胡倩，藍(lán)曉珊，林穎欣，陳秀云，丁林瀟瀟，龐丹梅

1.佛山市第一人民醫(yī)院 腫瘤中心，廣東 佛山 528000；2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 乳腺醫(yī)學(xué)部，廣東 廣州 510120

據(jù)報道乳腺癌是全世界女性最常見的惡性腫 瘤[1-2]。表觀遺傳修飾在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[3-4]。外界環(huán)境因素如藥物、飲食、生活習(xí)慣能直接影響表觀遺傳學(xué)修飾，如DNA甲基化、組蛋白乙?；萚3-5]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展和原癌基因的異常低度甲基化與抑癌基因的異常高度甲基化有關(guān)[6]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）也是表觀遺傳學(xué)修飾一種方式[7-8]。本研究采用高通量lncRNA芯片技術(shù)和實時熒光定量PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）篩選受甲基化水平影響的 lncRNA分子，分析其可能對乳腺癌的發(fā)生發(fā)展所發(fā)揮的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株 采用三株人乳腺癌細(xì)胞株BT549、MB231 和BT474 以及人正常永生化乳腺上皮細(xì)胞MCF10A。BT549、MB231細(xì)胞株的表型為三陰型，而BT474細(xì)胞株表型為上皮型。BT549、BT474及MB231細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基，人正常永生化乳腺上皮細(xì)胞株MCF10A培養(yǎng)于含5%馬血清、10 μg/mL胰島素、20 μg/mL表皮生長因子、100 μg/mL霍亂毒素、0.5 μg/mL氫化可的松的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，待細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%融合時移去舊培養(yǎng)基，使用1 mL 0.25%胰酶消化傳代。根據(jù)文獻(xiàn)報道及預(yù)實驗結(jié)果，本研究利用上皮型BT474乳腺癌以去甲基化藥物5-氮雜胞苷（5’aza-deoxycytidine，sigma）5 μmol/L的處理72 h，每24 h換液，獲得乳腺癌細(xì)胞去甲基化處理株[9]。細(xì)胞株均購置于ATCC細(xì)胞保藏中心。

1.2 乳腺癌組織標(biāo)本 選取2019年6月佛山市第一人民醫(yī)院符合病理診斷的20例乳腺癌患者。20例患者均為女性，年齡38～70歲，中位年齡50歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：①病理確診的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌；②體力評分（performance status，PS）0～2分；③無嚴(yán)重的骨髓功能或肝腎功能異常。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。采集20例乳腺癌患者新鮮癌組織及癌旁組織樣本，提取DNA和RNA用于下一步檢測。

1.3 LncRNA芯片檢測 LncRNA芯片檢測由上?？党晒就瓿?。采用Arraystar公司開發(fā)的包含人類lncRNA和mRNA的lncRNA芯片，目前該芯片覆蓋UCSC Known gene、NCBI Refseq、RNAdb和NRED等多個數(shù)據(jù)庫的lncRNA，共檢測3對BT474親本株和去甲基化株共6個樣本。將獲得的細(xì)胞株加入TRIzol裂解液轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中。提取RNA，反轉(zhuǎn)錄，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，合成雙鏈互補(bǔ)DNA，以Agilent Quick Amp Labeling Kit標(biāo)簽6個樣品，在小室雜 交。洗脫后，以Agilent DNA Microarray Scanner 進(jìn)行掃描檢測，并且以Agilent Feature Extraction 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)提取得到原始數(shù)據(jù)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化。去甲基化組和對照組之間差異表達(dá)lncRNA以散點圖來表示。

1.4 qRT-PCR 將需要復(fù)核的樣本加入TRIzol裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，提取RNA。反轉(zhuǎn)錄，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。合成雙鏈互補(bǔ)DNA，使用Light Cycler 480 Real-time PCR儀上進(jìn)行實時定量PCR，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)熱3 min，95 ℃預(yù)變性10 s，運(yùn)行40 個循環(huán)，每個循環(huán)分為：95 ℃變性5 s， 60 ℃退火及延伸30 s，計算lncRNA的相對定量。利用網(wǎng)站及工具選取10個存在CPG島并在芯片檢測結(jié)果中差異表達(dá)的候選lncRNA分子用于后續(xù)qRTPCR檢測（見表1）。PCR法檢測選定的10個lncRNA在乳腺癌細(xì)胞和乳腺癌組織中的相對表達(dá)量。

