張承啟，廖露露，齊永霞，丁克堅，陳莉

禾谷鐮孢核孔蛋白基因的功能分析

張承啟，廖露露，齊永霞，丁克堅，陳莉

安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院/作物有害生物綜合治理安徽省重點實驗室/植物病蟲害生物學(xué)與綠色防控安徽普通高校重點實驗室，合肥 230036

【】核孔蛋白Nup42在真核生物基因表達調(diào)控以及mRNA加工運輸?shù)壬飳W(xué)過程中發(fā)揮著重要作用，本研究旨在分析禾谷鐮孢（）中核孔蛋白基因在病原菌生長發(fā)育、逆境脅迫、致病和產(chǎn)毒等生物學(xué)過程中的功能。通過融合PCR（double-joint PCR）和酵母空隙修復(fù)（gap repair）技術(shù)分別構(gòu)建基因敲除和回補載體，再利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法獲得基因敲除突變體ΔFgNup42和回補體ΔFgNup42-C。觀察測定基因敲除突變體ΔFgNup42在營養(yǎng)生長、無性繁殖和有性生殖過程中的變化，同時測定突變體ΔFgNup42對滲透、殺菌劑以及細胞壁脅迫因子的敏感性。將突變體ΔFgNup42進行田間麥穗和室內(nèi)玉米花絲接種試驗明確其致病力情況。通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測ΔFgNup42的產(chǎn)毒能力，同時利用qRT-PCR比較分析參與單端孢霉烯族毒素生物合成的7個在野生型PH-1和基因敲除突變體ΔFgNup42中的相對表達量。表型測定發(fā)現(xiàn)，基因敲除突變體ΔFgNup42的生長速率只有野生型PH-1的50%，菌落邊緣菌絲分枝變多且致密。顯微觀察分生孢子形成情況，發(fā)現(xiàn)敲除突變體ΔFgNup42相較野生型PH-1分生孢子產(chǎn)量降低了85.45%，并且隔膜數(shù)在0—2的分生孢子比例明顯增多。有性生殖誘導(dǎo)結(jié)果顯示ΔFgNup42的有性生殖能力增強，較野生型產(chǎn)生了更多的子囊殼。突變體ΔFgNup42對滲透脅迫因子NaCl和KCl，細胞壁脅迫因子剛果紅，以及殺菌劑戊唑醇和氰烯菌酯的敏感性減弱。致病力分析發(fā)現(xiàn)敲除基因后菌體在麥穗和玉米花絲上的致病力嚴(yán)重降低。此外，與野生型相比，ΔFgNup42中毒素DON、3ADON和15ADON的合成量明顯減少。核孔蛋白基因在禾谷鐮孢生長發(fā)育、抵御逆境以及致病和產(chǎn)毒過程中發(fā)揮著重要作用。

