黃先敏，韓立乾，陳 宇，范 莉，張可滿

昭通學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南昭通 657000

0 引言

乳酸菌在人類生活中應(yīng)用廣泛，已有幾千年的歷史[1]，是一種有利于人體健康的益生菌，以活的菌體進(jìn)入到人體內(nèi)[2]，具有幫助消化、保持腸道健康[3]、幫助鈣質(zhì)吸收、防止腹瀉、癌癥[4]、消除便秘及制造維生素等作用。同時(shí)還有改善人體腸道菌群，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力[5]，抑腫瘤，降低血清膽固醇，調(diào)節(jié)血壓等重要的生理活性[6]。其中的保加利亞乳桿菌（L.bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（S.thermophiles）是人體腸道中的重要微生物，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和研究?jī)r(jià)值[7]。保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌在酸乳發(fā)酵過程中具有不同的發(fā)酵特性，在不同的發(fā)酵時(shí)期表現(xiàn)出不同的代謝性能[8]。嗜熱鏈球菌在發(fā)酵牛乳時(shí)，具有產(chǎn)酸快、生長(zhǎng)快的特點(diǎn)，從而營(yíng)造出一種適合另一種乳酸菌（保加利亞乳桿菌）生長(zhǎng)的酸性環(huán)境[9]。這兩種菌種互利共生，對(duì)人體起著有益作用[10]。牛乳中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，兩種菌混合發(fā)酵時(shí)，先將酪蛋白降解為肽類和氨基酸，以滿足菌種對(duì)含氮類物質(zhì)的需要[11]，同時(shí)將大分子物質(zhì)蛋白質(zhì)降解為小分子物質(zhì)（氨基酸、肽）有利于人類的吸收利用。

天麻是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，已有幾千年的藥用歷史[12]。天麻中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、巴利森苷、天麻素、天麻苷元、對(duì)羥基苯甲醛、對(duì)羥基苯甲酸以及天麻多糖等多種活性物質(zhì)[13]，其中天麻素和天麻苷元是其主要的活性物質(zhì)[14]。藥理研究表明，天麻素具有鎮(zhèn)靜催眠、抗癲癇、鎮(zhèn)痛、保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞和抗氧化、抗炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種作用[15，16]。巴利森苷類物質(zhì)是近年來在天麻中發(fā)現(xiàn)含量較高的活性物質(zhì)，是一種以結(jié)合態(tài)存在的天麻素，即天麻素和檸檬酸縮合而成的酯類成分。巴利森苷類活性物質(zhì)可代謝成天麻素類衍生物，具有改善學(xué)習(xí)記憶的作用，且效果比天麻素單體更強(qiáng)，有望成為新一代抗癡呆藥的先導(dǎo)物[17～19]。天麻苷元具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥、抗抑郁、改善記憶力、抗炎、抗腫瘤、抑制血小板凝集以及腦缺血保護(hù)作用[20，21]。天麻運(yùn)用在人體及其他動(dòng)物方面的研究報(bào)道較多，而運(yùn)用在微生物方面的研究未曾見有過報(bào)道。本論文將天麻中的有效成分提取出來，加入到乳酸菌的培養(yǎng)基中，通過測(cè)定蛋白質(zhì)的含量變化，以此得出天麻提取液對(duì)乳酸菌發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)含量變化的影響情況。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

天麻（昭通市神農(nóng)烏天麻良種繁育有限公司提供）；純牛奶（昆明雪蘭牛奶有限責(zé)任公司）；乳酸菌菌種為嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌混合菌種（來源于來思爾裸酸奶，云南皇氏來思爾乳業(yè)有限公司生產(chǎn)）；蔗糖（云南楚雄祿豐縣平浪鎮(zhèn)舍資街）。

1.2 試驗(yàn)方法

以添加純凈水的乳酸菌培養(yǎng)基為對(duì)照（CK組），對(duì)添加天麻提取液的乳酸菌培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)設(shè)置6 個(gè)重復(fù)，樣品中的蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法進(jìn)行測(cè)定。蛋白質(zhì)含量采用下列公式進(jìn)行計(jì)算，數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行分析。

1.2.1 天麻提取液的制備

準(zhǔn)確稱取天麻粉（80 目）20.000 g于干凈燒杯中，加入200 mL的娃哈哈純凈水。用FA25高剪切分散乳化機(jī)在轉(zhuǎn)速為10 000 r/min、時(shí)間為10 min的條件下，將其攪拌均勻。將混合液分裝入離心管內(nèi)，然后用A K 高速冷凍離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速為8 800 r/min，時(shí)間6 min，上清液為天麻提取液，倒出備用。