1.5 基因啟動子甲基化狀態(tài)檢測 采用美國加州大學(xué)UCSC網(wǎng)站工具（http://genome.ucsc.edu/ cgi-bin/hgGateway）和methprimer（http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi）網(wǎng)站在去甲基化后差異表達(dá)的芯片表達(dá)譜列表中尋找存在上游-2 000 bp的CpG島和甲基化位點共10個候選lncRNA分子用于后續(xù)qRT-PCR檢測（見表1）。通過BSP方法驗證軟件預(yù)測篩選出來的lncRNA uc003lxs和uc002btf的基因啟動子上游CpG島在乳腺上皮細(xì)胞株和乳腺癌細(xì)胞株MCF10A、BT474、MB231和BT549及乳腺癌組織和癌旁組織中的甲基化狀態(tài)。培養(yǎng)細(xì)胞后提取DNA，進(jìn)行亞硫酸氫鹽的轉(zhuǎn)化。兩輪PCR擴(kuò)增后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測及膠回收，pBLUE-T載體連接試劑盒操作，將純化的目的DNA片段克隆到pBLUE-T載體上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，挑取陽性克隆，將擴(kuò)增的菌液進(jìn)行測序。

表1 BT474細(xì)胞株去甲基化處理后表達(dá)顯著升高并存在基因CPG島的lncRNA

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。K-S正態(tài)檢驗用于計量資料的正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用t檢驗；如不符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA表達(dá)芯片結(jié)果 本研究結(jié)果顯示去甲基化細(xì)胞株和親本株lncRNA存在顯著的差異（見圖1）。在芯片檢測到的總共33 045個人類lncRNA中，去甲基化處理細(xì)胞株中較親本株顯著升高2倍以上的lncRNA為287個，顯著升高10倍以上的lncRNA為54個；而下調(diào)2倍以上的lncRNA為556個，顯著下調(diào)10倍以上的lncRNA為35個。根據(jù)lncRNA在基因組中的不同位置分為雙向lncRNA、外顯子重疊lncRNA、 基因間lncRNA、內(nèi)含子重疊lncRNA、內(nèi)含子反義lncRNA和天然反義lncRNA，差異表達(dá)的lncRNA的不同分類的數(shù)量分布情況見圖2A。不同編號染色體差異表達(dá)的lncRNA數(shù)量的分布情況見圖2B。

圖1 乳腺癌細(xì)胞株BT474去甲基化處理株和親本株的lncRNA芯片表達(dá)譜散點圖

圖2 去甲基化乳腺癌細(xì)胞株中差異表達(dá)的lncRNA的數(shù)量分布

2.2 qRT-PCR結(jié)果驗證芯片結(jié)果及乳腺癌樣本檢測 為了驗證芯片檢測的結(jié)果，本研究采用qRTPCR方法針對在芯片檢測結(jié)果中變化最顯著的并且能找到DNA啟動子上游CPG島的10個lncRNA進(jìn)行定量檢測。本研究針對AX803817 等10 個分子合成引物，在細(xì)胞株中重新行去甲基化處理后提取RNA行qRT-PCR檢測。檢測結(jié)果顯示AX803817、G30735、BC029932、uc002btf、NR_027088、ENST00000419224、uc002jyi.1、ENST00000441644、uc003lxs、NR_001434等RNA在去甲基化細(xì)胞組中較對照組顯著上調(diào)（見圖3A），送芯片樣本復(fù)核RT-PCR和細(xì)胞株RT-PCR結(jié)果基本一致，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

此后繼續(xù)采用qRT-PCR檢測以上分子在正常乳腺上皮細(xì)胞株MCF10A、上皮型乳腺癌細(xì)胞株BT474、基底型的乳腺癌MB231及BT549中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與MCF10A細(xì)胞比，uc003lxs和uc002btf在BT474、MB231及BT549細(xì)胞中均顯著上調(diào)（P＜0.01），見圖3B。與乳腺癌癌旁組織比，uc003lxs在乳腺癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），與乳腺癌癌旁組織比，uc003lxs在乳腺癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖3C。

2.3 LncRNA的基因啟動子甲基化狀態(tài)BSP檢測 結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA uc003lxs DNA啟動子區(qū)域28個位點中，乳腺癌MB231及BT549細(xì)胞株均未發(fā)生甲基化，而MCF10A細(xì)胞株和BT474細(xì)胞株中超過50.00%位點的甲基化（見圖4）；而lncRNA uc003btf DNA啟動子區(qū)域9個位點中，乳腺癌MB231及BT549細(xì)胞株中33.33%位點發(fā)生甲基化，而MCF10A細(xì)胞株和BT474細(xì)胞株中9個位點中超過66.67%的位點均發(fā)生甲基化（見圖5）。LncRNA uc003lxs及uc002btf在MB231及BT549 細(xì)胞株中基因啟動子呈現(xiàn)低度甲基化狀態(tài)（P＜0.01），而uc003lxs及uc002btf的表達(dá)升高 （P＜0.01）。