禾谷鐮孢；；生長發(fā)育；環(huán)境脅迫；致病力

0 引言

【研究意義】由禾谷鐮孢復(fù)合種（species complex）引起的赤霉病嚴(yán)重威脅麥類作物的生產(chǎn)安全[1-2]，除了造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失外，病原菌還能夠在谷物籽粒中產(chǎn)生一系列的鐮刀菌毒素，包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）及其乙?；苌?ADON和15ADON，雪腐鐮刀菌烯醇（NIV）及其乙?；苌镉衩壮嗝瓜┩▃earalenone，ZEN），嚴(yán)重威脅食品安全和人畜生命健康[3-4]。自公布了禾谷鐮孢基因組數(shù)據(jù)以來[5]，該病原菌中涉及致病、產(chǎn)毒相關(guān)基因的分子生物學(xué)功能得到了充分的解析，隨著組學(xué)層面的研究以及A-to-I的RNA編輯的發(fā)現(xiàn)，禾谷鐮孢的生長發(fā)育、致病和毒素生物合成調(diào)控機制得到了進一步的闡釋[6-9]。真核生物細胞功能的發(fā)揮取決于mRNA準(zhǔn)確、有效地通過嵌在核膜上的核孔復(fù)合體從細胞核內(nèi)輸出到細胞質(zhì)中[10]。核孔復(fù)合體除了在細胞核與細胞質(zhì)之間進行物質(zhì)交換運輸外，該復(fù)合體中元件還扮演著與運輸無關(guān)的重要角色，包括基因表達調(diào)控、染色質(zhì)組裝、DNA修復(fù)和mRNA加工等生物學(xué)過程[11]。解析核孔復(fù)合體中相關(guān)蛋白在禾谷鐮孢形態(tài)建成、致病以及毒素生物合成過程中的作用，對揭示該病原菌生長發(fā)育、抵御逆境、產(chǎn)毒和致病的分子機理，以及進一步探索小麥赤霉病的綜合防控技術(shù)具有重要意義。【前人研究進展】遺傳信息的順利傳遞需要新轉(zhuǎn)錄和加工的mRNA通過核孔復(fù)合體（nuclear pore complexes，NPC）從細胞核輸出到細胞質(zhì)中。核孔復(fù)合體是貫穿核膜的大分子運輸機器，每個核孔復(fù)合體約由1 000個蛋白質(zhì)亞基（統(tǒng)稱為核孔蛋白，nucleoporins）組成[12]。核孔復(fù)合體融合貫穿在核膜中形成孔道，并同時生成由富含苯丙氨酸-甘氨酸重復(fù)序列（phenylalanine-glycine repeats，F(xiàn)G）組成的被動擴散屏障；每個核孔復(fù)合體由約60 MDa的對稱核心組成，該核心在胞質(zhì)面和核質(zhì)面分別被不同的蛋白質(zhì)進行修飾[13]。最早發(fā)現(xiàn)核孔復(fù)合體具有調(diào)控基因表達功能的試驗證據(jù)來自于釀酒酵母（），Menon等首次證明了核孔復(fù)合體中支架蛋白Nup84本身可以充當(dāng)轉(zhuǎn)錄激活因子[14]，隨后的研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母中其他的核孔蛋白也同樣參與了基因轉(zhuǎn)錄激活過程[15-16]。Nup42（又名Rip1）作為釀酒酵母中最早被鑒定的核孔蛋白之一，其與具有穿梭功能的RNA結(jié)合蛋白Rev的核輸出信號（nuclear export signal，NES）互作，促進了mRNA前體的剪接和輸出[17]。在釀酒酵母中，Nup42與mRNA輸出因子Gle1互作促使成熟的mRNA經(jīng)過核孔，由具有ATPase酶活性的DEAD-box蛋白Dbp5水解ATP提供能量，進而運輸至細胞質(zhì)[18-20]。在酵母和人類細胞中研究發(fā)現(xiàn)，Nup42具有兩個獨立功能的結(jié)構(gòu)域，即FG結(jié)構(gòu)域和CTD（carboxy-terminal domain）結(jié)構(gòu)域，其中FG結(jié)構(gòu)域與運輸受體Mex67-Mtr2互作招募成熟的mRNA[21-22]；CTD結(jié)構(gòu)域與mRNA輸出因子Gle1互作，可以向細胞質(zhì)中運輸熱激蛋白成熟的轉(zhuǎn)錄本[23-24]。當(dāng)人體細胞中同時缺失基因以及參與肌醇六磷酸合成的激酶基因時，熱激蛋白基因轉(zhuǎn)錄的mRNA則不能從細胞核輸出至細胞質(zhì)中，從而導(dǎo)致細胞出現(xiàn)對溫度敏感的缺陷[25]。當(dāng)在雙突變體ΔΔ中只轉(zhuǎn)入并表達Nup42的CTD結(jié)構(gòu)域時，能夠?qū)崿F(xiàn)熱激蛋白基因轉(zhuǎn)錄的mRNA正常輸出到細胞質(zhì)中，并且恢復(fù)了突變體ΔΔ對溫度敏感的缺陷[25-26]，但在細胞中只表達Nup42的FG結(jié)構(gòu)域時并不能恢復(fù)突變體Δ對溫度敏感的缺陷[21]。關(guān)于核孔蛋白Nup42的功能研究目前僅限于人類、哺乳動物和酵母等模式生物細胞，在植物病原真菌中未見報道。【本研究切入點】禾谷鐮孢中核孔蛋白Nup42由基因（FGSG_06067）編碼，核孔蛋白在真核生物基因表達調(diào)控以及mRNA加工運輸?shù)壬飳W(xué)過程中至關(guān)重要，但目前沒有相關(guān)研究報道禾谷鐮孢中核孔蛋白基因的生物學(xué)功能?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于同源重組原理和PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，獲得禾谷鐮孢基因敲除突變體ΔFgNup42以及回補突變體ΔFgNup42-C，明確在禾谷鐮孢生長發(fā)育、抵抗逆境、產(chǎn)毒和致病等方面的作用，為進一步探究禾谷鐮孢致病和毒素生物合成調(diào)控提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2018—2020年在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)國家農(nóng)作物品種審定特性鑒定站完成。

