朱曉慧，陸啟榮，胡嗣祎，王 旭

(國家獸藥殘留基準實驗室(華中農(nóng)業(yè)大學)/農(nóng)業(yè)部獸藥殘留檢測重點實驗室/農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室/華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖北武漢 430070)

單端孢霉烯族毒素是由多種霉菌產(chǎn)生的一類具有倍半萜結(jié)構(gòu)的次級代謝物。產(chǎn)生該毒素的霉菌主要是鐮刀菌屬(Fusarium)。目前，已發(fā)現(xiàn)的單端孢霉烯族毒素有200多種[1]，根據(jù)化學結(jié)構(gòu)不同，可將其分為A、B、C、D 4種類型，其均具有特征性的C-12，C-13-環(huán)氧環(huán)和相同的四環(huán)倍半萜結(jié)構(gòu)，如圖1所示。值得注意的是，在食品和飼料中污染最嚴重的是A型和B型的單端孢霉烯族毒素，其中T-2毒素是A型中污染范圍最廣、毒性最強的霉菌毒素之一；脫氧雪腐鐮刀烯醇(DON)是B型中存在最普遍的霉菌毒素之一[2]，廣泛存在于小麥、大麥、燕麥和玉米等糧食及含有小麥、玉米等的飼料中，給糧食生產(chǎn)和畜牧業(yè)帶來了嚴重的危害。

圖1 單端孢霉烯族毒素的基本結(jié)構(gòu)

單端孢霉烯族毒素在我國乃至全世界的污染狀況較為嚴重，不僅造成巨大的損失，對人和動物的健康也帶來嚴重危害。T-2毒素對動物機體產(chǎn)生的毒性作用，主要體現(xiàn)在其能夠抑制蛋白質(zhì)、DNA和RNA的合成，引起細胞毒性和細胞周期阻滯，損害代謝旺盛的細胞組織器官[3-4]，并且依據(jù)暴露時間和劑量的差異，T-2毒素能夠引起動物急性或慢性毒性。T-2毒素急性毒性會發(fā)生嘔吐、腹瀉、厭食、皮膚損害、胃腸炎、腸道出血、血細胞減少等癥狀[5]。動物攝入低劑量T-2毒素污染的飼料可導致生長抑制，免疫損傷[6]，血液系統(tǒng)紊亂、生殖和胚胎毒[7]，軟骨損傷[8]等。DON又稱嘔吐毒素，是一種腸毒素，對豬最為敏感[9]。DON能誘導核糖毒性應(yīng)激，破壞大分子合成、細胞信號傳導、分化、增殖和死亡[10]，并能夠影響包括神經(jīng)內(nèi)分泌信號的改變，促炎基因的誘導，生長激素軸的破壞和腸道完整性的改變[11]。急性DON中毒會引起動物嘔吐，而長期低劑量暴露會引起動物厭食，生長遲緩[12]，免疫毒性以及由母體毒性導致的生殖和發(fā)育受損[13]，給畜禽生產(chǎn)帶來嚴重危害和經(jīng)濟損失。

由于單端孢霉烯族毒素給畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的損失，霉菌毒素的脫除方法逐漸引起大家的關(guān)注。目前，脫除霉菌毒素的方法主要包括物理、化學和生物法3種。物理脫毒法主要有物理吸附(蒙脫石、硅藻土和沸石等)、輻照(γ射線輻照)、高溫等；化學脫毒主要是使用堿法(氫氧化鈉)和氧化法(次氯酸鈉和臭氧等)來降低霉菌毒素的毒性；這些傳統(tǒng)的物理化學方法在一定程度上是成功的，但也存在一定的弊端，如條件劇烈、安全性差、損害飼糧中的營養(yǎng)物質(zhì)和風味等。生物脫毒主要是通過特異性篩選某種微生物或酶類，在其次級代謝產(chǎn)物或分泌的胞內(nèi)、胞外酶的參與下，通過破壞、修飾或吸附霉菌毒素基團，從而達到減毒或產(chǎn)生無毒降解產(chǎn)物的目的[14-15]，能夠?qū)γ咕舅剡M行脫毒的微生物主要有細菌、非產(chǎn)毒真菌和酵母菌。與物理化學法脫毒技術(shù)相比，生物脫毒具有條件溫和、高效和特異性強，對原料和飼料的營養(yǎng)價值和風味影響小等優(yōu)勢[16]。因此，利用生物法脫除霉菌毒素已成為一研究熱點，隨著對霉菌毒素研究的不斷深入，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)較多具有特異性降解真菌毒素能力的微生物。本文將從細菌、真菌、以及酵母菌角度對這幾種微生物去除T-2毒素和DON毒性的作用進行綜述，以期為相關(guān)研究提供參考價值。

