顏 強(qiáng)， 柳嘉佳， 劉濟(jì)明

(1.貴州省社會科學(xué)院， 貴州 貴陽 550002； 2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 草業(yè)研究所， 貴州 貴陽 550006; 3.貴州大學(xué) 林學(xué)院， 貴州 貴陽 550025)

0 引言

【研究意義】小蓬竹[Drepanostachyumluodianense(Yi et R. S. Wang) Keng f.]系竹亞科鐮序竹屬，其地下莖屬合軸型，桿柄短縮，竹桿在地面密集叢生。小蓬竹是我國特產(chǎn)竹種，在《中國物種紅色名錄》和《IUCN紅色名錄》中小蓬竹均被列為極危種[1]。目前小蓬竹主要分布在貴州省羅甸縣、貞豐縣、紫云苗族布依族自治縣、長順縣、平塘縣、望謨縣、冊亨縣、安龍縣及惠水縣等喀斯特山地，且大多生長于海拔300～1 200 m的坡地上。植物內(nèi)生真菌能促進(jìn)植物對土壤養(yǎng)分和水分的吸收，提高植物生物量，維持植物生長和群體結(jié)構(gòu)，對于被列為極危種的小蓬竹生長繁殖具有重大意義。【前人研究進(jìn)展】植物內(nèi)生真菌(endophytic fungi)是指在其生活史的一定階段，或全部階段生活于健康植物各組織和器官內(nèi)的真菌[2-5]。21世紀(jì)，有關(guān)植物內(nèi)生真菌功能活性的研究主要集中在抗菌活性、抗腫瘤以及增強(qiáng)宿主抗逆性等方面[6-8]，而隨著其研究的發(fā)展，不斷向植物病理學(xué)、植物微生態(tài)學(xué)、生物防治、植物保護(hù)、藥物開發(fā)等領(lǐng)域擴(kuò)展[9]。研究表明，香柱菌屬真菌Epichloegansuensis可以抑制醉馬草上白粉病菌Blumeriagraminis的定殖；短葉紫杉的內(nèi)生真菌可以合成抗癌活性物質(zhì)；紫杉醇木霉是可用于植物病害生物防治重要的內(nèi)生真菌。因此，植物內(nèi)生真菌在宿主植物生態(tài)和生理作用及其作為潛在生防資源和外源基因載體[10]，在農(nóng)業(yè)、生態(tài)恢復(fù)、醫(yī)藥領(lǐng)域[11]中的應(yīng)用前景十分廣闊。小蓬竹是喀斯特地區(qū)可用于固土保水、改變土壤理化性質(zhì)的極瀕危適生竹種，目前研究多是小蓬竹種群、群落及不同處理下的生理特征響應(yīng)，關(guān)于小蓬竹內(nèi)生真菌的分離方法尚未見報道。【研究切入點】適當(dāng)?shù)姆蛛x方法是獲取菌種用于多樣性研究的關(guān)鍵。在植物內(nèi)生真菌分離過程中，必須設(shè)計合適的表面滅菌方法、表面滅菌效果檢測方法和分離培養(yǎng)方法，保證植物內(nèi)生真菌的分離效果[12]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對比不同表面消毒方法、效果檢測方法，并優(yōu)化培養(yǎng)分離條件，以期為小蓬竹內(nèi)生真菌多樣性的研究提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小蓬竹 采自貴州省羅甸縣。

1.1.2 培養(yǎng)基

1) 水瓊脂雙抗固體培養(yǎng)基。瓊脂1.5%、定容1 000 mL，滅菌后加入慶大霉素150 μg/mL和青霉素100 μg/mL。

2) 雙抗PDA培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g，瓊脂16 g，葡萄糖15 g，定容至1 000 mL， pH自然，滅菌后加入慶大霉素150 μg/mL和青霉素100 μg/mL。

3) 孟加拉紅培養(yǎng)基(馬丁氏培養(yǎng)基)。成品，直接稱量后用蒸餾水溶解。

4) 麥芽汁葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(MGA)。麥芽膏20 g，蛋白陳1 g，葡萄糖20 g，瓊脂16 g，蒸餾水1 000 mL。

5) 察氏培養(yǎng)基(czapek agar)。硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1樣品采集小蓬竹采樣地位于貴州省羅甸縣周邊，地理位置為東經(jīng) 106°45′17″、北緯 25°30′39″，試驗地位于坡下位，分別設(shè)置5個樣地(5 m×5 m)，每個樣地間隔30 m。選取3點進(jìn)行土壤因子調(diào)查，根據(jù)立竹徑級與年齡分布規(guī)律，從中隨機(jī)抽取生長良好、無病蟲害的10株[13]作為標(biāo)準(zhǔn)竹叢，整叢挖出，篩選出色澤鮮艷、健康的植株，將植株分為根、莖、葉，莖分為上中下3部分，分別取樣分裝并編號，用裝有冰袋的取樣箱帶回。