1.1 菌株及培養(yǎng)條件

禾谷鐮孢野生型菌株P(guān)H-1（NRRL 31084）、基因敲除突變體ΔFgNup42和回補突變體ΔFgNup42-C、質(zhì)粒PBS、neo-PYF11、酵母菌株XK-125以及大腸桿菌DH5均保存在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)國家農(nóng)作物品種審定特性鑒定站。供試馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）、完全培養(yǎng)基（complete medium，CM）、基本培養(yǎng)基（minimal medium，MM）、分生孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基CMC（carboxymethyl cellulose）等的配制方法參考鐮孢菌試驗手冊（laboratory manual）[27]。

1.2 化學(xué)試劑和儀器

DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；酵母轉(zhuǎn)化試劑盒購自MP Biomedicals公司；酵母質(zhì)粒提取試劑盒購自Solarbio公司；潮霉素B購自Roche公司；引物、膠回收試劑盒、G418等常規(guī)生化試劑均采購于上海生工生物工程有限公司。

PCR儀，C1000 Touch，Bio-Rad公司；電泳儀，Powerpac HV，Bio-Rad公司；凝膠成像儀，Chemidoc，Bio-Rad公司；熒光倒置顯微鏡，Ti-S，尼康；移液器及臺式離心機，Eppendorf公司。

1.3 基因敲除及回補突變體的獲得

在禾谷鐮孢基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（https://fungidb.org/fungidb/）檢索基因的上下游片段序列以及編碼區(qū)序列，并設(shè)計相關(guān)引物（表1）。首先PCR擴增出基因編碼區(qū)上下游序列各約800 bp，以質(zhì)粒PBS為模板擴增潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（）；然后通過融合PCR（double-joint PCR）技術(shù)，按照上游、、下游的順序連接成一個重組DNA片段，從而構(gòu)建出基因敲除打靶片段[28]；最后利用同源重組原理和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法[29]，將重組DNA片段轉(zhuǎn)入野生型PH-1中，在含有100 μg·mL-1潮霉素B的PDA培養(yǎng)基中篩選轉(zhuǎn)化子并用表1中的鑒定引物鑒定出敲除轉(zhuǎn)化子。

表1 本研究所用到的引物

利用表1中引物Nup42-GFP-F/Nup42-GFP-R擴增基因的啟動子至開放閱讀框的DNA片段，使用酵母轉(zhuǎn)化試劑盒將所得的PCR產(chǎn)物與經(jīng)Ⅰ線性化的質(zhì)粒neo-pYF11共轉(zhuǎn)化進入XK1-25酵母中構(gòu)建重組質(zhì)粒[30-31]；然后，鑒定并提取陽性酵母菌株中的質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5中；最后，提取大腸桿菌質(zhì)粒經(jīng)PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化至敲除突變體ΔFgNup42中，通過G418（100 μg·mL-1）篩選并經(jīng)PCR鑒定回補轉(zhuǎn)化子。

1.4 菌落形態(tài)、無性繁殖及有性生殖觀測

菌落形態(tài)觀察：菌株于PDA平板上培養(yǎng)3 d，打孔器取直徑5 mm的菌碟分別接種于PDA、MM、CM的9 cm平板中，25℃培養(yǎng)3 d拍照，每次重復(fù)3皿，試驗重復(fù)3次。

邊緣菌絲觀察：將滅菌潔凈的載玻片浸潤在融化狀態(tài)的CM培養(yǎng)基中迅速取出放置暗盒中使其表面培養(yǎng)基凝固，取直徑3 mm的菌碟于載玻片上，每個菌株重復(fù)5個玻片，25℃培養(yǎng)16—20 h后取出載玻片于顯微鏡下觀察邊緣菌絲形態(tài)并拍照。

