溫爭爭 左 閃 陳 夢 周紅學 孫國華馮艷微 王衛(wèi)軍 楊建敏

(1. 上海海洋大學 水產科學國家級實驗教學示范中心 上海 201306；2. 上海海洋大學上海水產養(yǎng)殖工程技術研究中心 上海 201306；3. 魯東大學農學院 煙臺 264025；4. 山東省農業(yè)農村廳 濟南 250013；5. 煙臺海育海洋科技有限公司 煙臺 264001)

刺參(Apostichopus j aponicus)是我國重要的水產養(yǎng)殖物種之一，自然分布在35～44°N 的西北太平洋沿岸，包括中國黃渤海海域、俄羅斯東部沿岸、日本和韓國沿岸。刺參是典型的溫帶種類，水溫變化對刺參的攝食、代謝和生殖發(fā)育等各種生理活動有重要影響(曹學順, 2014)。溫度過高或過低都不適宜刺參的生長，尤其是在高溫逆境環(huán)境中，刺參的活動和攝食降低，甚至體內自由基代謝紊亂、病變死亡(謝兆文等,2016; 高楊, 2017)。溫度變化對刺參生理變化、生長發(fā)育和遺傳變化的影響研究一直受到廣泛關注。

表觀遺傳學是一種不改變DNA 序列的可遺傳變異，它的調節(jié)機制主要包括DNA 甲基化修飾、組蛋白修飾、染色體重塑、非編碼RNA 調控等，這些修飾方式之間相互作用、共同調節(jié)基因組的功能(Crabtree,2020; Kulis et al, 2010)，且這些表觀遺傳修飾極易受到環(huán)境的誘導(康靜婷等, 2013)。DNA 甲基化是基因組DNA 的一種重要修飾方式，通過影響核酸空間構象、穩(wěn)定性及其與蛋白質相互作用方式參與基因表達調控，進而參與細胞的生長發(fā)育、逆境脅迫應答等過程(鐘焱等, 2019)。在水產動物中，環(huán)境通過影響DNA甲基化水平進而影響基因表達，從而使生物的生理活動及表型發(fā)生變化以適應環(huán)境(McGhee et al, 2014)。Navarro-Martin 等(2011)研究發(fā)現，DNA 甲基化介導了溫度影響歐洲鱸魚(Dicentrarchus l abrax)性別變化的生物學過程；吳彪等(2016)研究表明，蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)受到急性升溫脅迫處理后，基因組DNA 總甲基化率下降；Li 等(2017)發(fā)現，鹽脅迫處理半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)肝臟后，生長相關基因igf1 的外顯子甲基化水平與其表達水平呈負相關。在刺參應對逆境響應方面，也有研究發(fā)現，DNA 甲基化在其中發(fā)揮重要的調控作用。高杉等(2017)采用甲基化敏感擴增多態(tài)性技術(MSAP)分析了健康和“化皮病”刺參體壁組織的甲基化水平差異。李尚俊等(2017)研究發(fā)現，在高溫環(huán)境下，刺參的表觀修飾相關基因(DNMT1、HDAC3 和MLL5)的表達量發(fā)生顯著變化。趙業(yè)(2015)研究發(fā)現，刺參夏眠期的甲基化水平高于非夏眠期。鄒榮婕等(2014)發(fā)現，經啉類藥物處理的刺參組織DNA 甲基化水平低于對照組，說明DNA 甲基化在刺參應對外界刺激的重要作用。

本研究采用全基因組重亞硫酸鹽測序技術(WGBS)，對不同溫度處理的刺參的消化道組織的全基因組C 位點甲基化水平進行檢測，探討溫度變化對刺參基因組DNA 甲基化的影響。同時，以刺參的體壁、消化道、縱肌和呼吸樹為實驗材料，通過甲基化酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測，分析溫度對刺參不同組織的甲基化程度的影響，探究刺參DNA 甲基化調控與組織特異性的相關性，以期從DNA 甲基化水平解釋刺參響應溫度變化的生理過程，為深入研究環(huán)境與表觀遺傳變異的關系及逆境響應機理提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用2 齡刺參由山東省東營市華春漁業(yè)有限公司提供，體質量為(130.3±5.5) g，從養(yǎng)殖池塘養(yǎng)殖群體中隨機采集，定時投喂飼料，每日換水量為1/3，養(yǎng)殖期間持續(xù)充氣。

