王 穎

（天津市薊州區(qū)疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，天津 301900）

流行性感冒（influenza）是一種由于流感病毒導(dǎo)致的急性呼吸道傳染病，臨床中較為常見，具有傳播速度快、傳染范圍廣、發(fā)病率高等特點(diǎn)，流感患者發(fā)病后臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、頭疼、寒戰(zhàn)、全身酸痛等，對(duì)患者的生命安全及生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重的威脅[1]。為了進(jìn)一步了解流感病毒的流行株構(gòu)成、基因特異性以及抗原性，預(yù)防流感的擴(kuò)散，及時(shí)、有效的監(jiān)測(cè)至關(guān)重要[2]。目前，臨床檢測(cè)流感病毒的方法較多，如膠體金快速檢測(cè)、細(xì)胞培養(yǎng)等[3，4]。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)在1996 由美國研究人員發(fā)明，和傳統(tǒng)的PCR 技術(shù)相比，提高了其環(huán)保型，且具有自動(dòng)化的特點(diǎn)，檢測(cè)特異度高[5]。該技術(shù)能夠通過擴(kuò)增的方式，作用于每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物的熒光信號(hào)，從而提高信號(hào)的強(qiáng)度，當(dāng)一個(gè)循環(huán)結(jié)束后，會(huì)被熒光強(qiáng)度信號(hào)收集，能夠通過熒光強(qiáng)度觀察產(chǎn)物量的變化，從而建立熒光擴(kuò)增曲線圖[6]。因此，本次研究對(duì)比了細(xì)胞培養(yǎng)法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)流感病毒的效果，具體報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年10 月～2020 年10 月天津市薊州區(qū)疾病預(yù)防控制中心的604 例疑似流感樣本作為研究對(duì)象，所有樣本均在24 h 內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，無法在24 h 內(nèi)送檢的樣本，置于-70 ℃的環(huán)境中保存。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法 通過核酸提取盒實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法提取樣本。ABI7500 Fast 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，由美國Thenmo 公司提供，核酸提取采用RNA 病毒提取試劑盒RNeasy Mini Kit，由德國QIAGEN 公司提供，PCR 反應(yīng)試劑由碩世生物科技有限公司提供。擴(kuò)增條件為在50 ℃下持續(xù)30 min，循環(huán)1 次后，在95 ℃下持續(xù)5 min，循環(huán)1 次后在95 ℃下持續(xù)10 s，然后在55 ℃下持續(xù)40 s，共進(jìn)行45 個(gè)循環(huán)。最后熒光收集，并在55 ℃環(huán)境下實(shí)施熒光檢測(cè)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)法 參考《流行性感冒診療方案（2018年版修訂版）》中規(guī)定的流感病毒的鑒定及分離操作。狗腎傳代細(xì)胞由天津市疾病預(yù)防控制中心提供。將10000 U/ml 雙抗置入樣本病毒培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞發(fā)生的病理變化，并通過紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測(cè)病毒培養(yǎng)液。當(dāng)紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)的滴度達(dá)到1∶16 及以上時(shí)，采用紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)對(duì)相關(guān)亞型，用標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以細(xì)胞培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)法的靈敏度及特異度。計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法與細(xì)胞培養(yǎng)法陽性率比較實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法陽性率高于細(xì)胞培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法毒株分離情況 160 例流感陽性樣本中，共分離出毒株60 株，分離率37.50%；444 例流感陰性樣本中，共分離出毒株16株，分離率3.60%；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 陽性樣本分離率高于陰性樣本分離率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=122.857，P=0.000）。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法與細(xì)胞培養(yǎng)法陽性率比較[n（%）]

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法靈敏度與特異度 以細(xì)胞培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)靈敏度為90.79%，特異度為98.42%，見表2。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法靈敏度與特異度

3 討論

流感病毒屬于RNA 病毒，在臨床中的發(fā)病率極高，且流感病毒的感染性較強(qiáng)，潛伏期短，傳染過程中還可能發(fā)生變異，危險(xiǎn)性極高，一旦發(fā)生疏忽，極易導(dǎo)致流感爆發(fā)。因此，如何對(duì)流感病毒進(jìn)行有效的預(yù)防及控制，是臨床有待解決的課題之一[3]。膠體金快速檢測(cè)敏感度較低，在單獨(dú)診斷及篩查中應(yīng)用有限。而細(xì)胞培養(yǎng)法雖然是目前檢測(cè)流感病毒最可靠的方式之一，但檢測(cè)流程較為復(fù)雜，難以滿足快速診斷的需求，難以在基層推廣使用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR不僅能夠有效解決PCR 造成的污染問題，同時(shí)還能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)，特異性較高，目前已經(jīng)成為臨床監(jiān)測(cè)流感病毒的“金標(biāo)準(zhǔn)”[5]。