分生孢子產(chǎn)量及隔膜數(shù)統(tǒng)計：從新鮮活化的菌落邊緣打孔取5個直徑5 mm的菌碟接種到分裝有30 mL CMC培養(yǎng)液的50 mL三角瓶中，每個菌株3瓶，25℃，180 r/min搖培7 d。血球計數(shù)板統(tǒng)計孢子數(shù)量，試驗重復(fù)3次。吸取CMC培養(yǎng)液中的分生孢子，熒光增白劑（calcofluor white，CFW）染色，顯微鏡下統(tǒng)計不同隔膜數(shù)孢子的數(shù)量，每個菌株分別統(tǒng)計300個分生孢子。

有性生殖觀測：將菌碟接種于胡蘿卜培養(yǎng)基中，4個重復(fù)，25℃培養(yǎng)至所有菌株都長滿整個培養(yǎng)基，刮凈培養(yǎng)基表面的氣生菌絲，加入800 μL 0.1% Tween-20均勻涂抹在培養(yǎng)基表面，晾干后放置黑光燈下25℃培養(yǎng)20 d，觀察統(tǒng)計子囊殼數(shù)量及子囊孢子形態(tài)并拍照。

1.5 脅迫因子敏感性測定

從活化于PDA中生長3 d的菌落邊緣取直徑5 mm的菌碟分別接種于含1 mol·L-1NaCl、1 mol·L-1KCl、0.2 g·L-1剛果紅、0.25 μg·mL-1戊唑醇和0.25 μg·mL-1氰烯菌酯的PDA平板上，25℃培養(yǎng)3 d后拍照，每次重復(fù)3個皿，試驗重復(fù)3次。

1.6 致病力和毒素測定

麥穗接種：在小麥（感病品種安農(nóng)8455）抽穗揚花盛期，注射10 μL孢子懸浮液（106孢子/mL）到麥穗中部小穗的花藥中，每天早晚各噴灌一次，15 d后統(tǒng)計發(fā)病情況并拍照記錄，每個菌株重復(fù)30株麥穗。

玉米花絲接種：將4根新鮮的玉米花絲彼此成一束，每束玉米花絲長度為10 cm，成束排列在經(jīng)無菌蒸餾水潤濕的濾紙上。玉米花絲束中央放置一個直徑為5 mm的菌碟，5個重復(fù)，25℃保濕7 d，拍照。毒素的提取和測定方法參考Ji等[32]。

1.7 TRI表達分析

于PDA中生長3 d的菌落邊緣取5個直徑為5 mm的菌碟，置于分裝有30 mL誘導(dǎo)產(chǎn)毒培養(yǎng)基（trichothecene biosynthesis induction，TBI）的三角瓶中，錫箔紙包裹避光，25℃，180 r/min搖培48 h[33]。過濾收集TBI中的菌絲并在液氮中充分研磨，提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄。利用表1中相關(guān)引物，qRT-PCR確定的表達水平，試驗重復(fù)3次。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2010計算菌落生長抑制率、分生孢子產(chǎn)量、子囊殼數(shù)量以及毒素含量，數(shù)據(jù)采用Fisher’s最小顯著差數(shù)法進行分析（=0.05）。

2 結(jié)果

2.1 敲除FgNup42對禾谷鐮孢營養(yǎng)生長的影響

基因缺失突變體ΔFgNup42在培養(yǎng)基PDA、MM和CM上的生長速率與野生型PH-1、回補突變體ΔFgNup42-C相比降低了約50%（圖1-a、1-b）。通過觀察菌落邊緣形態(tài)特征發(fā)現(xiàn)，敲除突變體ΔFgNup42相較野生型，邊緣菌絲分枝變多且致密（圖1-c），結(jié)果表明的缺失嚴(yán)重影響了禾谷鐮孢的生長速率以及菌落的形態(tài)特征。