圖3 qRT-PCR法檢測不同乳腺癌細(xì)胞株、癌組織和癌旁組織的lncRNA水平

圖4 亞硫酸氫鹽處理后測序法檢測不同乳腺癌細(xì)胞株lncRNA uc003lxs的基因啟動子上游CPG島的甲基化水平

圖5 亞硫酸氫鹽處理后測序法檢測不同乳腺癌細(xì)胞株lncRNA uc002btf的基因啟動子上游CPG島的甲基化水平

20 例患者乳腺癌組織及癌旁組織中l(wèi)ncRNA uc003lxs基因CPG島中檢測到甲基化位點百分?jǐn)?shù)明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。20例患者乳腺癌組織及癌旁組織中l(wèi)ncRNA uc002btf 基因CPG島中檢測到甲基化位點百分?jǐn)?shù)明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖6。

3 討論

惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展可能和一個或多個腫瘤抑制基因CpG島甲基化或是原癌基因的低度甲基化有關(guān)[6]。臨床前研究提示紫杉醇耐藥的乳腺癌細(xì)胞對甲基化調(diào)節(jié)的藥物仍然敏感，調(diào)節(jié)甲基化狀態(tài)的藥物可以作為化療耐藥患者的二線治療方案[10]。散發(fā)型乳腺癌中10%～15%患者出現(xiàn)BRCA1基因啟動子區(qū)高甲基化[11]。

LncRNA是指長度超過200個核苷酸的RNA，它們的表達(dá)調(diào)控腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[7]。目前的研究證實DNA甲基化修飾、組蛋白乙?；蚣谆揎椇腿旧w重構(gòu)等能夠在轉(zhuǎn)錄水平前或是轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)lncRNA的表達(dá)[12]。WU等[13]報道，Barrett食管及食管腺癌組織處于低甲基化狀態(tài)，其中l(wèi)ncRNA AFAP1-AS1的甲基化水平明顯降低，通過抑制AFAP1-AS1的表達(dá)，使食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲及克隆形成能力降低。甲基化調(diào)控lncRNA表達(dá)高低從而影響食管癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。近年來對于lncRNA在基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中功能的探索，逐步揭示出lncRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的重要作用，篩選腫瘤相關(guān)的lncRNAs，lncRNAs在腫瘤診斷和治療中擁有廣闊的應(yīng)用前景。本研究探討了受甲基化調(diào)控lncRNA是否也能影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)去甲基化乳腺癌細(xì)胞株和親本株細(xì)胞，lncRNA和mRNA表達(dá)譜發(fā)生了顯著的變化。 LncRNA qRT-PCR結(jié)果與芯片檢驗結(jié)果基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA基因啟動子上游存在CPG島并且變化差異性明顯的lncRNA uc003lxs及uc002btf在侵襲程度高的細(xì)胞株BT549及MB231中高表達(dá)并且及基因啟動子呈現(xiàn)低度甲基化水平，并且在乳腺癌患者組織內(nèi)lncRNA uc003lxs及uc002btf高表達(dá)，基因啟動子甲基化水平降低。這表明乳腺癌細(xì)胞和組織lncRNA uc003lxs及uc002btf差異表達(dá)并且和基因甲基化水平相關(guān)。根據(jù)以上的研究推測乳腺癌細(xì)胞中uc003lxs及uc002btf受甲基化調(diào)控們受甲基化調(diào)控并且可能在乳腺癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。但是本研究仍需要通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)募?xì)胞生物學(xué)實驗證實 lncRNA uc003lxs及uc002btf在乳腺癌細(xì)胞的演進(jìn)中發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展的生物學(xué)作用，如增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等特性。

本研究篩選了lncRNA uc003lxs及uc002btf分子在乳腺癌細(xì)胞和組織中的差異表達(dá)，探索lncRNA uc003lxs及uc002btf分子受啟動子甲基化水平影響，發(fā)現(xiàn)uc003lxs及uc002btf可能是治療乳腺癌的新靶點，應(yīng)用lncRNA的甲基化狀態(tài)靶向uc003lxs及uc002btf治療乳腺癌可能是未來的一種新方法。本研究還揭示lncRNA上游嶄新的調(diào)控形式，DNA區(qū)域啟動子CpG島的甲基化調(diào)控，明確lncRNA的啟動子研究價值，豐富了lncRNA與表觀遺傳學(xué)、DNA甲基化的復(fù)雜的作用網(wǎng)絡(luò)與分子機(jī)制。

圖6 乳腺癌組織及癌旁組織的lncRNA uc003lxs和uc002btf的基因啟動子上游CPG島發(fā)生甲基化的百分?jǐn)?shù)