1.2 養(yǎng)殖實驗與樣品采集

實驗用刺參在水溫為(20.0±0.5)℃的實驗室條件下暫養(yǎng)5 d，暫養(yǎng)結束后，分組進行不同溫度養(yǎng)殖實驗，對照組(T20)刺參在(20.0±0.5)℃水溫下持續(xù)養(yǎng)殖至取樣；實驗A 組(T26)從水溫(20.0±0.5)℃以0.6℃/d的速度在10 d 內提高至(26.0±0.5)℃后，維持養(yǎng)殖至取樣；實驗B 組(T32)從水溫(20.0±0.5)℃以0.6℃/d的速度10 d 內提高至(26.0±0.5)℃后，再以2℃/d 的速度在3 d 內提高至(32.0±0.5)℃，保持2 d。每個實驗組設置3 個平行，所有實驗組刺參樣品15 d 養(yǎng)殖實驗后取樣，每個平行組取10 個刺參，分別剖取呼吸樹、縱肌、消化道和體壁組織，并用滅菌生理鹽水(1.5% NaCl)沖洗，置于2 ml 凍存管后迅速放入液氮罐中，送回實驗室，保存于-80℃。

1.3 基因組DNA 的提取

DNA 提取采用天根生化科技(北京)有限公司的海洋動物組織基因組DNA 提取試劑盒，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 完整性，使用紫外分光光度計檢測DNA 的濃度和純度，將各組樣品的濃度調整為100～200 ng/μl，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 高溫處理后消化道的全基因組DNA 甲基化測序

重亞硫酸鹽WGBS 實驗步驟參考郭添福等(2018)的高分辨率甲基化分析方法，進一步對樣品進行DNA甲基化定量。主要構建流程包括：檢測合格的刺參消化道基因組DNA 樣品，首先，用超聲波打成平均大小為200～300 bp 的片段，對打斷后的DNA 片段進行末端修復、腺苷酸化，并添加接頭；隨后，進行Bisulfite處理(EZ DNA Methylation GoldTMKit, Zymo Research)，經處理后，未發(fā)生甲基化的C 變成U，而甲基化的C 保持不變；最后，對單鏈DNA 片段進行PCR 擴增(KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix)得到DNA 文庫，庫檢合格后，利用Illumina HiSeq 進行高通量測序，測序讀長PE150，構建Bisulfite 全基因組甲基化圖譜，測序在北京諾禾致源有限公司完成。

1.5 ELISA 測定不同組織DNA 甲基化水平

提取刺參縱肌、呼吸樹、消化道和體壁4 個組織的基因組DNA，利用Zymo Research 公司的5-mC DNA ELISA 試劑盒檢測相應樣品基因組DNA 甲基化水平。具體實驗步驟：待測樣品基因組DNA 和標準品(100 ng)均稀釋成100 μl 反應液，于PCR 儀98℃變性5 min，冰浴10 min，移至96 孔板，37℃孵育1 h，緩沖液洗板3 次，37℃孵育30 min。最后，加入甲基化胞嘧啶抗體，37℃孵育1 h，洗板同上，并進行顯色反應，酶標儀檢測樣品吸光度。

1.6 數據統(tǒng)計與分析

測序結果的甲基化水平計算：ML=mC/(mC+umC)。其中，ML 為甲基化水平，mC 和umC 分別代表覆蓋區(qū)域甲基化C 位點和未甲基化C 位點的read數目。所有實驗結果均來自至少3 次獨立實驗，結果為均值±標準差(x±SD)。運用SPSS 19.0 軟件對各個組的甲基化水平進行ANOVA 分析和Duncan 多重比較，獲得兩兩之間的統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。

ELISA 測定DNA 甲基化水平，通過制備陰性對照(100 ng/μl)和陽性對照(100 ng/μl)的混合物來制備已知5-mC 不同百分比的(5%、10%、25%、50%、75%和100%)標準品，根據標準品吸光度值所繪制的標準曲線，即可得到各個樣品的整體甲基化水平。

2 結果

2.1 不同處理下刺參消化道DNA 甲基化模式分析

由全基因組DNA 甲基化測序(WGBS)結果(表1)可知，刺參消化道組織的常溫對照組T20 基因組的甲基化位點數為5050974 個，T26 組的基因組甲基化位點數為5315261，T32 組基因組的甲基化位點數為4714193 個。在所有的處理組和對照組中，CpG(簡寫CG)類型甲基化位點數目為4563209～5134931，也有一定數量的甲基化胞嘧啶發(fā)生在 CHH 位點(116612～141870)，而CHG 類型甲基化位點相對較少(34372～42059)。