2.2 FgNup42參與禾谷鐮孢分生孢子的發(fā)育

經(jīng)熒光增白劑（CFW）染色，顯微鏡觀察誘導(dǎo)產(chǎn)孢培養(yǎng)基CMC中分生孢子的形態(tài)發(fā)現(xiàn)，基因敲除突變體ΔFgNup42產(chǎn)生的分生孢子隔膜數(shù)與野生型相比明顯變少（圖2-a）；通過統(tǒng)計分析不同隔膜數(shù)分生孢子所占的比例發(fā)現(xiàn)，突變體ΔFgNup42中0—2個隔膜的分生孢子比例較野生型和回補體明顯增加（圖2-b）。血球計數(shù)板統(tǒng)計各菌株的分生孢子產(chǎn)量發(fā)現(xiàn)，敲除突變體ΔFgNup42的產(chǎn)孢量顯著降低，只有野生型PH-1的14.55%（圖2-c）。

a：PH-1、敲除突變體ΔFgNup42和回補體ΔFgNup42-C在培養(yǎng)基PDA、CM和MM中25℃生長3 d PH-1, ΔFgNup42 deletion mutant and ΔFgNup42-C complemented strains were grown on PDA, CM and MM at 25℃ for 3 d；b：菌株P(guān)H-1、ΔFgNup42和ΔFgNup42-C在PDA培養(yǎng)基中的生長速率比較Comparison of mycelial growth rates among PH-1, ΔFgNup42 and ΔFgNup42-C strains on PDA medium；c：PH-1、ΔFgNup42和ΔFgNup42-C的菌落邊緣菌絲生長情況Hyphal growth at the edges of PH-1, ΔFgNup42 and ΔFgNup42-C colonies

2.3 敲除基因FgNup42對有性生殖的影響

在禾谷鐮孢侵染小麥的過程中，子囊孢子作為重要的初侵染源在病害循環(huán)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[34]。因此，筆者觀測了野生型PH-1、基因缺失突變體ΔFgNup42以及回補突變體ΔFgNup42-C子囊殼以及子囊孢子的形成狀況。經(jīng)過20 d的有性生殖誘導(dǎo)，敲除突變體ΔFgNup42產(chǎn)生的子囊殼數(shù)量顯著多于野生型和回補體（圖3-a、3-b）。于載玻片上壓開子囊殼后觀察發(fā)現(xiàn)，野生型PH-1、敲除突變體ΔFgNup42和回補突變體ΔFgNup42-C在子囊以及子囊孢子的形態(tài)特征上沒有明顯差異（圖3-c），說明基因的缺失不影響子囊以及子囊孢子的形態(tài)。

2.4 FgNup42參與禾谷鐮孢對滲透、細胞壁以及殺菌劑脅迫的敏感性

Nup42作為細胞核孔的重要組分，而核孔又是物質(zhì)進出細胞核與細胞質(zhì)的重要通道[13]，因此測定了基因敲除突變體ΔFgNup42對滲透脅迫（1 mol·L-1NaCl和1 mol·L-1KCl）、細胞壁脅迫（0.2 g·L-1剛果紅）以及殺菌劑（0.25 μg·mL-1戊唑醇和0.25 μg·mL-1氰烯菌酯）的敏感性，發(fā)現(xiàn)ΔFgNup42相較野生型對NaCl、KCl、剛果紅、戊唑醇以及氰烯菌酯的抗性顯著增加（圖4）。

2.5 FgNup42的缺失對禾谷鐮孢致病和產(chǎn)毒的影響

為了明確在禾谷鐮孢致病過程中的功能，對野生型PH-1、敲除突變體ΔFgNup42以及回補突變體ΔFgNup42-C在麥穗和玉米花絲上進行了致病力測定。田間麥穗接種發(fā)現(xiàn)突變體ΔFgNup42的致病力顯著下降，僅局限于小穗發(fā)?。▓D5-a）；通過室內(nèi)接種玉米花絲發(fā)現(xiàn)，ΔFgNup42在玉米花絲上的侵染擴展程度相比野生型和回補體同樣明顯下降（圖5-b）。DON毒素及其衍生物是禾谷鐮孢的關(guān)鍵致病因子[35]，由于敲除基因后導(dǎo)致病原菌致病力嚴(yán)重下降，因此筆者測定了PH-1、ΔFgNup42以及ΔFgNup42-C的產(chǎn)毒能力。結(jié)果顯示，ΔFgNup42產(chǎn)生的毒素量DON、3ADON以及15ADON顯著低于野生型和回補菌體（圖5-c）。為了進一步證實該結(jié)果，測定了參與DON毒素生物合成途徑中各的表達量，與野生型相比，ΔFgNup42中7個基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低（圖5-d）。上述結(jié)果表明，F(xiàn)gNup42通過調(diào)節(jié)禾谷鐮孢中的表達來調(diào)控毒素的生物合成。