1.2.2 乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基的制備

CK組的乳酸菌培養(yǎng)基配方及比例：鮮牛奶62.57%、白砂糖8.39%、純凈水為16.52%；添加天麻提取液的乳酸菌培養(yǎng)基配方則是將純凈水換為天麻提取液，占整個(gè)培養(yǎng)基的比例為17%。配制好培養(yǎng)基后，按培養(yǎng)基總量的12.51%添加裸酸奶作為菌種。將接種好乳酸菌菌種的培養(yǎng)基，放在40 ℃的BIC-250人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.3 乳酸菌發(fā)酵過程的觀察及材料的收集

將剛接種好未進(jìn)行培養(yǎng)的時(shí)間設(shè)為0 min，然后每隔20 min，觀察一次，并記錄培養(yǎng)基的組織質(zhì)構(gòu)狀態(tài)，直到740 min為止。再根據(jù)發(fā)酵液在不同時(shí)間段組織形態(tài)及質(zhì)構(gòu)的變化，收集不同時(shí)間段（0 min、80 min、140 min、160 min、200 min、240 min、360 min、420 min、500 min、600 min、740 min）的發(fā)酵液進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定分析。共收集22 份樣品（CK組和加入天麻提取液兩組培養(yǎng)基，每組各11 份樣），放入冷藏箱中備用。

1.2.4 樣品溶液的制備

將收集的發(fā)酵液在冰浴的條件下，攪拌20 min后，取5 mL發(fā)酵液，加入10 mL娃哈哈純凈水稀釋，搖晃均勻，再冰浴6 min后，倒入離心管，用HR立式高速冷凍離心機(jī)在轉(zhuǎn)速為4 000 r/min，溫度為4 ℃條件下，離心6 min。取上清液定容至50 mL的容量瓶中，待用。

1.2.5 樣品溶液的測(cè)定

取樣品溶液1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)染液，充分搖晃均勻后，靜置5 min，用722N分光光度計(jì)在595 nm波長(zhǎng)下，測(cè)其吸光度。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取50 mg結(jié)晶牛血清白蛋白標(biāo)品，溶解定容于50 mL容量瓶里，作為母液。分別取母液5 mL和10 mL定容至兩支50 mL的容量瓶中，配成100 μg/mL、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。再分別取0 mL、2 mL、4 mL、8 mL的100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液和6 mL、8 mL、10 mL的200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液于一組小燒杯中，加純凈水稀釋至10 mL，配制一系列濃度梯度為0 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、120 μg/mL、160 μg/mL及200 μg/mL的溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取上述溶液1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)染液，充分搖晃均勻后，靜置5 min，在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度。以所測(cè)得的吸光度為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，可得蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖1。

從圖1中可見，吸光度與質(zhì)量濃度間的線性關(guān)系式為y=199.74x-1.3676（R2=0.9965）。表明在0～200 μg/mL的溶液濃度范圍內(nèi)，吸光度與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。

1.2.7 儀器的精密度、準(zhǔn)確性及重復(fù)性試驗(yàn)

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

取發(fā)酵80 min的CK培養(yǎng)基樣品，參照1.2.4的步驟進(jìn)行冰浴、離心處理，再按照1.2.5的步驟重復(fù)6 次測(cè)定，得其吸光度。經(jīng)過計(jì)算，得其RSD值為1.844%，可知儀器的精密度好、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種乳酸菌培養(yǎng)液的顯微結(jié)構(gòu)

用10 倍稀釋梯度法制作發(fā)酵液的菌懸液，采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行制片，在CX40光學(xué)顯微鏡下觀察，對(duì)發(fā)酵液中的乳酸菌細(xì)胞進(jìn)行拍攝，見圖2和圖3。

圖2和圖3所拍攝的是在同一發(fā)酵時(shí)間段內(nèi)，發(fā)酵液中乳酸菌的顯微形態(tài)圖。從圖2和圖3中可以看出，添加純凈水的發(fā)酵液中，嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的細(xì)胞相對(duì)于添加天麻提取液的細(xì)胞小且數(shù)量少，兩種發(fā)酵液中的嗜熱鏈球菌都為球形，呈分散分布狀態(tài)，保加利亞乳桿菌呈短桿狀分散分布。

