn)展，但晚期NSCLC患者的5年生存率僅為5%～20%，這與高復(fù)發(fā)和高轉(zhuǎn)移有關(guān)[3]。癌細(xì)胞的常見代謝特征是有氧糖酵解，即使在富氧條件下，癌細(xì)胞也傾向于通過糖酵解而不是氧化磷酸化來消耗更多的葡萄糖以產(chǎn)生乳酸，這種現(xiàn)象會很大程度上加速腫瘤生長[4]。因此，腫瘤糖酵解被認(rèn)為是癌癥治療的潛在靶標(biāo)。microRNA(miRNA)是內(nèi)源的非編碼RNA，大約有22個核苷酸。miRNA通過與mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’-UTR)結(jié)合來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而抑制mRNA切割的翻譯或誘導(dǎo)。miRNA參與細(xì)胞分化、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)[5]。已有研究表明，miR-100-5p在多種癌癥細(xì)胞中異常表達(dá)，在口腔鱗狀細(xì)胞癌[6]、前列腺癌[7]等腫瘤中具有促進(jìn)癌細(xì)胞增殖的作用，在胃癌[8]、脊索瘤[9]等腫瘤中具有抑制癌細(xì)胞增殖的作用。低miR-100可能是NSCLC患者的不良預(yù)后因素，其通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)PLK1的表達(dá)抑制NSCLC的生長[10]，但是miR-100-5p對NSCLC細(xì)胞遷移、侵襲和糖酵解的影響尚不清楚，因此，本研究主要探究miR-100-5p對NSCLC細(xì)胞遷移、侵襲和糖酵解的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器 miR-NC、miR-100-5p mimic、miR-100-5p inhibitor、pc-NC、pc-FGFR3質(zhì)粒和實驗所用各種引物由北京奧科生物科技有限公司設(shè)計并合成，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自上海少辛生物科技有限公司(批號：11668-019)，RPMI-1640培養(yǎng)基購自上海慧穎生物科技有限公司(批號：C11875500BT)，胎牛血清購自北京百奧萊博科技有限公司(批號：QS071)，青霉素和鏈霉素雙抗溶液購自北京沃比森科技有限公司(批號：C0160-611)，miRcute miRNA分離試劑盒和miRcute miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒購自北京天根生物科技有限公司(批號：DP501、KR201)，SYBR-Green PCR試劑盒購自嘉興藍(lán)諾盛生物科技有限公司(批號：RT0411-03)，Transwell小室購自北京明陽科華生物科技有限公司(批號：254480)，葡萄糖攝取比色測定試劑盒和乳酸測定試劑盒Ⅱ購自廣州偉伯生物科技有限公司(批號：3091336、3104233)，ATP比色測定試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司(批號：K354-100)，BCA試劑盒購自西安浩特生物科技有限公司(批號：WB027)，Seahorse XF糖酵解應(yīng)激測試試劑盒和Seahorse XF細(xì)胞線粒體應(yīng)激測試試劑盒購自美國Seahorse公司(批號：103325-100、103275-100)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗、FGFR3兔來源的單克隆抗體購自上海艾博抗生物科技有限公司(批號：ab36151、ab180906)，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京威格斯生物技術(shù)有限公司(批號：T002)，F(xiàn)luorChem HD2凝膠成像系統(tǒng)購自美國Proteinsimple公司，Seahorse XF-96分析儀購自美國Seahorse公司，ThermoFisherbrand數(shù)碼生物顯微鏡購自上海睿安生物科技有限公司。