a：PH-1、ΔFgNup42和ΔFgNup42-C在添加1 mol·L-1 NaCl、1 mol·L-1 KCl、0.2 g·L-1剛果紅、0.25 μg·mL-1戊唑醇和0.25 μg·mL-1氰烯菌酯的PDA培養(yǎng)基中25℃生長3 d的比較Comparison of PH-1, ΔFgNup42 and ΔFgNup42-C following incubation at 25℃ for 3 d on PDA plates supplemented with 1 mol·L-1NaCl, 1 mol·L-1KCl, or 0.2 g·L-1Congo red, 0.25 μg·mL-1 tebuconazole and 0.25 μg·mL-1phenamacril；b：菌株在含有NaCl、KCl、剛果紅、戊唑醇和氰烯菌酯的PDA培養(yǎng)基中生長3 d相較對照組的菌絲生長抑制率Mycelial growth inhibition compared with non-treated controls following incubation for 3 d on PDA containing NaCl, KCl, Congo red, tebuconazole and phenamacril

3 討論

核孔復(fù)合體控制著生物大分子在細胞核與細胞質(zhì)之間的運輸，在mRNA輸出至細胞質(zhì)的最后一步，DEAD-box解旋酶Dbp5（人類細胞中叫做DDX19）被核孔蛋白Nup42、Gle1和Nup214激活，可從mRNA顆粒中去除RNA結(jié)合蛋白Nxf1·Nxt1，從而使成熟的mRNA順利到達細胞質(zhì)完成翻譯[13]。編碼一個核孔蛋白，該蛋白最早被鑒定到與釀酒酵母中表達的HIV-1 Rev的效應(yīng)子互作[17,36]。雖然有關(guān)Nup42的生化功能在釀酒酵母和人類細胞中研究得比較透徹[11,37]，但是有關(guān)分子遺傳學(xué)方面的功能尚未在植物病原真菌中研究報道。

本研究發(fā)現(xiàn)禾谷鐮孢基因缺失突變體ΔFgNup42生長速率與野生型相比明顯減慢，但是在釀酒酵母中并非其生長所必需[36]。此外，突變體ΔFgNup42在無性繁殖過程中出現(xiàn)嚴(yán)重缺陷，分生孢子產(chǎn)量顯著減少并且不同隔膜的分生孢子比例分布發(fā)生了明顯的分化。但ΔFgNup42的有性生殖能力增強了，相較野生型菌株產(chǎn)生了更多的子囊殼，同時子囊孢子的形態(tài)正常，可能因為敲除基因致使禾谷鐮孢有絲分裂相關(guān)基因的表達受到抑制，而減數(shù)分裂過程得到了促進，此現(xiàn)象背后的調(diào)控機制有待進一步研究。突變體ΔFgNup42對外界滲透壓、細胞壁脅迫以及殺菌劑的敏感性發(fā)生了變化，禾谷鐮孢參與菌體抵御外界環(huán)境脅迫，很可能由于基因的缺失導(dǎo)致相關(guān)信號通路的轉(zhuǎn)錄因子Hog1[38]、Slt2[39]、FgSR[40]以及FgTfml[41]從細胞質(zhì)進入細胞核受阻，這與Nup42在釀酒酵母中同源基因缺失突變體Δ抵抗逆境脅迫因子類似[11,26]。除了在生長發(fā)育過程中出現(xiàn)的缺陷外，ΔFgNup42在寄主植物上的致病力嚴(yán)重降低，雖然敲除了基因后使菌體的生長速率減慢了50%，但是突變體ΔFgNup42在麥穗上的致病僅局限于單個小穗，沒有向周圍小穗擴展，說明ΔFgNup42致病力的缺陷并不是由生長速率降低引起的。通過測定菌株產(chǎn)毒能力的變化發(fā)現(xiàn)，ΔFgNup42在發(fā)病麥粒中3種毒素（DON、3ADON和15ADON）合成量顯著減少，而毒素是禾谷鐮孢關(guān)鍵的致病因子，幫助其在寄主中擴展蔓延[35,42]，因此可以推斷ΔFgNup42致病力的降低主要是其毒素合成能力的下降所導(dǎo)致的。突變體ΔFgNup42中參與DON毒素生物合成的表達量的顯著降低更加證實了其毒素合成能力的缺陷，關(guān)于核孔蛋白FgNup42調(diào)控DON毒素生物合成的轉(zhuǎn)錄及出核運輸機制有待于進一步研究。

