高永政，劉先檔，林渝凱，謝昊，呂威廷，李遠兆，鄭錦花

(桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科，廣西 桂林 541000)

0 引言

頭頸部鱗狀細胞癌中口腔鱗狀細胞癌占到50%，應用早期診斷和評估預后的相關因素與患者的生存質量密切相關?？谇击[狀癌的主要致病因素有煙草、酒精、HPV、環(huán)境污染物等引起基因組突變致癌。Shanthi Marur的回顧分析表明HPV相關頭頸癌的特征在于p53突變和p16的下調[1]。而CastellsaguéX等人的大型國際研究表明HPV在相關頭頸部癌中發(fā)揮重要作用，并通過HPV生物活性相關的標記物HPV E6*I mRNA表達以及p16，pRb，p53和Cyclin D1蛋白檢測發(fā)現(xiàn)，每個標記物都有優(yōu)點和局限性[2]。

但p16的表達異?？赡芘c兩種方式有關：(1)細胞自身基因組突變；(2) HPV-E7蛋白引起p16蛋白異常表達，同時HPV-E6蛋白會引起p53的異常表達[3]。因而在頭頸部鱗狀細胞癌中已將HPV作為一項病因學、臨床病理及分子機制的研究證據(jù)，雖然只有很少一部分口腔鱗狀細胞癌由HPV引起[4]。基于以上情況考慮，最新的頭頸部腫瘤的第八版AJCC手冊和NCCN.2.2019指南已將HPV及p16作為分類口腔癌的明確因素。我們的研究通過評估p16、p53在口腔鱗狀細胞癌中的表達初步評估其與臨床病理特征的關系，來預測是否存在HPV感染。本實驗采用免疫組織化學染色的方法檢測口腔鱗狀細胞癌組織中p16、p53的表達情況，分析相關的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例選擇

經桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科確診的2014年8月至2018年8月口腔鱗狀細胞癌組織及臨床資料41例。

1.2 病例收集

通過收集病人病歷和隨訪獲取相關數(shù)據(jù)，隨訪采用電話采訪和信訪方式。收集的信息包括：姓名、性別、年齡等基本情況，腫瘤臨床分期、分化程度等，根據(jù)2018第八版AJCC頭頸部腫瘤分期手冊進行臨床評價分期。病人跟蹤隨訪截止時間為2018年8月30日。以上經桂林醫(yī)學院倫理委員會審核通過。

1.3 方法與結果判定

1.3.1 免疫組織化學染色法

抗體：兔抗人p16抗體、兔抗人p53抗體。(BIOSS公司)

試劑盒：二步法免疫組化檢測系統(tǒng) (2-step plus Poly-HRP Anti-Mouse/Rabbit IgG Detection System，PV-9000) 和DAB檢測試劑盒(北京中杉金橋公司)。

1.3.2 結果判定方法

(一)陽性結果：p16陽性信號為黃色或者棕黃色，定位于細胞核或細胞漿，p53陽性信號呈棕黃色或棕褐色，定位于細胞核。

(二)高倍鏡下(x400)對每張切片隨機選擇5個視野，計數(shù)200個細胞/視野。結果評判標準為：弱陽性(+)：陽性瘤細胞占5%-10%，陽性(++)：陽性瘤細胞占10%-50%，強陽性(+++)：陽性瘤細胞占＞50%，陰性(—)：陽性瘤細胞占0%-5%。

1.3.3 統(tǒng)計學分析方法

運用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件，采用卡方檢驗和連續(xù)校正卡方檢驗分析p16、p53與口腔鱗狀細胞癌主要臨床病理特征的關系。

表2 p16、p53蛋白表達與口腔鱗狀細胞癌主要臨床病理特征的關系

2 結果

2.1 免疫組化結果

圖1 p16、p53在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達（免疫組織化學染色×200）

2.2 統(tǒng)計學分析

p16、p53相關性及與41例口腔鱗狀細胞癌病例主要臨床病理特征的關系。

表1 p16與p53表達的相關性分析

3 結論

2017年頭頸部腫瘤第八版AJCC手冊出版，其中口腔癌及TNM分期改動較大，新增了許多內容，如人乳頭瘤病毒、侵襲深度、淋巴結外擴展等指標用于了新的分期。因此口腔鱗狀細胞癌的分期與分級、浸潤深度、淋巴結受累情況、HPV、p16、TP53相關p21基因等已成為影響口腔鱗狀細胞癌的重要預后因素。

p16 是細胞周期依賴性激酶抑制蛋白，在一些正常組織和腫瘤表達，參與Rb基因的調控制細胞周期的G1-S期轉化[5]。而p53則是腫瘤抑制基因，它編碼53KD的p53核蛋白參與細胞生長調控[6]。許多人類癌瘤都有p53基因突變[7,8]，與野生型不穩(wěn)定p53蛋白相比，突變型p53蛋白變得穩(wěn)定促進腫瘤分化，可以用免疫組化技術識別，而p16和p53主要表達于細胞核，通過兩者表達的組織學位置我們可以確定腫瘤的浸潤深度。

而我們關注的HPV相關口腔鱗狀細胞癌分為兩類：1.在HPV陰性致癌的早期階段，染色體9p、3p和17p84的頻繁損失，尤其是腫瘤抑制基因TP53(編碼p53)和細胞周期依賴激酶抑制劑2A(CDKN2A，編碼p16)分別位于17p13和9p21。因此p53與p16突變會引起細胞周期的異常和基因組的不穩(wěn)定性[9]。2.與之形成對比的是，HPV陽性相關的頭頸部鱗狀細胞癌缺乏這些染色體的異常而表現(xiàn)為野生型p53的低表達(可被HPV-E6蛋白抑制和下調)和p16的過表達(HPV-E7蛋白與pRb結合干擾細胞周期后引起p16蛋白的積累)[10,11]。

Califano J等依據(jù)p16抑癌基因與p53突變型促癌基因相互作用還構建了口腔鱗狀細胞癌進展的分子模型[9]。而Yusuke Zushi等的研究結果提供了一個HPV陽性和陰性的人口腔鱗狀細胞癌的體外多步致癌模型，證明HRAS突變或EGFR激活與MYC過表達協(xié)同作用，是轉化HTK(原代人舌角質形成細胞)的強大驅動程序，這些HTK已通過HPV16E6E7或等效的遺傳改變獲得了pRB和p53途徑的失活以及端粒酶的激活[12]。

我們的研究采用p16、p53對相關口腔鱗狀細胞癌的主要臨床病理特征進行初步評估，發(fā)現(xiàn)p16與患者的患病年齡特征相關而p53則與腫瘤的分化程度相關，同時可通過建立與完善預測模型評估HPV潛在感染的可能。且已有越來越多的研究證明可通過HPV等相關因素來評估相關口腔鱗狀細胞癌的預后情況[13]，采用PCR、ISH等方法進一步明確HPV的感染情況后，可為臨床診斷的路徑優(yōu)化提供一種思路。

綜上，我們通過p16、p53在口腔鱗狀細胞癌中的表達情況，試圖評估HPV存在潛在感染可能，對口腔鱗狀細胞癌的診斷和預后評估提供一種新的臨床路徑，我們將進一步檢測相關患者的HPV感染情況明確我們的研究方向。