圖2 添加天麻提取液的顯微圖（放大倍數(shù)10×40）

圖3 添加純凈水的顯微圖（放大倍數(shù)10×40）

2.2 兩種乳酸菌培養(yǎng)液的質(zhì)構(gòu)變化

設(shè)置每20 min間隔觀察一次，觀察兩組發(fā)酵液的形態(tài)和質(zhì)構(gòu)變化，將發(fā)酵液形態(tài)和質(zhì)構(gòu)變化明顯時(shí)間段的情況進(jìn)行匯總，結(jié)果見表1。

從表1中可以看出，添加天麻的發(fā)酵液凝乳速度較CK組快，80 min時(shí)觀察到添加天麻的發(fā)酵液液體流動(dòng)感減弱，已經(jīng)開始凝乳，而CK組的發(fā)酵液還呈液體狀態(tài)；添加天麻的發(fā)酵液在200 min時(shí)黏稠感加強(qiáng)，到240 min時(shí)完全凝固，而CK組的發(fā)酵液在200 min時(shí)流動(dòng)感才開始減弱，240 min才開始有黏稠感；CK組發(fā)酵液凝固相對(duì)于天麻提取液延后140 min。添加天麻提取液的發(fā)酵液從340～740 min間，依次出現(xiàn)凝固不均勻，四周有淡黃色液體，上層有液體析出，分層明顯的現(xiàn)象產(chǎn)生；而CK組的發(fā)酵液是從500～740 min間，依次出現(xiàn)凝固不均勻，四周有液體及上層有液體析出的現(xiàn)象，表明天麻提取液有促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)代謝的作用。

2.3 不同發(fā)酵時(shí)間段的蛋白質(zhì)的含量

將所測(cè)樣品溶液的吸光度，代入吸光度與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系式中，應(yīng)用1.2的公式可得樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量（μg/mL），結(jié)果見表2。

表2 不同發(fā)酵時(shí)間段中蛋白質(zhì)的含量（μg/mL）

由表2可知，添加天麻提取液的起始蛋白質(zhì)含量為18 371.78 μg/mL，高于添加純凈水的起始蛋白質(zhì)含量15 803.75 μg/mL，這是因?yàn)榧橹泻械鞍踪|(zhì)的量為6.96%[22]。添加天麻提取液的蛋白質(zhì)含量在360 min時(shí)，下降到最低點(diǎn)，為446.24 μg/mL，CK組的蛋白質(zhì)含量在420 min時(shí)，下降到最低點(diǎn)，為451.73 μg/mL，可見天麻提取液具有促進(jìn)蛋白質(zhì)降解的作用；添加天麻提取液和CK組在360～740 min和420～740 min兩個(gè)發(fā)酵時(shí)間段中的蛋白質(zhì)含量變化不大。

以時(shí)間為橫坐標(biāo)，不同發(fā)酵時(shí)間段的蛋白質(zhì)含量為縱坐標(biāo)，作成不同發(fā)酵時(shí)間段的蛋白質(zhì)含量變化曲線圖，見圖4。

從圖4 中可以看出，在0 ～1 4 0 m i n 的發(fā)酵過程中，二者蛋白質(zhì)含量下降的趨勢(shì)都非常平緩。這是因?yàn)槎叨继幱诎l(fā)酵前期，對(duì)于嗜熱鏈球菌來說，菌株接種后可利用牛奶中豐富的氨基酸、二肽、三肽及寡肽迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期[10]。在140～160 min的發(fā)酵過程中，CK組的蛋白質(zhì)含量大幅度下降。這是因?yàn)槭葻徭溓蚓鷮?duì)氨基酸的利用受限，使得與其共同作用的保加利亞乳桿菌開始水解蛋白質(zhì)為肽類來供它生長(zhǎng)利用[23]；而添加了天麻提取液的蛋白質(zhì)含量變化幅度不大，這是因?yàn)樘炻楸旧砗胸S富的氨基酸[22]，所以發(fā)酵液中有氨基酸供給嗜熱鏈球菌生長(zhǎng)利用。在1 6 0 ～2 0 0 m i n 的發(fā)酵過程中，添加天麻提取液和C K 組的蛋白質(zhì)含量都大幅度下降，這是因?yàn)殡S著乳酸菌的生長(zhǎng)代謝，嗜熱鏈球菌開始進(jìn)入穩(wěn)定期，而伴隨著p H 值的下降，保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)代謝開始變得旺盛[11]。在2 4 0 ～7 4 0 m i n 的發(fā)酵過程中，二者的蛋白質(zhì)含量都趨于平穩(wěn)。這是因?yàn)檫M(jìn)入了發(fā)酵后期，保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)進(jìn)入了穩(wěn)定期[11]。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間段的蛋白質(zhì)含量變化圖