a：PH-1、ΔFgNup42和ΔFgNup42-C在麥穗上的發(fā)病癥狀Disease symptoms on wheat heads caused by PH-1, ΔFgNup42 and ΔFgNup42-C；b：PH-1、ΔFgNup42和ΔFgNup42-C接種玉米花絲致病情況Maize silks inoculated with PH-1, ΔFgNup42 and ΔFgNup42-C；c：各菌株于接種侵染的麥穗籽粒中單端孢霉烯族毒素的產(chǎn)量Levels of trichothecene mycotoxins produced by each strain in infected spikelets collected from inoculated wheat heads；d：7個TRI在PH-1和ΔFgNup42中的相對表達量Relative transcription levels of 7 TRIs in PH-1 and ΔFgNup42

4 結(jié)論

通過基因敲除與回補的方法研究了禾谷鐮孢中基因的功能，的缺失導(dǎo)致禾谷鐮孢生長速率降低，分生孢子產(chǎn)量減少，有性生殖能力變強，對滲透、細胞壁以及殺菌劑的脅迫敏感性變?nèi)酰舅睾铣赡芰ο陆低瑫r致病力嚴(yán)重降低。

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Functional analysis of the nucleoporin gene

ZHANG Chengqi, LIAO Lulu, QI Yongxia, DING Kejian, CHEN Li

School of Plant Protection, Anhui Agricultural University/Anhui Province Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops/Key Laboratory of Biology and Sustainable Management of Plant Diseases and Pests of Anhui Higher Education Institutes, Hefei 230036

【】The nucleoporin Nup42 plays important roles in gene expression regulation, nuclear mRNA processing and export. The objective of this study is to analyze the function of the nucleoporin genegrowth and development, stress, pathogenicity and mycotoxins production of.【】Targeted gene deletion and mutant complementation constructs were generated using the double-joint PCR and yeast gap repair methods, respectively. Then the gene deletion mutant ΔFgNup42 and complemented strain ΔFgNup42-C were obtained by PEG-mediated protoplast transformation. The vegetative growth, asexual and sexual reproduction of the gene disrupted mutant ΔFgNup42 were examined. Moreover, the sensitivity of ΔFgNup42 to osmotic stress, fungicides and cell wall damaging agent were investigated. Pathogenicity of the mutant ΔFgNup42 was assayed by point-inoculated the flowering wheat heads and incubation on maize silks. Mycotoxins produced by ΔFgNup42 were quantified using the liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method. The relative transcription levels of 7s involved in trichothecene mycotoxins biosynthesis were determined by qRT-PCR between PH-1 and ΔFgNup42.【】Phenotype analysis showed that the growth rate of ΔFgNup42 was 50% of that of wild type PH-1, but more dense in hyphal branching. Microscopic examination revealed that the conidiation of ΔFgNup42 mutant decreased by 85.45% compared with the wild type PH-1, and percentage of conidia with septum range 0 to 2 was significantly increased. The ΔFgNup42mutant produced more perithecia than the wild type strain in mating cultures suggesting improved sexual reproduction. The mutant ΔFgNup42displayed increased tolerance to osmotic stress NaCl and KCl, fungicides tebuconazole and phenamacril, also cell wall damaging agent Congo red. Pathogenicity assays exhibited that disruption of genecaused a dramatic reduction in pathogenicity by inoculated the flowering wheat heads and maize silks. Furthermore, the amount of mycotoxins DON, 3ADON and 15ADON produced by ΔFgNup42 were significantly lower than that produced by wild type.【】The nucleoporin geneplays a key role in fungal growth and development, pathogenesis, mycotoxins production and responses to various environmental stresses in

;; growth and development; environmental stress; pathogenicity

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.09.007

2020-09-14；

2020-09-24

國家重點研發(fā)計劃（2018YFD0200500）

張承啟，E-mail：zhcq@ahau.edu.cn。通信作者陳莉，E-mail：chenlii@ahau.edu.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）