1 細菌對霉菌毒素的降解

在微生物中能夠降解單端孢霉烯族毒素的多數(shù)為細菌，且這些微生物主要來源于動物胃腸道和毒素存在的環(huán)境中。通過體外與毒素共培養(yǎng)的方式能夠篩選出具有降解毒素的菌株，進而有效地將T-2毒素降解成毒性相對較低的HT-2毒素、T-2三醇、T-2四醇和鐮刀菌烯三醇等或?qū)ON降解成DOM-1、3-酮基-DON或無毒物質(zhì)等。

1.1 細菌對T-2毒素的降解作用

目前在動物胃腸道中發(fā)現(xiàn)了幾種單菌株能夠有效的降解T-2毒素的毒性。Westlake K等[17]研究發(fā)現(xiàn)丁酸弧菌屬菌株CE51和CE56可以將T-2毒素轉(zhuǎn)化成為HT-2毒素、T-2三醇和NEO，而厭氧弧菌屬解脂假絲酵母和反芻月形單孢菌只能將T-2毒素轉(zhuǎn)化成HT-2毒素和 T-2 三醇。此外，有研究通過檢查各種動物腸道和糞便對T-2毒素的代謝作用，發(fā)現(xiàn)來自大鼠、牛和豬的微生物可以完全將T-2毒素轉(zhuǎn)化成蛇形菌素(DAS)；并發(fā)現(xiàn)從大鼠獲得的腸道菌群能對DAS進行脫環(huán)氧環(huán)，生成脫氧15-單乙酰鐮刀菌烯三醇(DE MAS)、脫氧鐮刀菌烯三醇(DE SCP)和SCP[18]。此外，周浪花[19]等從新鮮健康的凡納濱蝦腸道中篩選得到T-2 降解菌株，其中蠟狀芽孢桿菌和陰溝腸桿菌對 T-2毒素降解率最高，分別達到 91.8%和78.8%。上述研究表明，腸道內(nèi)的某些細菌能夠有效的降解T-2毒素，在今后的研究中可以從動物胃腸內(nèi)分離篩選降解T-2毒素的微生物，既能有效降解T-2毒素，又能起到改善動物胃腸道菌群的作用。

除了在動物胃腸道中發(fā)現(xiàn)能夠降解T-2毒素的細菌，在自然環(huán)境中也存在著部分能降解T-2毒素的細菌。施琦[20]等從蝦養(yǎng)殖環(huán)境中分離得到5株鐮孢菌，將它們作為試驗菌種，在其產(chǎn)毒培養(yǎng)過程中分離到2株T-2毒素降解菌，16S rRNA鑒定結(jié)果分別為彎曲假單胞菌和尼泊爾葡萄球菌，對T-2毒素的降解率分別為90.9%和85.5%，其聯(lián)合作用也有較好降毒效果。向雨珂[21]等也從土壤中分離出兩種能夠降解T-2毒素的細菌，分別是B14氧化微桿菌(M.oxydans)和B26暹邏芽孢桿菌(B.siamensis)，它們在18 h內(nèi)均能脫除體系中95%以上的T-2毒素。Zou Z Y[22]等選用5株乳酸菌的發(fā)酵液探討其對T-2毒素的脫除能力，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌102菌株(LP102)在37℃培養(yǎng)72 h后，其去除能力最強，該研究表明體外考慮菌株對毒素的脫毒作用時，需要綜合考慮培養(yǎng)的溫度以及時間等因素，以期能夠達到最佳的脫除效果。上述的研究表明動物的胃腸道以及自然界中存在可以降解T-2毒素的細菌，但是并未對其具體的脫毒機制進行研究，值得進一步挖掘。此外，體外脫毒菌株的脫毒效率，應(yīng)充分考慮培養(yǎng)的條件以及與相關(guān)細菌的聯(lián)合協(xié)同作用，并對其降解的產(chǎn)物進行進一步的毒性評價及分析，為深入研究細菌的脫毒機制奠定基礎(chǔ)。