T20、T26 和T32 溫度組的全基因組總甲基化水平分別為(1.70±0.01)%、(1.79±0.11)%和(1.59±0.04%)(表2)，T26 組基因組的總甲基化水平表現為上升，T32組基因組的總甲基化水平表現為下降，且低于T20組，方差分析表明，T26 組的總甲基化水平和T32 組存在顯著差異(P＜0.05)。對不同類型的甲基化來說，C 堿基甲基化水平表現出與總甲基化水平一致的趨勢，T26 組CG 類型C 堿基甲基化水平較T20 升高，而T32 組較T26 組降低，且差異顯著(P＜0.05)。在2種非CG 類型的甲基化模式中，CHG 類型T20 組與T32 組存在顯著差異(P＜0.05)，CHH 類型中3 組差異不大，且都呈現低甲基化的變異模式。大部分DNA甲基化發(fā)生在CG 類型的C 堿基上，CG 類型的C 堿基DNA 甲基化程度為13.32%～14.99%，顯示中等的DNA 甲基化水平。

表1 甲基化位點數目及類型Tab.1 Number and type statistics of methylation sites

表2 不同溫度下刺參全基因組甲基化水平Tab.2 The methylation levels of C bases of Apostichopus japonicus at different temperature (%)

對3 個溫度下CG、CHH 和CHG 位點甲基化與總體甲基化占比情況進行統(tǒng)計，結果見圖1。mCG 類型甲基化百分比均在96%以上，mCHH 類型甲基化百分比在T20、T26 和T26 組樣品分別為2.79%、2.42%和2.57%，mCHG 類型甲基化百分比最少，均在1%以下。

根據測得的甲基化比例，統(tǒng)計不同甲基化水平的甲基化位點中3 種類型占各自類型的百分比可以看出(圖2)，在甲基化水平為30%時，處于這一水平的CHG 和CHH 甲基化位點分別占本類型的30%左右，為最高點，且顯著高于CG 類型，之后隨著位點甲基化水平的增高，其所占百分比下降；而隨著甲基化位點甲基化水平的增高，CG 類型的百分比總體呈明顯的增高趨勢，在甲基化水平為100%時，占比達到該類型的最高點。

圖1 不同溫度條件下甲基化C 位點的數量及其占總甲基化C 位點的比例Fig.1 The number of methylated C sites and their proportion to the total methylated C sites in different sequence environments

圖2 所有樣本甲基化位點水平分布Fig.2 The level distribution of methylation sites in all samples

2.2 不同溫度下刺參組織間甲基化水平比較

采用5-mC DNA ELISA Kit 試劑盒檢測不同溫度條件下刺參的呼吸樹、消化道、縱肌和體壁4 種組織的基因組的甲基化水平，并進行不同組間方差分析。數據顯示，在3 種不同溫度下，刺參呼吸樹和消化道組織的甲基化水平范圍為(2.68±0.10)%～(3.29±0.06)%，均高于縱肌和體壁組織，其中，體壁的甲基化水平在(2.05±0.15)%～(2.11±0.11)%之間，縱肌的甲基化水平最低，為(1.68±0.07)%～(1.76±0.03)%。各組織的總甲基化水平從高到低依次為呼吸樹＞消化道＞體壁＞縱肌(圖3)。不同溫度對刺參組織的甲基化水平有所改變，T26 組刺參樣品消化道和呼吸樹組織的甲基化水平顯著高于T20 對照組(P＜0.05)，T32 組刺參樣品消化道和呼吸樹組織的甲基化水平又顯著低于T26 對照組(P＜0.05)。呼吸樹和消化道組織的甲基化水平總體呈一致趨勢，在溫度從20℃升至26℃時，甲基化水平升高，而溫度繼續(xù)升至32℃時，甲基化水平下降；而縱肌和體壁組在3 個溫度下的甲基化水平各組間均無顯著差異。

圖3 不同溫度下5-mC 甲基化試劑盒檢測各組織DNA 甲基化水平變化Fig.3 Using 5-mC methylation kit to detect tissues DNA methylation levels under different experimental conditions