1.1.2 組織樣品 收集襄陽市第一人民醫(yī)院2016年1月至2018年12月經(jīng)病理確診的NSCLC患者手術(shù)切除的癌組織和癌旁組織60對，其中男47例，女13例，年齡3～78歲，中位年齡為57歲?；颊呤中g(shù)前均未接受放療、化療及其他輔助治療。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.1.3 細(xì)胞及培養(yǎng) 正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B和NSCLC細(xì)胞系(H1703、A549、H1299、L78、PGCL3、H1650)均購自上海素冉生物科技有限公司。在37℃、5%CO2條件下，所有細(xì)胞于含10%胎牛血清、100 U/mL的青霉素和鏈霉素雙抗溶液的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR檢測miR-100-5p的表達(dá) 采用miRcute miRNA分離試劑盒從研磨的NSCLC組織或培養(yǎng)的正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B和NSCLC細(xì)胞系(H1703、A549、H1299、L78、PGCL3、H1650)中提取總RNA，并通過miRcute miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒將靶miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，通過SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行RT-qPCR，并在CFX96系統(tǒng)測定miRNA的表達(dá)水平。miR-100-5p的循環(huán)條件為：96 ℃、10 s，55 ℃、10 s，72 ℃、90 s，35個循環(huán)，用U6標(biāo)準(zhǔn)化，使用2-ΔΔc t方法計算。miR-100-5p上游引物：5’-ATCATTAAACCCGTAGATCCGAA-3’；下游引物：5’-AATGGTTGTTCTCCACACTCTCTC-3’。U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；U6下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)期NSCLC H1650細(xì)胞接種于12孔板(1×106/孔)，達(dá)到85%融合時，根據(jù)Lipofectamine 2000說明書將miR-NC、miR-100-5p mimic、miR-100-5p inhibitor、pc-NC、pc-FGFR3質(zhì)粒分別或聯(lián)合轉(zhuǎn)染入H1650細(xì)胞，分為：對照組、miR-NC組、miR-100-5p mimic組、miR-100-5p inhibitor組、miR-100-5p mimic+pc-NC組、miR-100-5p mimic+pc-FGFR3組。

1.2.3 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移 將按1.2.2項轉(zhuǎn)染后的NSCLC H1650細(xì)胞接種于12孔板(1×106/孔)，鋪滿單層后，用小號槍頭垂直在孔中間劃痕，然后用PBS清洗2次。在CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37 ℃恒溫的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，使用Image J評估細(xì)胞遷移能力。于劃痕0 h和24 h拍攝圖像，劃痕閉合率=(0 h時的劃痕面積-24 h時的劃痕面積)/0 h的劃痕面積×100%。

1.2.4 Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲 在基底膠包埋的Transwell小室上室接種按1.2.2項下轉(zhuǎn)染后的NSCLC H1650懸浮液和不含血清的培養(yǎng)基，并在Transwell小室下室加入含血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，侵襲細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，0.5%結(jié)晶紫染色30 min，并在顯微鏡下觀察分析。

1.2.5 細(xì)胞葡萄糖攝取、乳酸生成和ATP含量檢測 分別按照葡萄糖攝取比色測定試劑盒、乳酸測定試劑盒Ⅱ和ATP比色測定試劑盒說明書檢測細(xì)胞葡萄糖攝取、乳酸生成和ATP含量。對于葡萄糖攝取比色法，將細(xì)胞以每孔1 500個的密度接種于96孔板中。通過用含2% BSA的100 mL KRPH緩沖液預(yù)孵育40 min，使細(xì)胞處于葡萄糖饑餓狀態(tài)，隨后加入10 mL 10 mmol/L 2-DG孵育細(xì)胞20 min。對于乳酸和ATP測定，收集1×106細(xì)胞于100 mL相應(yīng)試劑盒提供的檢測緩沖液中勻漿，離心樣品，測定可溶性組分含量。

1.2.6 細(xì)胞外酸化率(extracellular acidification rate，ECAR)和細(xì)胞耗氧率(cellular oxygen consumption rate，OCR)檢測 根據(jù)試劑盒說明書，使用Seahorse XF 96細(xì)胞外通量分析儀確定細(xì)胞ECAR和OCR。以1×104/L將細(xì)胞接種到Seahorse XF 96細(xì)胞培養(yǎng)微孔板中。在進(jìn)行基線測量后，對于ECAR，在指定的時間點(diǎn)依次將葡萄糖、氧化磷酸化抑制劑寡霉素和糖酵解抑制劑2-DG分別注入每個孔中；對于OCR，依次注射寡霉素、可逆性氧化磷酸化抑制劑對三氟甲氧羰基氰化物苯腙(p-trifluoromethoxycarbonyl cyanide phenylhydrazone，F(xiàn)CCP)和線粒體復(fù)合物Ⅰ抑制劑魚藤酮加線粒體復(fù)合物Ⅲ抑制劑抗霉素A(Rote/AA)。數(shù)據(jù)通過Seahorse XF-96 Wave軟件進(jìn)行評估。OCR以pmols/min顯示，ECAR以mpH/min顯示。