1.2 細菌對嘔吐毒素的降解作用

動物胃腸道中不僅存在降解T-2毒素的細菌，對于DON來說，也有部分細菌能夠降解其毒性。研究最多的是從牛瘤胃液中分離得到的 BBSH 797菌株，其主要作用是能夠?qū)Ⅲw內(nèi)外的DON 轉(zhuǎn)化成DOM-1[23]，這種細菌已經(jīng)商業(yè)化，在市場上就能購買到含有BBSH 797飼料添加劑產(chǎn)品，但尚未應(yīng)用到食品工業(yè)中。后續(xù)研究證明，菌株BBSH 797也能轉(zhuǎn)化A型單端孢霉烯族毒素，其分泌的環(huán)氧化酶具有脫環(huán)氧作用，能夠去除單端孢霉烯結(jié)構(gòu)中的的12，13-環(huán)氧環(huán)，從而使單端孢霉烯解毒[24]。Yu H等[25]采用變性梯度凝膠方法從雞腸道中分離了10株菌株，均能將DON轉(zhuǎn)化為DOM-1。馮培生[26]等研究發(fā)現(xiàn)大鼠腸道中的微生物也可使DON轉(zhuǎn)化為 DOM-1。上述研究表明，動物胃腸道中的細菌主要通過DON轉(zhuǎn)化成DOM-1的方式來降低DON的毒性。

He W J[27]等人采用原位富集法從土壤中分離到具有脫環(huán)氧活性的一個菌群PGC-3，該菌群作用72 h開始降解DON，在168 h后能夠完全降解DON。Wang Y[28]等篩選出一個能在5 d內(nèi)有效降解近70 μg/mL DON的菌群C20，該菌群還具有降解15-乙酰-DON、3-乙酰-DON和T-2毒素的能力。He J W[29]從富含禾谷鐮刀菌和霉變玉米的紫花苜蓿土壤中分離出來一種新型細菌Devosiamutans17-2-E-8，該細菌能夠?qū)ON轉(zhuǎn)化為無毒的立體異構(gòu)體3-epi-DON，且生物轉(zhuǎn)化的條件是在有機氮和碳的來源下進行的，不需要DON作為唯一的碳源，這一過程本質(zhì)上是酶促的，并且具有很高的解毒能力(3 μg DON/h/108細胞)。Wang S W[30]等從一個發(fā)霉的土壤樣品中分離到一株地衣芽孢桿菌YB9，發(fā)現(xiàn)該菌株具有較強的脫毒能力，其能夠明顯抑制或減輕DON對小鼠的損傷，并改善DON引起的腸道菌群失調(diào)，可作為潛在的益生菌添加劑用于改善食品和飼料安全。Zhang J[31]等從渤海55 m深度海水樣品中分離到ANSP101菌株，它能夠通過氧化C-3羥基將DON轉(zhuǎn)化為低毒性產(chǎn)物3-酮基-DON，降解活性主要歸因于菌體裂解物。Zhai Y[32]等研究了一株產(chǎn)于酸奶中的副干酪乳桿菌LHZ-1菌株，發(fā)現(xiàn)DON與細菌細胞表面結(jié)合形成復(fù)合物，對50 μg/mL DON的去除率可達40.7%。計成[33]等篩選得到一株高效降解飼料中嘔吐毒素的枯草芽孢桿菌(B.subtilis)ANSB471，經(jīng)72 h反應(yīng)后，該菌株對飼料中DON的降解率可達到95%，且經(jīng)傳代培養(yǎng)后，對嘔吐毒素的降解率仍保持在90%左右，且該菌株還能夠分泌酶活性較高的淀粉酶進而提高動物對飼料中淀粉的利用率。上述研究表明，在土壤或其他環(huán)境中存在高效降解DON的細菌，甚至能將DON轉(zhuǎn)化成無毒的產(chǎn)物，但是具體的降解機制仍待進一步挖掘，有助于開發(fā)并改造新型高效的降解毒素的細菌。

