肖 蓉, 王興紅, 李雄偉, 劉惠惠, 魯盛平,侯有明, 石章紅,*

(1. 福建農(nóng)林大學(xué), 閩臺作物有害生物防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福州 350002;2. 福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 福建省昆蟲生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福州 350002)

微生物是自然界中常見的一種生命體，通常以“微生物群落”的方式共存。在動物的腸道中棲息著包括細(xì)菌、古菌、病毒、真菌和原生生物等多種微生物，其中細(xì)菌是主要的微生物類群，常被稱為腸道菌群(Lee and Brey, 2013)。昆蟲與腸道菌群之間的互作是昆蟲適應(yīng)環(huán)境和進(jìn)化成功的重要因素?，F(xiàn)有證據(jù)表明，腸道菌群對昆蟲的生理適合度有很顯著的影響作用(Engel and Moran, 2013; Douglas, 2015; 陳勃生等, 2017; 石章紅和侯有明, 2020)。例如，腸道菌群可以調(diào)節(jié)昆蟲的營養(yǎng)代謝、生長發(fā)育、免疫活性、器官穩(wěn)態(tài)維持、壽命以及交配覓食行為(Youetal., 2014; Schretteretal., 2018; Lynch and Hsiao, 2019; 高歡歡等, 2020)。腸道是宿主與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的主要場所，外界環(huán)境中的非腸道微生物會隨著食物進(jìn)入昆蟲腸道。因此，宿主需要快速且精準(zhǔn)地識別并清除非腸道細(xì)菌以維持其腸道菌群穩(wěn)態(tài)。因?yàn)閯游锬c道菌群的結(jié)構(gòu)組成和數(shù)量可以隨著內(nèi)外各種因素的波動而不斷動態(tài)變化，所以腸道菌群穩(wěn)態(tài)通常是指腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成與宿主健康之間的一種動態(tài)平衡狀態(tài)，通常從腸道細(xì)菌的數(shù)量和不同種類細(xì)菌的相對豐度這兩個角度來進(jìn)行衡量(Ryuetal., 2008; Buchonetal., 2013)。已有研究證實(shí)昆蟲免疫系統(tǒng)在宿主腸道菌群穩(wěn)態(tài)的維持和調(diào)控中扮演關(guān)鍵角色(Chenetal., 2019; Xiaoetal., 2019)。例如，黑腹果蠅Drosophilamelanogaster和斯氏按蚊Anophelesstephensi的腸上皮細(xì)胞能夠通過分泌產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)(Oliveiraetal., 2011; Leeetal., 2013)和抗菌肽(Ryuetal., 2008)來調(diào)控腸道菌群的組成和數(shù)量。

縱觀當(dāng)前關(guān)于昆蟲腸道菌群的相關(guān)研究報道，不難發(fā)現(xiàn)對于昆蟲宿主如何調(diào)控和維持其健康的腸道菌群穩(wěn)態(tài)這方面的科學(xué)問題研究關(guān)注相對很少，而且非常有限的相關(guān)報道也是主要來自于模式昆蟲黑腹果蠅D.melanogaster、岡比亞按蚊A.gambiae和埃及伊蚊Aedesaegypti等。眾所周知，昆蟲種類繁多，生態(tài)習(xí)性千差萬別。因此，源于模式昆蟲的相關(guān)研究報道很難泛化到一些重要的農(nóng)林害蟲。目前已發(fā)現(xiàn)許多重要的農(nóng)林害蟲的腸道中都棲息有豐富的細(xì)菌群落。和哺乳動物等模式生物類似，維持健康的腸道菌群穩(wěn)態(tài)對于害蟲的正常生長發(fā)育至關(guān)重要(Muhammadetal., 2017, 2019a, 2019b; Hebinezaetal., 2019)。例如，腸道菌群對昆蟲的生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝、抗藥性的產(chǎn)生、免疫防御與器官穩(wěn)態(tài)維持、配偶選擇、交配競爭力和社會行為等眾多生理過程都有重要的影響作用(Chengetal., 2017; Chenetal., 2019; Wangetal., 2020)。因此，腸道菌群被認(rèn)為是宿主體內(nèi)的一個“超級器官” (O′Hara and Shanahan, 2006)。越來越多的研究證實(shí)腸道菌群穩(wěn)態(tài)的變化會導(dǎo)致昆蟲發(fā)育延緩、壽命縮短和慢性炎癥等疾病的產(chǎn)生(Shinetal., 2011; Guoetal., 2014; Muhammadetal., 2017, 2019a, 2019b; Iatsenkoetal., 2018; Mottaetal., 2018)。因此，維持腸道菌群的穩(wěn)態(tài)對宿主的健康生存至關(guān)重要。然而，關(guān)于害蟲如何維持和調(diào)控其腸道菌群穩(wěn)態(tài)的免疫機(jī)理知之甚少。