1.2.7 雙熒光素酶實驗檢測靶向關(guān)系 收集生長至對數(shù)期的H1650細(xì)胞，接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h。然后將1 mg PGL3- FGFR3-WT(FGFR3野生型)或PGL3- FGFR3-MUT(FGFR3突變型)以及miR-NC或miR-100-5p mimic和PRL-CMV質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入H1650細(xì)胞，分為miR-NC組、miR-100-5p mimic組、pc-NC組、pc-FGFR3組。轉(zhuǎn)染48 h后，裂解H1650細(xì)胞15 min，采用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)測量熒光素酶的相對活性。

1.2.8 蛋白印跡法檢測FGFR3蛋白表達(dá)水平 收集按1.2.2項轉(zhuǎn)染后的NSCLC H1650細(xì)胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，然后用BCA試劑盒定量蛋白的濃度。將蛋白樣品用SDS-PAGE分離后，再用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜，室溫下于脫脂牛奶中封閉蛋白2 h。隨后加入對應(yīng)的兔來源的單克隆一抗(FGFR3 1∶800、GAPDH 1∶1 000)，4 ℃封閉過夜。然后，加入對應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔單克隆二抗(1∶2 000)室溫封閉1 h，最后滴電化學(xué)反應(yīng)液曝光。以GAPDH為內(nèi)參，使用軟件Image-Pro plus 6.0分析蛋白條帶灰度，蛋白相對表達(dá)量=目標(biāo)蛋白吸光度值/內(nèi)參蛋白GAPDH吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 NSCLC miR-100-5p表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

在NSCLC中，miR-100-5p表達(dá)與性別、年齡和病理類型無關(guān)(P>0.05)，而與吸煙史、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度有關(guān)(P<0.05)，見表1。

表1 NSCLC患者的miR-100-5p表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

2.2 miR-100-5p mRNA在NSCLC組織和細(xì)胞中低表達(dá)

與癌旁組織相比，NSCLC組織中miR-100-5p mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，見圖1a；與正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B相比，NSCLC細(xì)胞系H1703、A549、H1299、L78、PGCL3、H1650中miR-100-5p mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，見圖1b，選取H1650細(xì)胞做后續(xù)實驗。與對照組相比，miR-NC組H1650細(xì)胞中miR-100-5p mRNA表達(dá)無明顯變化，miR-100-5p mimic組H1650細(xì)胞中miR-100-5p mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，miR-100-5p inhibitor組H1650細(xì)胞中miR-100-5p mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P <0.01)，表明轉(zhuǎn)染成功，見圖1c。

2.3 miR-100-5p抑制NSCLC細(xì)胞遷移和侵襲

與對照組相比，miR-NC組劃痕閉合率和侵襲細(xì)胞數(shù)目無明顯變化(P>0.05)，miR-100-5p mimic組劃痕閉合率顯著較低(P<0.01)，侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著較少(P<0.01)，miR-100-5p inhibitor組劃痕閉合率顯著較高(P<0.01)，侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著較多(P<0.01)，見圖2。