2 真菌對霉菌毒素的降解

目前生物降解單端孢霉烯族毒素研究較多的真菌有木霉、青霉、曲霉等，相對于細菌脫除單端孢霉烯族毒素，篩選出能降解T-2毒素和DON的研究報道相對較少。

2.1 真菌對T-2毒素的降解作用

真菌對T-2毒素的毒性具有降解作用。吳娛[34]從土壤中分離篩選出一株能產(chǎn)生胞外酶降解T-2毒素的黑曲霉，提取的降解酶不僅可以降解T-2毒素且其降解率達到70%以上；并通過動物試驗發(fā)現(xiàn)，在染毒飼料中添加1.5%的降解酶能顯著降低T-2毒素毒性。湯飛[35]等篩選了一株降解T-2毒素的黑曲霉(Aspergillusniger)，將該菌株接種于含有不同質(zhì)量濃度T-2毒素(10、20、50 μg/mL)的無機鹽培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵7 d以及14 d后，其降解率分別在65%以上及90%以上，且從菌株中提取的降解酶對T-2毒素的降解率達到70%以上。上述研究均表明，真菌具有降解T-2毒素的巨大潛能，除了黑曲霉，仍有大量的真菌值得進一步挖掘并考察其是否具有更高效的降解能力。

2.2 真菌對嘔吐毒素的降解作用

土壤中含有能夠降解DON毒性的真菌。據(jù)報道，何成華[36]等自土壤中分離到一株可以生物轉(zhuǎn)化DON的真菌塔賓曲霉H6(CCTCC NO:M2012128)，并獲得了DON降解酶，該酶可水解DON結(jié)構(gòu)C12-C13之間的環(huán)氧環(huán)。李亞菲[37]等從洛陽市周邊采集的土壤樣品中分離到了1株能降解嘔吐毒素的菌株編號為Ma-1-4，具有較強降解DON的能力，對玉米秸稈中DON的降解率達46%，經(jīng)形態(tài)學和分子生物學初步鑒定其分別為青霉菌屬菌株。王開萍[38]利用苯基環(huán)氧乙烷作為唯一碳源，從土壤中分離到一株可以生物轉(zhuǎn)化DON的菌株As-W6，經(jīng)鑒定其為米曲霉，該菌株分泌的一種胞外酶可以生物轉(zhuǎn)化DON。上述研究表明，土壤中可能存在大量的具有降解DON毒性的真菌，但是仍有大量的真菌有待發(fā)現(xiàn)，并對其降解機制有待進一步的挖掘。

3 酵母菌對霉菌毒素的降解

近年來不斷有研究報道酵母細胞對霉菌毒素具有減毒甚至消除作用，酵母菌脫除毒素主要通過酵母細胞的細胞壁對毒素具有吸附作用，利用細胞壁上的β-葡聚糖等多糖、脂類和含有吸附中心的蛋白質(zhì)，通過疏水作用力、氫鍵和離子鍵與霉菌毒素進行結(jié)合，且酵母細胞壁上的β-葡聚糖還可以將酚氧化酶體系活化，然后將飼料中的霉菌毒素進行分解，從而起到生物降解霉菌毒素的作用。因此，酵母菌作為解決谷類食品及動物飼料中的霉菌毒素的問題具有巨大的潛力。

3.1 酵母菌對T-2毒素的降解作用

酵母菌具有物理結(jié)合和生物轉(zhuǎn)化的方式降解T-2毒素毒性的潛能。Zou Z Y[22]等選取了5株酵母菌株研究脫除T-2毒素的能力，結(jié)果表明在這5株菌株中釀酒酵母1221(SC1221)的脫毒能力最強，其在30 ℃培養(yǎng)96 h，其脫毒率能夠達到36.50%±1.40%，進一步研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母主要是利用其細胞壁對T-2毒素的吸附作用，將絲狀霉菌的有毒代謝產(chǎn)物結(jié)合到細胞壁上達到脫毒的作用，在此基礎(chǔ)上，鄒忠義[39]又將該釀酒酵母(SC1221)進行活化和培養(yǎng)，制成酵母菌培養(yǎng)液，噴灑于污染的糧食或飼料中，發(fā)現(xiàn)酵母菌培養(yǎng)液仍可有效去除T-2毒素，且去除率高。此外，Chlebicz[40]等研究了12株乳酸桿菌和6株釀酒酵母對飼料中常見霉菌毒素的脫毒作用，發(fā)現(xiàn)這些益生菌均能降解常見的霉菌毒素，其中對T-2毒素的脫除率為61%。