2.4 發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)被乳酸菌轉(zhuǎn)化的利用率

2.4.1 蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化利用率

根據(jù)發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)含量出現(xiàn)的最高點(diǎn)和最低點(diǎn)，可以算出發(fā)酵液中乳酸菌對(duì)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化利用率，如表3。

由表3中的數(shù)據(jù)可看出：添加天麻提取液蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化利用率為97.41%～97.71%，平均轉(zhuǎn)化利用率為97.56%，CK組蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化利用率為96.91%～97.25%，平均轉(zhuǎn)化利用率為97.14%。

2.4.2 轉(zhuǎn)化利用率的方差分析

為了進(jìn)一步分析添加天麻提取液蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率和對(duì)照組之間是否存在差異顯著性，采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析。蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化利用率在96.91%～97.71%之間，要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)見表4。

對(duì)表4中的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見表5。由表5可知，經(jīng)方差分析得F=31.38，查F臨界值表[24]，當(dāng)α=0.05，α=0.01，df1=1，df2=10時(shí)，F(xiàn)0.05（1，10）=4.96，F(xiàn)0.01（1，10）=10.04，可知F＞ F0.01（1，10），說明在1%顯著水平上，添加天麻提取液和對(duì)照組之間的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化利用率存在極顯著差異性。

表3 蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化利用率

表4 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化利用率的反正弦值

表5 反正弦值的方差分析

3 討論

通過試驗(yàn)中可以看出，添加天麻提取液的乳酸菌細(xì)胞較CK組的細(xì)胞大，同時(shí)數(shù)量多，添加天麻提取液的乳酸菌細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝快于CK組細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝。在兩種培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化率具有差異顯著性，添加天麻提取液的蛋白質(zhì)降解量為17 925.54 μg/mL，CK組為15 352.02 μg/mL ，二者的降解量相差2 573.52 μg/mL。添加天麻提取液乳酸菌培養(yǎng)基中起始蛋白質(zhì)的含量為18 371.78 μg/mL，CK組起始蛋白質(zhì)的含量為15 803.75 μg/mL，添加天麻提取液乳酸菌培養(yǎng)基中起始蛋白質(zhì)的含量高于CK 2 568.03 μg/mL。發(fā)酵結(jié)束后，兩組發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)含量相差不大，而發(fā)酵前添加天麻提取液中的蛋白質(zhì)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于CK組，說明天麻提取液有促進(jìn)乳酸菌降解轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)的作用。

本試驗(yàn)所用菌種是嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的混合菌種，利用兩種乳酸菌混合發(fā)酵，能促進(jìn)菌株的生長(zhǎng)繁殖。乳酸菌發(fā)酵牛乳的一個(gè)重要作用是產(chǎn)黏，黏度的產(chǎn)生是由于嗜熱鏈球菌不斷產(chǎn)酸，p H 值下降，造成酪蛋白的凝固，乳酸菌分泌的多糖，使發(fā)酵液呈現(xiàn)出均一、黏稠的狀態(tài)[25]。在共生過程中，保加利亞乳桿菌利用蛋白酶水解乳蛋白，產(chǎn)生小分子的肽和游離的氨基酸，為嗜熱鏈球菌提供相應(yīng)的氮[26]；同時(shí)嗜熱鏈球菌能為保加利亞乳桿菌提供生長(zhǎng)代謝所需的酸和C O2作為輔助因子，從而促進(jìn)其快速生長(zhǎng)[27]。混合發(fā)酵還能提高氨基酸和短肽的產(chǎn)量，使更多的風(fēng)味物質(zhì)得以生成，改善酸乳的品質(zhì)[28]。

本試驗(yàn)在乳酸菌的培養(yǎng)基中加入天麻提取液，測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間段內(nèi)發(fā)酵液中蛋白質(zhì)的含量，可知天麻對(duì)乳酸菌發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)的降解有促進(jìn)作用。天麻作用于人體的藥用功效研究較多，但在微生物方面的研究運(yùn)用未曾有過報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)利用天麻的其他用途提供理論依據(jù)，同時(shí)為豐富乳酸菌可利用代謝產(chǎn)物找到一條新的路徑。