金 劍，尹 崢，張 琪，許信剛

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，安徽合肥 230036)

能引起新生犢牛腹瀉的主要病原為多種腸道病原體，如病毒、細(xì)菌、寄生蟲[1-2]。其中牛輪狀病毒(Bovine rotavirus,BRV)和牛冠狀病毒(Bovine coronavirus,BCoV)被認(rèn)為是與犢牛腹瀉有關(guān)的最重要的腸道病毒，常常共同感染犢牛[3]，使得胃腸道功能紊亂、導(dǎo)致機(jī)體脫水、酸中毒、病情嚴(yán)重的可導(dǎo)致犢牛死亡，普遍流行在規(guī)模化牛場中，給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。盡管多數(shù)大腸埃希氏菌是非致病性的，但是有些致病性大腸埃希氏菌特別容易感染剛出生不久的犢牛，使其表現(xiàn)為水樣腹瀉[5-6]。2019年12月，陜西省某規(guī)模化奶牛場新生犢牛發(fā)生一起水樣腹瀉，2 d～3 d后有5頭犢牛死亡。為確定犢牛死亡的病因，無菌采集病死犢牛的肝臟和腸內(nèi)容物等進(jìn)行實驗室檢測。結(jié)果表明，這起犢牛腹瀉是由BCoV、BRV和大腸埃希氏菌混合感染引起，現(xiàn)將結(jié)果予以報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 陜西省某規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場發(fā)生腹瀉死亡的5頭犢牛，剖檢無菌采集5頭犢牛的肝臟及脾臟混合樣品5份，采集犢牛小腸容物5份。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 細(xì)菌常用培養(yǎng)基、靛基質(zhì)試劑、革蘭氏染液等按文獻(xiàn)[7]介紹的方法制備；藥敏紙片自杭州濱和微生物試劑有限公司購買。

1.1.3 儀器設(shè)備 高速冷凍離心機(jī)(D3024R)，美國貝克曼股份有限公司產(chǎn)品；立式壓力蒸汽滅菌器(LS-50HJ)，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)(GenoSens 1800)，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司產(chǎn)品；電子天平(DTC)，亞津電子科技公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離 無菌取肝臟深部組織置于添加100 mL/L犢牛血清的普通培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后。培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基；挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.2.2 細(xì)菌生化試驗 將分離菌培養(yǎng)物接種到細(xì)菌生化編碼鑒定管中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察試驗結(jié)果。

1.2.3 藥敏試驗 按文獻(xiàn)[7]介紹的K-B法操作及判定。

1.2.4 小鼠致病性試驗 健康小白鼠10只，隨機(jī)分成2組，第1組腹腔注射分離菌菌液0.2 mL/只(1×108CFU/mL)，第2組注射生理鹽水作為對照0.2 mL/只。在室溫條件下，隔離飼養(yǎng)，每日觀察小鼠存活狀況。小鼠死后立即無菌剖檢，觀察器官的病變，并將肝、脾進(jìn)行涂片染色鏡檢。

1.2.5 引物設(shè)計與合成 參考文獻(xiàn)[8-10]牛病毒性腹瀉病毒、牛冠狀病毒、牛輪狀病毒基因設(shè)計特異性引物，見表1。引物委托奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

表1 引物信息

1.2.6 病毒RNA提取、RT-PCR鑒定 腸內(nèi)容物離心取上清，按照TRIzol法提取總RNA，RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以獲得的cDNA為模板，采用表1的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及革蘭氏染色結(jié)果

在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上可見單個圓形、扁平、濕潤、表面光滑、邊緣整齊的紅色菌落(圖1)。分離菌株革蘭氏染色后，在顯微鏡下可觀察到紅色、形態(tài)為短桿狀、兩端圓滑并稍彎曲的桿菌。(圖2)，符合大腸埃希氏菌生長特性。

圖1 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基菌落形態(tài)

圖2 革蘭氏染色鏡檢(1 000×)

2.2 生化試驗結(jié)果

分離菌培養(yǎng)物接種到細(xì)菌生化編碼鑒定管中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，參照文獻(xiàn)[11]的標(biāo)準(zhǔn)，該菌的生化分析結(jié)果(見表2)均符合大腸埃希氏菌特性，因此分離菌為大腸埃希氏菌。

表2 分離菌株生化反應(yīng)結(jié)果

2.3 PCR鑒定結(jié)果

PCR鑒定結(jié)果顯示，5份樣品BVDV均為陰性(圖3)；有4份樣品BCoV為陽性(圖4)；5份樣品BRV為陽性(圖5)。4份樣品被鑒定為BCoV和BRV共同感染。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1～5.被檢測樣品；6.陰性對照

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1～5.被檢測樣品；6.陰性對照

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1～5.被檢測樣品；6陰性對照

2.4 小鼠致病性試驗結(jié)果

小鼠于感染后8 h出現(xiàn)精神沉郁，行動遲緩，食欲減退等癥狀，在12 h全部死亡，對照小鼠無異常。剖檢小鼠，取肝臟進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定，確定從死亡小鼠分離到的是大腸埃希氏菌。

2.5 藥敏試驗結(jié)果

用14種抗菌藥敏紙片對分離到的大腸埃希氏菌進(jìn)行藥物敏感性試驗。試驗結(jié)果如表3。

表3 大腸埃希氏菌對17種抗菌藥物的敏感性檢測

3 討論

犢牛腹瀉是一種多因素綜合征，具有易感因素(年齡、遺傳、營養(yǎng)和免疫學(xué)因素)，并且主要是單一或混合感染的病原體，例如病毒，細(xì)菌和寄生蟲，犢牛腹瀉被認(rèn)為是全世界犢牛的重要健康問題[12-13]。在世界范圍內(nèi)，牛冠狀病毒(BCoV)、輪狀病毒(BRV)和大腸埃希氏菌被公認(rèn)為是犢牛急性腹瀉中最重要的腸病原體[3]。本次研究檢測的5份腸內(nèi)容物中有4份樣品混合感染BRV和BCoV。進(jìn)一步對肝臟進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，以鑒定是否存在其他病原體，例如大腸埃希氏菌。本研究從肝臟分離出的大腸埃希氏菌，經(jīng)小鼠致病試驗和藥敏試驗可知，該大腸埃希氏菌致病性強(qiáng)且耐藥性強(qiáng)，僅對諾氟沙星、左氟沙星和多粘菌素B中度敏感，對其他臨床常用藥物均耐藥?？股赝ǔＳ糜谥委熜律鸂倥８篂a，但過量使用也會與對人類和動物健康以及對環(huán)境產(chǎn)生不利影響，如導(dǎo)致致病菌耐藥性及多重耐藥性提高[14]。本次研究的意義在于，一旦臨床上發(fā)生的類似牛冠狀病毒、牛輪狀病毒和大腸埃希氏菌混合感染，要及時發(fā)現(xiàn)并治療，善于總結(jié)經(jīng)驗，為制定抗菌藥物使用提供重要依據(jù)，對預(yù)防和治療此類感染以及科學(xué)用藥具有重要意義。