部分酵母菌可以通過生物轉(zhuǎn)化的方式減少T-2毒素的毒性。Mccormick S P,等[41]測試了23種酵母菌株，通過研究發(fā)現(xiàn)，15種菌株能乙酰化將T-2毒素轉(zhuǎn)化為 3-乙?；鵗-2毒素(3-acetyl T-2 toxin)；3種菌株通過糖基化作用將T-2毒素轉(zhuǎn)化為T-2毒素3-糖苷(T-2 toxin3-glucoside)；3種菌株通過移除異戊酰基形成新茄病鐮刀菌烯醇(NEO)。雖然上述的研究表明酵母菌可通過物理吸附和生物轉(zhuǎn)化的方式來降解T-2毒素的毒性，但是其具體的降解機制仍未闡述清楚，降解機制的進一步闡述有助于開發(fā)并挖掘更加高效的解毒途徑。

3.2 酵母菌對嘔吐毒素的降解作用

酵母菌可作為預(yù)防DON中毒的良方。Repedkiene J[42]等報道3種酵母菌分別為S.cerevisiaeS.1.5(T)、M.pulcherrimaM.1、K.marxianusK.7.1(T)可將面粉中 0.65 mg/kg DON 分別降低至0.10 mg/kg、0.12 mg/kg和0.05 mg/kg。Chlebicz[40]等發(fā)現(xiàn)DON是霉菌毒素中最具抵抗力的霉菌毒素，將6株釀酒酵母與DON孵育24 h后，DON濃度能減少22%～43%。

將益生菌酵母釀酒酵母I1079作為仔豬的預(yù)防策略。在動物試驗中，將36只仔豬分2組，分別飼喂DON污染的飲食和受DON污染的酵母飲食，4周。結(jié)果發(fā)現(xiàn)補充釀酒酵母有助于提高仔豬對DON的抵抗力能力[43]，說明釀酒酵母能夠脫除仔豬體內(nèi)的DON。上述研究表明具有降解DON毒性的酵母菌具有開發(fā)成食品級的酵母菌，起到預(yù)防畜禽DON中毒的作用，并對食品的安全起到保駕護航的作用。

4 展望

國內(nèi)外利用微生物脫除霉菌毒素研究了幾十年，已取得了較大的成就，但能用于飼料生產(chǎn)的微生物的報道并不多，目前還是主要通過傳統(tǒng)的物理和化學法脫毒。生物脫毒的高效安全使該方法具有成為降解糧食及飼料毒素污染的新星。綜合大量研究，未來還需要從以下幾個方面進行重點研究，以望生物脫毒技術(shù)能夠完全用于糧食工業(yè)及飼料脫毒中。

(1)復(fù)合脫毒：對于食品和飼料中的單端孢霉烯族毒素，由于菌株對不同的毒素的敏感性不同，使用一種菌株降解毒素效果不理想。因此，通過多種脫毒方法結(jié)合完成毒素降解或能將夠除去單端孢霉烯族毒素的菌株進行組合試驗，使其發(fā)揮最大的降解率。

(2)使用益生菌降解：在自然環(huán)境中篩選出的野型菌株，雖然有降解效果，但可能會存在致病性，不能直接作為飼料添加劑添加于飼糧中。研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌、芽孢桿菌、釀酒酵母等益生菌對單端孢霉烯族毒素具有較好的脫毒效果，可以將其添加在飼料中作為飼料添加劑，不僅能改善腸道，還能降解毒素。因此，在今后的研究中要重點開發(fā)脫除毒素效果好的益生菌，應(yīng)用于飼料及糧食工業(yè)中來降低毒素濃度。

(3)誘變菌株：對于從自然環(huán)境和動物腸道篩選出的菌株來說，多數(shù)為新型菌株，雖能降解毒素，但會存在菌株降解效率低、降解酶產(chǎn)量低及其活性差等問題，因此，可以通過菌株誘變，篩選出能夠高效降解毒素的菌株，特別是能篩選出同時降解T-2毒素和DON的菌株，是解決該問題的有效方法之一。

(4)酶基因的克隆及表達：對于篩選得到的降解T-2毒素和DON的微生物，從大部分研究來看，微生物降解毒素僅初步探索了其降解，對其機制并未達到深入的研究。從目前來看，能高效降解霉菌毒素的降解酶基因少之又少，今后還需要大量篩選具有降解能力的菌株，深入研究其機制，并分離純化出微生物釋放的降解酶，尋找調(diào)控該降解酶的基因，然后進行克隆，使其在表達載體中高效表達，從而運用到糧食和飼料工業(yè)的實際生產(chǎn)中。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，也可以將多個降解酶基因串聯(lián)或融合在同一個表達載體中進行表達，使之能一次降解多種霉菌毒素。