1.2.2 試驗預(yù)處理 取小蓬竹1年生和多年生(3年以上)竹桿用保鮮袋帶回實驗室，自來水徹底沖洗竹各部位表面土壤，無菌濾紙吸干，用剪刀和無菌刀將根、莖分別剪成10 mm×10 mm×(8～10 mm)方塊，葉采用刀片橫截面法截取成10 mm×10 mm×2 mm的方塊，轉(zhuǎn)移到無菌操作臺后，用75%酒精浸泡1 min，無菌水沖洗3次，然后用不同活性氯濃度的NaClO浸泡不同時間，75%酒精浸泡30 s，無菌水漂洗5次，無菌濾紙吸干。消毒后，無菌刀片削去組織塊兩端，切成4 mm×4 mm×(2～3)mm的組織塊， 然后分別接種于雙抗PDA培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)基平板接種6個組織塊，每處理5個重復(fù)，根、莖、葉各30個組織塊，轉(zhuǎn)到真菌培養(yǎng)箱，28℃恒溫培養(yǎng)。

1.2.3 表面消毒 試驗選用NaClO作為分離小蓬竹內(nèi)生真菌的主要表面消毒劑，75%酒精作為輔助表面消毒劑。先用75%乙醇消毒1 min，用無菌水洗滌3次，分別用不同濃度NaClO溶液浸泡不同時間(處理A～D：含有效氯5%NaClO溶液消毒0.5 min、1 min、2 min和3 min；處理E～H：含有效氯2.5%NaClO溶液消毒1 min、2 min、3 min和5 min)，再用75%乙醇消毒0.5 min，無菌水洗滌5次。對不同表面消毒的組織進(jìn)行無菌檢測，根據(jù)定殖率確定最佳分離植物內(nèi)生真菌的表面滅菌強(qiáng)度，根、莖、葉視組織幼嫩程度適當(dāng)增減時間。

定殖率=出現(xiàn)內(nèi)生真菌的組織塊數(shù)/總分離組織塊數(shù)×100%

1.2.4 分離培養(yǎng)基的選擇 選擇雙抗PDA培養(yǎng)基、麥芽汁葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(MGA)、孟加拉紅培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基分別作為小蓬竹根部內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)基，觀察和比較各培養(yǎng)基內(nèi)生真菌的分離效果后，選擇最佳培養(yǎng)基進(jìn)行其他部位內(nèi)生真菌的分離和純化。將上述的根組織塊，按小蓬竹根部表面消毒的最佳方式消毒后，分別接種到4種培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)基接種6塊，每種培養(yǎng)基10次重復(fù)，置培養(yǎng)箱暗室26℃培養(yǎng)，觀察記錄并計算小蓬竹內(nèi)生真菌的分離情況。

1.2.5 優(yōu)化分離培養(yǎng)條件 在分離培養(yǎng)基的預(yù)試驗中，由于培養(yǎng)基中均出現(xiàn)了快生真菌瘋長的情況，培養(yǎng)3～4 d就可以鋪滿覆蓋整個平板， 8 d左右所有平板全部被覆蓋，導(dǎo)致慢生型內(nèi)生真菌沒有生長空間，無法分離。為了獲得更多種類和數(shù)量的內(nèi)生真菌，應(yīng)該加強(qiáng)觀察，除及時將長出的菌分離轉(zhuǎn)移外，還應(yīng)對分離培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1) 培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)濃度的優(yōu)化。在雙抗PDA培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，將其分別稀釋為100%、50%、25%、10%濃度的培養(yǎng)基，以水瓊脂雙抗固體培養(yǎng)基作對照，分別接種表面消毒后的根部組織塊，每個培養(yǎng)基接種6塊，每種培養(yǎng)基5次重復(fù)，置培養(yǎng)箱暗室25℃培養(yǎng)，觀察記錄各濃度雙抗PDA菌株種類數(shù)[12，14]。

2) 培養(yǎng)基瓊脂塊的優(yōu)化。借鑒參考文獻(xiàn)[15]的單絲菌團(tuán)分離法中的處理，將平板中的圓形瓊脂塊，切割成6個長約為20 mm的方形瓊脂塊，并均勻分布在平板中(圖1)。