2.4 miR-100-5p抑制NSCLC細(xì)胞糖酵解

與對照組相比，miR-NC組H1650細(xì)胞中葡萄糖攝取量、乳酸產(chǎn)生量、ATP含量、ECAR、OCR均無明顯變化(P>0.05)，miR-100-5p mimic組H1650細(xì)胞中葡萄糖攝取量、乳酸產(chǎn)生量、ATP含量及ECAR顯著較低(P<0.01)，OCR顯著較高(P<0.01)，miR-100-5p inhibitor組H1650細(xì)胞中葡萄糖攝取量、乳酸產(chǎn)生量、ATP含量及ECAR顯著較高(P<0.01)，OCR顯著較低(P<0.01)，見圖3。

a：RT-qPCR檢測NSCLC組織中miR-100-5p mRNA的表達(dá)；b：RT-qPCR檢測NSCLC細(xì)胞中miR-100-5p mRNA的表達(dá)；c：RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染后NSCLC中miR-100-5p mRNA的表達(dá) △：與癌旁組織相比，P<0.01；#：與BEAS-2B相比，P<0.01；*：與對照組相比，P<0.01

a：劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移(×100)；b：Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲(結(jié)晶紫×200)；*：與對照組比較，P<0.01

a：葡萄糖攝取比色測定試劑盒檢測葡萄糖攝?。籦：乳酸測定試劑盒Ⅱ檢測乳酸生成；c：ATP比色測定試劑盒檢測ATP含量；d：Seahorse XF糖酵解應(yīng)激測試試劑盒檢測ECAR；e：Seahorse XF細(xì)胞線粒體應(yīng)激測試試劑盒檢測OCR *：與對照組相比，P<0.01

2.5 miR-100-5p靶向下調(diào)FGFR3

通過Targetscan軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-100-5p與FGFR3具有靶向關(guān)系，在3’UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)(圖4a)；通過雙熒光素酶發(fā)現(xiàn)，miR-100-5p與FGFR3-WT共轉(zhuǎn)染顯著降低了熒光素酶活性(P<0.01)，見圖4b。與miR-NC組相比，miR-100-5p mimic組FGFR3蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01)，說明miR-100-5p靶向下調(diào)FGFR3；與pc-NC組相比，pc-FGFR3組FGFR3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，表明轉(zhuǎn)染成功，見圖4c。

2.6 miR-100-5p通過靶向FGFR3對NSCLC細(xì)胞遷移、侵襲和糖酵解起抑制作用

與miR-100-5p mimic+pc-NC組比較，miR-100-5p mimic+pc-FGFR3組H1650細(xì)胞劃痕閉合率較高，侵襲細(xì)胞數(shù)目較多，葡萄糖攝取量、乳酸產(chǎn)生量、ATP含量及ECAR顯著較高，OCR顯著較低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖5。

a：Targetscan軟件預(yù)測miR-100-5p與FGFR3結(jié)合靶點(diǎn)；b：雙熒光素酶實驗驗證miR-100-5p與FGFR3靶向關(guān)系；c：蛋白印跡法檢測FGFR3蛋白表達(dá)水平 *：與miR-NC組相比，P<0.01；#：與pc-NC組相比，P<0.01

a：劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移(×100)；b：Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲(結(jié)晶紫×200)；c：葡萄糖攝取比色測定試劑盒檢測葡萄糖攝??；d：乳酸測定試劑盒Ⅱ檢測乳酸生成；e：ATP比色測定試劑盒檢測ATP含量；f：Seahorse XF糖酵解應(yīng)激測試試劑盒檢測ECAR；g：Seahorse XF細(xì)胞線粒體應(yīng)激測試試劑盒檢測OCR *：與miR-100-5p mimic+pc-NC組比較，P<0.01

3 討論

NSCLC病情發(fā)展迅速、轉(zhuǎn)移風(fēng)險高、病死率高，是惡性程度較高的腫瘤之一。現(xiàn)有治療手段無法控制NSCLC導(dǎo)致的低生存率和高病死率，因此醫(yī)學(xué)研究者將目光轉(zhuǎn)向了生物治療[10]。本研究主要探究miR-100-5p對NSCLC細(xì)胞遷移、侵襲和糖酵解的影響及作用機(jī)制。