本次研究結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)法共檢測(cè)出陽性76 株，陽性率12.58%；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法共檢測(cè)陽性160 例，陽性率26.49%。細(xì)胞培養(yǎng)法中，A 型H1亞型檢出7 例，A 型H3亞型31 例，B 型檢出38 例；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法中，A 型H1亞型檢出11 例，A型H3亞型76 例，B 型73 例。兩種方法陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=37.158，P=0.000）。160 例流感陽性樣本中，共分離出毒株60 株，分離率37.50%；444 例流感陰性樣本中，共分離出毒株16株，分離率3.60%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 陽性樣本與陰性樣本分離率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=122.857，P=0.000）。以細(xì)胞培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)靈敏度為90.79%（69/76），特異度為98.42%（437/444）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 計(jì)數(shù)的原理是在原來的反應(yīng)體系中增加熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)，在反應(yīng)的過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物會(huì)逐漸上升，熒光信號(hào)越來越多，醫(yī)務(wù)人員可以根據(jù)對(duì)熒光信號(hào)的觀察，分析熒光信號(hào)的變化趨勢(shì)判斷PCR 進(jìn)程的開展情況，再利用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法的特點(diǎn)，其反應(yīng)過程可以分為三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)、熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增以及平臺(tái)期[7]。在第一個(gè)過程中，由PCR 反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號(hào)較少，經(jīng)常出現(xiàn)被覆蓋的情況，醫(yī)務(wù)人員難以明確產(chǎn)無量的具體變化；而在平臺(tái)期的反應(yīng)過程中，擴(kuò)增信號(hào)的數(shù)量無明顯變化，較為穩(wěn)定。在熒光信號(hào)擴(kuò)增的過程中，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)無量的指數(shù)與DNA 模板密切相關(guān)。為了便于分析，可以引入熒光閾值和閾值循環(huán)數(shù)（threshold cycle，Ct）兩個(gè)概念[8]。熒光閾值指的是醫(yī)務(wù)人員在曲線上假定的一個(gè)值，缺省設(shè)置為3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10 倍。Ct 值指的是在PCR 反應(yīng)發(fā)生的過程中，不同反應(yīng)罐呃逆熒光信號(hào)達(dá)到假定值所需要得循環(huán)次數(shù)。不同模板下，擴(kuò)增時(shí)熒光數(shù)值存在一定的差異，且具有不可重復(fù)的特點(diǎn)，在Ct 值得輔助下有利于醫(yī)務(wù)人員重現(xiàn)PCR 反應(yīng)過程[9]。根據(jù)PCR 定量達(dá)到原理，模板起始拷貝對(duì)數(shù)與閾值循環(huán)之間有密切的關(guān)系，隨著拷貝數(shù)的增加，所達(dá)到閾值需要的循環(huán)會(huì)有所下降，Ct 值也就越小[10]。因此，醫(yī)務(wù)人員可以根據(jù)起始的拷貝數(shù)繪制曲線，而熒光基團(tuán)與PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量有關(guān)，通過對(duì)熒光信號(hào)的收集與分析，即可得出Ct 值，從計(jì)算出未知樣品的起始拷貝數(shù)[11]。

近十幾年來，研究人員提出并詳細(xì)闡述了許多實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法。根據(jù)所用熒光物質(zhì)的化學(xué)原理和PCR 檢測(cè)的特異性，可將其分為兩大類：第1 類是DNA 染料法，對(duì)特異性和非特異性的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)[12]；第2 類是熒光探針法，將熒光素與寡聚核苷酸相連，對(duì)特異性的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。目前有多種雙鏈DNA 結(jié)合染料可用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，包括EB、SYBR GreenⅠ、SYBR Gold、Eva Green 等。其中最常用的染料是SYBR GreenⅠ，這種DNA 染料吸收藍(lán)光（λmax=497 nm）、發(fā)射綠光（λmax=520 nm），對(duì)DNA 雙鏈具有高親和力[13]。當(dāng)它結(jié)合到雙鏈DNA 小溝部位時(shí)，會(huì)發(fā)出很強(qiáng)的熒光，在qPCR 延伸階段能夠被檢測(cè)到，具有較強(qiáng)的敏感性，并且不需要因模板不同而進(jìn)行特別定制，操作簡易，相對(duì)于熒光探針類來說價(jià)格較低，因此被廣泛應(yīng)用[14]。但是在qPCR 擴(kuò)增過程中，非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體也能與染料結(jié)合產(chǎn)生熒光信號(hào)，這種染料與雙鏈DNA 結(jié)合非特異性的特點(diǎn)會(huì)造成假陽性，從而影響定量的準(zhǔn)確性，因此其特異性不如探針法[15]。針對(duì)這一問題，需要用熔解曲線鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。熔解曲線分析是將樣品從50 ℃升高至95 ℃，并監(jiān)測(cè)這一過程熒光信號(hào)的變化[16]。到達(dá)DNA 變性溫度時(shí)，染料分解導(dǎo)致熒光信號(hào)劇烈下降，非特異性產(chǎn)物和引物二聚體的變性溫度要比特異性產(chǎn)物低，故可以通過熔解曲線進(jìn)行鑒別[17]。有研究者發(fā)現(xiàn)[18]，Eva Green 比SYBR GreenⅠ具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性和敏感性，Eva Green 在飽和的情況下可以產(chǎn)生更強(qiáng)的熒光信號(hào)，并且適合高分辨率的熔解曲線分析。熒光探針是將小分子熒光素結(jié)合到寡聚核苷酸上，在qPCR 進(jìn)程中起探針的作用。目前已有多種不同激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的熒光基團(tuán)可以在qPCR 中使用[19]。

綜上所述，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)流感病毒的應(yīng)用較高價(jià)值，具有檢測(cè)速度高、靈敏度高、特異性高等優(yōu)勢(shì)，可用于應(yīng)急檢測(cè)、常規(guī)檢測(cè)等。細(xì)胞培養(yǎng)能夠獲取毒株，有利于進(jìn)一步對(duì)病毒抗原性、基因特性以及耐藥性的研究。