圖1 瓊脂塊的優(yōu)化

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法處理小蓬竹不同部位的定殖率

從表1可知，不同消毒方法處理小蓬竹根、莖和葉的定殖率。

2.1.1 根 在含2.5% 的NaCIO 5 min、5%的NaCIO溶液3 min的條件下，都不長菌，表明處理D和H都可以使根的表面消毒徹底，但高濃度的長時間處理相比低濃度長時間處理，NaCIO溶液濃度雖較高但定殖率較低?？赡苁怯捎陔S著植物樣品在消毒劑中浸泡時間越長，高濃度次氯酸鈉浸入植物材料內(nèi)部，殺死分布在表皮以下甚至分布更深的內(nèi)生真菌，因此，內(nèi)生真菌消毒的NaCIO溶液濃度越高，內(nèi)生真菌定殖率越低[12]。故處理H(2.5%NaCIO溶液浸泡3 min)為小蓬竹根部表面消毒的最佳方式。

2.1.2 莖 處理C、D、F、G、H均可消毒徹底，處理F(2.5%NaClO 3 min)的內(nèi)生真菌萌動時間較短，且內(nèi)生真菌的定殖率最高，為70.0%，是最佳表面消毒方式。處理F、G和H，在相同NaClO濃度，隨消毒時間延長內(nèi)生真菌出菌時間延長、定殖率降低，表明長時間消毒會殺死組織內(nèi)部的真菌。因此，應(yīng)在消毒徹底的基礎(chǔ)上盡量減少消毒時間，以獲取更多的內(nèi)生真菌數(shù)量與種類。

2.1.3 葉 處理E和F均可消毒徹底，且定殖率均達(dá)100%。但考慮到小蓬竹葉片組織纖薄幼嫩，為減少對內(nèi)生真菌數(shù)量的影響，故選取處理E(2.5% NaClO 1 min)為葉的最佳表面消毒方式。處理C、D和G，由于消毒時間過長，導(dǎo)致內(nèi)生真菌萌動時間大大延長，定殖率極低；而處理H在培養(yǎng)周期10 d內(nèi)沒有長出內(nèi)生真菌，定殖率為0，推測可能由于消毒時間過長，NaClO溶液浸入到組織內(nèi)部，殺死了絕大多數(shù)甚至全部內(nèi)生真菌。

2.2 小蓬竹根部內(nèi)生真菌在不同分離培養(yǎng)基上的菌落數(shù)及種類

由表2可知，不同分離培養(yǎng)基上的菌落數(shù)和種類存在一定的差異。在雙抗PDA培養(yǎng)基中分離得到的菌落數(shù)和種類最多，分別為42個和7種；孟加拉紅培養(yǎng)基雖然分離得到的種類也是7種，但菌落數(shù)量是4種培養(yǎng)基中最少的，僅31種。MGA培養(yǎng)基與察氏培養(yǎng)基分離得到的菌落數(shù)及種類都相對較少。因此，試驗選用雙抗PDA培養(yǎng)基為小蓬竹內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)基。

表2 小蓬竹根部內(nèi)生真菌在不同培養(yǎng)基上的菌落數(shù)及種類

2.3 小蓬竹根部內(nèi)生真菌的最佳分離培養(yǎng)條件

由表3可知，培養(yǎng)14 d后，不同分離培養(yǎng)基上的真菌覆蓋平板時間與可分離菌株種類存在較大差異。水瓊脂雙抗固體培養(yǎng)基，由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)貧乏，可分離菌株種類數(shù)較少。快生型內(nèi)生真菌的菌絲生長也極為緩慢，且大都完全貼著平板壁生長，氣生菌絲稀疏如霧狀，使得不同菌株之間菌落形態(tài)差異不明顯，很難準(zhǔn)確辨認(rèn)挑取不同菌株進(jìn)行純化；慢生型真菌受營養(yǎng)物質(zhì)限制，短時間內(nèi)難以出菌。10%雙抗PDA培養(yǎng)基，與水瓊脂雙抗固體培養(yǎng)基情況類似，稍有不同的是有個別培養(yǎng)基上存在快生型內(nèi)生真菌，稀疏的菌絲鋪滿平板。雙抗PDA培養(yǎng)基隨著濃度由100%依次稀釋為50%、25%，快生型內(nèi)生真菌覆蓋平板的時間逐漸延長，而可分離菌株種類數(shù)卻逐漸增加。表明適宜濃度的營養(yǎng)物質(zhì)可以使內(nèi)生真菌正常生長而不致于營養(yǎng)過剩而瘋長，快生型內(nèi)生真菌的生長受到抑制，從而為慢生型真菌的生長留出相對的空間和資源，以致可以分離更多種類的內(nèi)生真菌。綜上所述，25%雙抗PDA培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度26℃為小蓬竹內(nèi)生真菌的最佳分離培養(yǎng)基。