紅棕象甲Rhynchophorusferrugineus是我國的一種高風(fēng)險性入侵害蟲，主要危害棕櫚科植物，還能危害甘蔗等農(nóng)作物(鞠瑞亭等, 2006; Shietal., 2014)。該害蟲的腸道中棲居著主要由腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、乳酸桿菌科(Lactobacillaceae)、蟲原體科(Entomoplasmataceae)和鏈球菌科(Streptococcaceae)4個科所構(gòu)成的細(xì)菌群落，其中一些細(xì)菌具有降解纖維素的能力而且蘊(yùn)含著大量編碼降解植物纖維素和淀粉等酶的功能基因(Jiaetal., 2013; Muhammadetal., 2017)。當(dāng)腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)被改變或被徹底清除后，紅棕象甲的營養(yǎng)代謝受到顯著影響，免疫活性也被明顯降低，這說明腸道菌群在該害蟲的營養(yǎng)代謝和免疫防御等過程中扮演重要角色(Muhammadetal., 2017, 2019a, 2019b; Hebinezaetal., 2019)。與其他病原細(xì)菌一樣，絕大多數(shù)腸道細(xì)菌都會代謝釋放肽聚糖(peptidoglycan, PGN)到宿主腸腔內(nèi)(Chu and Mazmanian, 2013)，而肽聚糖正是昆蟲識別“異己”進(jìn)而激活其免疫系統(tǒng)的一種重要抗原物質(zhì)(Royet and Dziarski, 2007)。因此，對于宿主昆蟲來說，如何科學(xué)地管理來自腸道菌群的肽聚糖而避免腸道免疫的過度激活來維持健康的腸道菌群穩(wěn)態(tài)是一個重要挑戰(zhàn)。在昆蟲體內(nèi)，肽聚糖識別蛋白(peptidoglycan recognition protein, PGRP)識別肽聚糖是激活其免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)(Royetetal., 2011; 楊青泰等, 2018)。源于腸道菌群的肽聚糖可以穿透腸壁進(jìn)入血淋巴進(jìn)而影響宿主發(fā)育并增強(qiáng)宿主的免疫能力(Round and Mazmanian, 2009)，而且宿主的Toll-like免疫識別受體參與介導(dǎo)腸道菌群提高宿主適合度的生理過程(Kubinak and Round, 2012)。我們的前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)，紅棕象甲具有一個編碼位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的PGRP的功能基因RfPGRP-L2，而且該基因的編碼蛋白可能在該害蟲與其腸道菌群的互作過程中扮演關(guān)鍵角色。在本研究中，綜合運(yùn)用RNAi、RT-qPCR、重組蛋白原核表達(dá)和基于細(xì)菌16S rRNA的高通量測序等多種手段解析了胞質(zhì)型肽聚糖識別蛋白RfPGRP-L2的組織表達(dá)譜、免疫功能特征及其在該害蟲腸道菌群穩(wěn)態(tài)調(diào)控和維持中的作用。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

紅棕象甲的實(shí)驗(yàn)室種群飼養(yǎng)在人工氣候培養(yǎng)箱中(DRX-260，寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。雌雄成蟲配對飼養(yǎng)在圓柱狀透明塑料盒(直徑7 cm，高10 cm)中，盒蓋上有紗布遮擋的孔以保證空氣流通。成蟲的飼養(yǎng)條件為溫度27±1℃、相對濕度75%±5%和光周期12L∶12D，用切片的新鮮甘蔗喂食，每4～5 d換一次甘蔗。在甘蔗片更換的過程中，小心剖開舊甘蔗片，用毛筆輕輕挑出其中的蟲卵，并置于含有潤濕濾紙的玻璃培養(yǎng)皿(直徑7 cm)中，然后將培養(yǎng)皿放入人工培養(yǎng)箱中待卵孵化。初孵幼蟲逐條挑出并轉(zhuǎn)移至含有新鮮甘蔗片的潔凈培養(yǎng)皿飼養(yǎng)，每皿僅放1頭幼蟲，每4～5 d更換一次甘蔗，幼蟲的飼養(yǎng)條件為溫度27±1℃、相對濕度75%±5%和光周期0L∶24D。幼蟲化蛹后，取出甘蔗片后加入一些干凈潮濕的甘蔗渣，待其羽化成成蟲。其中的部分4齡幼蟲用于后續(xù)的試驗(yàn)處理。