3 討論

3.1 不同溫度對刺參基因組DNA 甲基化的影響

研究結果表明，DNA 甲基化參與了海洋動物環(huán)境脅迫適應性機制，諸如鹽度(環(huán)朋朋, 2018)、重金屬(周新文等, 2001)、溫度(侯艷雯等, 2019; 王藝雅,2015)等環(huán)境因子的逆境脅迫下，甲基化會有明顯差異。Flores 等(2013)提出，環(huán)境誘導影響DNA 甲基化的變異，可能通過增加基因組被標記區(qū)域的突變性，改變生物的表型，使其適應自然選擇。溫度一直是影響水產動物生存的重要因素，在不同溫度條件下，基因組內的甲基化變異能夠通過改變某些特定功能基因DNA 甲基化狀態(tài)來影響基因的轉錄，進而調節(jié)生物體內脅迫響應機制等來提高動物的耐寒性或耐熱性。朱華平等(2013)分析了耐寒羅非魚(Oreochroms mossambcus)與正常組基因組DNA 甲基化的差別，結果表明，低溫誘導DNA 總甲基化下降，同時主要發(fā)生去甲基化過程。吳彪等(2016)研究發(fā)現，蝦夷扇貝受到急性升溫脅迫處理后，基因組DNA 總甲基化率下降。王翠麗(2019)研究發(fā)現，高溫脅迫過程中，近江牡蠣(Ostrea rivular is)的核心啟動子甲基化水平與Hsp90 基因的表達呈負相關?？讓?2016)研究發(fā)現，在溫度、鹽度脅迫下，皺紋盤鮑(Haliotis discus)的表觀遺傳結構發(fā)生改變，調控相關抗逆基因表達。這些研究結果均表明，溫度變化可誘導水產動物基因或組織的甲基化狀態(tài)發(fā)生改變。

本研究通過WGBS 和ELISA 對刺參消化道等組織甲基化水平進行檢測發(fā)現，不同溫度下刺參組織中的甲基化水平有所改變，刺參消化道組織和呼吸樹組織的T26 組甲基化水平最高。刺參在26℃養(yǎng)殖環(huán)境下處于夏眠或生理代謝活動較弱的狀態(tài)，這期間刺參消化、呼吸等生理代謝活動調節(jié)減弱(Gao et a l,2008)。處于休眠狀態(tài)的T26 組刺參基因組甲基化水平的增高，一定程度上說明刺參這些組織中的一些功能基因受到甲基化調節(jié)而表達水平下降，相應地，減弱其參與調控的生理代謝活動來維持刺參的休眠狀態(tài)。刺參消化道組織和呼吸樹組織的T32 組甲基化水平較T26 組降低。32℃是對刺參生命活動產生危害的脅迫溫度，在這個溫度下，刺參會發(fā)生系列應激反應以自我保護，生理反應和活動變化意味著刺參體內需要啟動一系列轉錄表達和調控，而甲基化水平的降低調節(jié)可能起重要作用。

3.2 刺參基因組甲基化模式

DNA 甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾，主要有3 種類型：CG、CHG 和CHH。在動物中，胞嘧啶的甲基化多發(fā)生于CpG 二核苷酸序列中，CG 是主要甲基化修飾類型，非CG 類型的序列(CHH 和CHG)在基因中十分少見(Cokus et al, 2008; Zhang et al,2015)。脊椎動物通常存在于基因間區(qū)和富含重復序列的區(qū)域，而在無脊椎動物中，DNA 甲基化主要發(fā)生于基因內部，基因間區(qū)大部分未被甲基化(Schaefer et al, 2010)。在胚胎干細胞研究(Lister et al, 2009)中，CHG 和CHH 型的甲基化位點分別占17.3%和7.2%，Sun 等(2014)檢測到櫛孔扇貝(Chlamys fa rreri)基因組中，分別有14.9%～16.5%的CpG 類型和5.1%～6.3%的CHG 類型的甲基化位點。不同溫度條件下的刺參消化道DNA 樣品經過重亞硫酸鹽處理后，進行WGBS測序分析，甲基化位點類型分析顯示，在所有甲基化胞嘧啶(mCs)中，有超過96%的CpGs，且CG 類型的C 堿基呈現中等甲基化水平(24.11%～24.48%)，CHG 和CHH 類型的C 堿基呈現低甲基化水平(0.49%～0.56%)。