表3 不同濃度雙抗培養(yǎng)基處理小蓬竹根部內(nèi)生真菌的生長

3 討論

植物組織表面消毒應(yīng)最大限度殺死附著在植物表面的任何微生物，但對植物組織中內(nèi)生真菌的影響降至最小，還要盡量不損傷或少損傷樣品材料。選用具有毒性小、易揮發(fā)、不易殘留等特性的NaClO溶液作為主要消毒劑，75%的酒精作為輔助消毒劑，無菌水漂洗數(shù)次，此法是物理和化學(xué)相結(jié)合的應(yīng)用最廣泛的三步消毒法。試驗表明，低濃度長時間處理所分離的內(nèi)生真菌種類相對較少，而高濃度短時間處理分離的內(nèi)生真菌種類相對較多，與陳靜等[12]的研究結(jié)果一致。小蓬竹葉表面消毒的最佳方式為2.5% NaClO溶液1 min；小蓬竹莖表面消毒的最佳方式為2.5% NaClO溶液2 min；小蓬竹根表面消毒的最佳方式為5% NaClO溶液3 min，消毒徹底，并且對內(nèi)生真菌的分離影響最小。

在內(nèi)生真菌分離過程中，分離培養(yǎng)條件對內(nèi)生菌的數(shù)量和種類至關(guān)重要。如果分離培養(yǎng)條件不當(dāng)，可能會使某些內(nèi)生真菌生長緩慢甚至不生長，或多種內(nèi)生真菌生長到一起，造成難以辨認(rèn)，不易挑取和分離等。試驗對雙抗PDA培養(yǎng)基、MGA、孟加拉紅培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基進(jìn)行比較后，篩選得到雙抗PDA培養(yǎng)基為最佳，而后又通過培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)濃度及瓊脂塊切割解決快生型內(nèi)生真菌將平板全部覆蓋，導(dǎo)致慢生型內(nèi)生真菌沒有生長空間無法分離的問題。前者主要是通過適度降低培養(yǎng)液的濃度抑制快生型真菌，給慢生型菌株留下生長空間；后者主要是通過切割增大不同瓊脂塊的間隔以阻隔快生型真菌占據(jù)整個平板。試驗表明，25%雙抗PDA培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度26℃作為小蓬竹分離內(nèi)生真菌的最佳條件，可最大限度分離小蓬竹的內(nèi)生真菌。試驗僅對根部內(nèi)生真菌的最佳分離條件進(jìn)行研究，其莖葉內(nèi)生真菌的最佳分離條件可參考根部進(jìn)行。

菌株的分離是進(jìn)行內(nèi)生真菌多樣性研究的基礎(chǔ)。但是，關(guān)于內(nèi)生真菌的分離仍存在許多問題需要解決，主要表現(xiàn)在以下方面：1) 由于植物不同組織致密性與所富含營養(yǎng)物質(zhì)的不同，以及單一培養(yǎng)基、pH、溫度的影響，部分根、莖、葉中的部分內(nèi)生真菌沒有分離出來。研究對小蓬竹表面消毒、分離培養(yǎng)基的篩選與優(yōu)化進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，但只用根組織為代表從4種培養(yǎng)基中篩選最佳培養(yǎng)基，適宜在其他培養(yǎng)基上生長的菌株可能被漏篩。故今后應(yīng)同時采用多種培養(yǎng)基，改良培養(yǎng)基成分(如采用不同組織部位煎汁培養(yǎng)基)，有效提高內(nèi)生真菌的分離率。2) 有研究表明，部分寄生性很強(qiáng)的內(nèi)生真菌不能在人工培養(yǎng)基上生長，即使綜合使用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)植物組織，也難以保證全部分離植物組織中的內(nèi)生真菌。對于此類不可分離培養(yǎng)內(nèi)生真菌的鑒定可采用非分離培養(yǎng)方式如提取總DNA法鑒定組織內(nèi)生真菌[16]。

4 結(jié)論

小蓬竹根、莖、葉在最佳表面消毒處理后的定殖率分別為83.3%、70%、100%，在25%雙抗PDA培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度26℃最佳分離條件下，根部內(nèi)生真菌分離到菌株10～12種。