miRNA的失調(diào)是癌癥的發(fā)病機(jī)制之一，某些miRNA在人類癌癥的診斷和治療中具有重要作用。本研究結(jié)果表明，miR-100-5p表達(dá)與NSCLC患者的性別、年齡和病理類型無關(guān)，而與吸煙史、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化成程度有關(guān)，miR-100-5p在NSCLC組織和細(xì)胞中低表達(dá)，說明miR-100-5p與NSCLC的發(fā)展密切相關(guān)，這與已有研究結(jié)果NSCLC組織中miR-100相對低表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)一致[11]。NSCLC的高復(fù)發(fā)率和高病死率與該細(xì)胞具有較強(qiáng)轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，而腫瘤細(xì)胞的侵襲能力和遷移能力反映了癌癥的轉(zhuǎn)移能力。因此，尋找能夠抑制NSCLC侵襲和遷移的新型分子或治療靶標(biāo)具有重要意義。本研究表明，miR-100-5p過表達(dá)抑制NSCLC細(xì)胞遷移和侵襲，miR-100-5p低表達(dá)促進(jìn)NSCLC細(xì)胞遷移和侵襲，這與miR-100通過靶向IGF1R抑制鼻咽癌的遷移和侵襲[12]、miR-100通過靶向FZD-8抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[13]等結(jié)果相符。

癌細(xì)胞經(jīng)常表現(xiàn)出高速率的有氧糖酵解，即Warburg效應(yīng)。癌細(xì)胞葡萄糖代謝的發(fā)生率高于正常細(xì)胞[14]。從氧化磷酸化到有氧糖酵解的代謝重編程是癌癥進(jìn)展中的常見事件[15]。盡管就每個葡萄糖的ATP數(shù)量而言，糖酵解不如氧化磷酸化提供的能量有效，但其為合成代謝提供了多種糖酵解中間體，滿足了快速增長的癌細(xì)胞對構(gòu)件的需求[16]。此外，糖酵解的增加會導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中葡萄糖的缺乏和乳酸的積累，從而抑制淋巴細(xì)胞浸潤并降低抗免疫療法效果[17]。靶向代謝途徑已被證明是控制腫瘤生長和增強(qiáng)抗癌療效的有效途徑[18]。已有研究表明，HIF1A通過miR-100-5p激活lncRNA RAET1K的轉(zhuǎn)錄調(diào)控低氧誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞糖酵解[19]。同樣，本研究也顯示，miR-100-5p過表達(dá)抑制NSCLC細(xì)胞糖酵解，miR-100-5p低表達(dá)促進(jìn)NSCLC細(xì)胞糖酵解。

miRNA通過與靶基因的3’U端結(jié)合，誘導(dǎo)基因或蛋白降解，在轉(zhuǎn)錄后抑制基因表達(dá)。已有研究表明，過表達(dá)miR-100通過FGFR3抑制骨肉瘤的生長[20]，miR-100在人類膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中通過FGFR3抑制細(xì)胞增殖、遷移和化學(xué)敏感性[21]。同理，本研究結(jié)果表明，miR-100-5p可靶向下調(diào)FGFR3。FGFR由1個細(xì)胞配體結(jié)構(gòu)域組成，該結(jié)構(gòu)域由3個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，1個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域和1個具有酪氨酸激酶活性的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成[22]。FGFR3在多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用，具有成為腫瘤治療靶標(biāo)的潛力。siRNA沉默F(xiàn)GFR3可抑制NSCLC A549細(xì)胞的侵襲[23]。FGFR3對內(nèi)皮糖酵解的調(diào)節(jié)是成年血管生長和發(fā)育的關(guān)鍵過程[24]。同樣，本研究表明，miR-100-5p過表達(dá)靶向下調(diào)FGFR3表達(dá)抑制NSCLC細(xì)胞遷移、侵襲和糖酵解。

綜上所述，miR-100-5p過表達(dá)靶向下調(diào)FGFR3表達(dá)抑制NSCLC細(xì)胞遷移、侵襲和糖酵解，這說明miR-100-5p和FGFR3可能為NSCLC的潛在治療靶點(diǎn)。本研究僅是miR-100-5p對NSCLC細(xì)胞遷移、侵襲和糖酵解作用機(jī)制的初步探討，更為深入的分子通路機(jī)制有待進(jìn)一步研究。