在不同溫度刺參甲基化模式的對比分析中，3 個溫度組消化道的總甲基化率和CG 類型C 堿基甲基化水平之間存在顯著差異(P＜0.05)，T26 組消化道高于T20 和T32 組，CHG 和CHH 類型的C 堿基甲基化水平在2 組之間差異不顯著(P＞0.05)。已研究的大多數無脊椎動物表現出鑲嵌式的甲基化模式，無論是在無脊椎動物，還是脊椎動物，基因內CpG 甲基化的功能都是保守的，它能夠抑制基因內部異常轉錄的起始(Suzuki et al, 2007)。目前，非CG 類型的甲基化與基因表達的關系尚不清楚，值得更深入的研究。

3.3 組織間的甲基化差異分析

不同組織間的基因組甲基化水平的差異是生物界普遍存在的現象。在水產動物的不同組織間甲基化研究中，杜盈等(2013)利用MSAP 技術分析野生組中國明對蝦(Fenneropenaeus c hinensis)和選育品種“黃海1 號”的甲基化水平時發(fā)現，野生組中國明對蝦的縱肌和鰓組織甲基化水平差異極顯著(P＜0.05)，而二者與血液組織的甲基化水平差異極顯著(P＜0.01)；“黃海1 號”的鰓組織和血液組織甲基化水平相近，都極顯著低于縱肌組織(P＜0.01)。羅少杰(2017)運用甲基化檢測技術對馬氏珠母貝(Phyllostachys mo llissima)的邊緣膜區(qū)、套膜區(qū)和中央膜區(qū)的基因組甲基化水平進行了研究，發(fā)現各組織甲基化水平具有顯著性差異，其中，中央膜區(qū)的甲基化水平最高[(19.04±2.55)%]。這些結果顯示，無脊椎動物不同組織間甲基化水平存在差異，可能是由于DNA 甲基化在細胞分化以及生長發(fā)育調控中發(fā)揮重要作用(Sun et al, 2014; 何暮春等, 2018)。果蠅(Drosophilid)、水蚤(Daphnia magna)、牡蠣(C. gigas)等部分無脊椎動物的甲基化研究發(fā)現，其基因組甲基化處于較低水平(Regev et al, 1998; Riviere et al,2013; Hearn et al, 2019)。本研究結果表明，刺參在不同溫度水體中，不同組織 DNA 總甲基化水平在1%～4%之間，并呈現呼吸樹、消化道、體壁、縱肌的甲基化程度依次降低的趨勢。由于技術原因，通過WGBS 和ELISA 方法測得的消化道甲基化水平存在差異，但總體屬于基因組甲基化水平較低的無脊椎動物類型。在同一溫度下，刺參的不同組織間甲基化水平存在明顯差異，且隨著溫度的升高，縱肌和體壁組織甲基化水平基本不變，而呼吸樹和消化道組織的甲基化水平總體趨勢一致，在溫度從20℃升至26℃時，甲基化水平顯著升高，而在溫度繼續(xù)升至32℃時，甲基化水平顯著下降。曹哲明等(2009)認為，DNA 甲基化是基因表達調控的方式，甲基化程度高的組織相對來說基因表達水平較低。在升溫過程中，消化道的基因表達程度最低，說明不同組織對溫度變化的敏感性不同，這與之前的研究結果相符。刺參經歷高溫休眠時期，呼吸代謝和攝食效率發(fā)生改變，作為這一過程主要的功能器官——消化道和呼吸樹受到的影響最大，同時會發(fā)生不同程度的退化和萎縮(Zhao et al, 2015)。

4 總結

本研究對高溫脅迫下刺參基因組DNA 甲基化的變化情況進行了探究。相較于生活在正常水溫的個體，經歷不同溫度處理的刺參的表觀基因組發(fā)生顯著性改變，使得相關基因表達或抑制。目前，動物在環(huán)境溫度脅迫下，全基因組范圍內的去甲基化過程和甲基化的協(xié)調機制，以及動物表型的形成和環(huán)境適應性的表觀遺傳機制，都值得關注。未來研究應該更多關注全基因組表觀變化啟動的分子機制，例如，DNA甲基化對基因表達抑制的調控作用；以及關注動物中表觀遺傳變異與物種表型差異、環(huán)境適應如何相互聯(lián)系。表觀遺傳學在環(huán)境脅迫中的作用和機制尚有諸多問題需進一步探討。