1.2 紅棕象甲RfPGRP-L2的序列分析

利用ORF Finder(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)和ExPASy-Translate Tool(https:∥web.expasy.org/translate/)分別預(yù)測RfPGRP-L2的開放閱讀框和其編碼的氨基酸序列，隨后采用在線分析工具SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)的一般模式(normal mode)預(yù)測RfPGRP-L2所含有的保守結(jié)構(gòu)域，使用軟件MEGA 5.0中的最大似然法進(jìn)行RfPGRP-L2與其他同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.3 紅棕象甲RfPGRP-L2的組織表達(dá)譜分析

隨機(jī)選取健康的紅棕象甲4齡幼蟲解剖獲取不同組織(頭、脂肪體、表皮、前腸、中-后腸和血淋巴)，每種組織設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)含3頭試蟲。然后參照Dawadi等(2018)描述的方法步驟采用TRIzol法(ThermoFisher Scientific, 美國)從組織中提取總RNA。用微量分光光度計NanoDrop 2000和瓊脂糖凝膠電泳分別檢測所獲總RNA的RNA濃度、純度及完整性，隨后將符合要求的樣品保存在-80℃?zhèn)溆?，利用Verso cDNA Synthesis Kit(ThermoFisher Scientific, 美國)合成cDNA。根據(jù)Dawadi等(2018)的報道，利用在線引物設(shè)計軟件primer 3.0(http:∥bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)設(shè)計RT-qPCR引物(表1)。采用FastStart Universal SYBR Green Master (Roche, Cat.No.04913850001)試劑盒在ABI 7500熒光定量PCR儀(Life Technology, 美國)上進(jìn)行RT-qPCR，反應(yīng)總體系(20 μL): 上下游引物(10 μmol/L)各0.3 μL, cDNA模板1 μL, Super Mix10 μL, 滅菌的去離子水8.4 μL。RT-qPCR程序: 95℃預(yù)變性10 min; 95℃變性15 s, 61℃退火延伸1 min, 40個循環(huán)。以紅棕象甲的Rfβ-actin基因?yàn)閮?nèi)參(Dawadietal., 2018)，采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行相對表達(dá)量的計算。

1.4 細(xì)菌感染對紅棕象甲腸道和脂肪體中RfPGRP-L2表達(dá)量的影響

為明確對細(xì)菌感染的響應(yīng)特征，利用大腸桿菌EscherichiacoliDH5α和金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus經(jīng)注射(注射1 μL OD600=1.6的菌液)和喂食(取食涂抹了1 mL OD600=1.6的菌液的甘蔗薄片)兩種不同的方式分別感染紅棕象甲的4齡幼蟲，在感染后的6, 12和24 h解剖獲取腸道和脂肪體并提取總RNA。每個處理設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)含3頭試蟲。每個處理取1 μg總RNA用Verso cDNA Synthesis Kit(Thermo, AB1453B)反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備RT-qPCR的cDNA模板。引物序列見表1，RT-qPCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同1.3節(jié)，采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行相對表達(dá)量的計算。

1.5 紅棕象甲RfPGRP-L2的原核表達(dá)、純化與體外功能分析

基于PAS(PCR-based accurate synthesis)方法設(shè)計引物，并在引物的兩端各設(shè)計保護(hù)性堿基(表1)，以1.3節(jié)中的cDNA為模板，用高保真酶Taq-LA(大連寶生物工程有限公司)擴(kuò)增并將其克隆連接至表達(dá)載體pET-32a上，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-RfPGRP-L2并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，測序比對選擇正確的陽性克隆用于后續(xù)的誘導(dǎo)表達(dá)試驗(yàn)(Dawadietal., 2018)。使用AXYGEN的質(zhì)粒小提試劑盒提取表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-RfPGRP-L2并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Arctic ExpressTM感受態(tài)細(xì)胞(南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司)中，接入含有50 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)基中于37℃下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，20℃ 220 r/min振搖過夜，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。室溫下4 000 r/min離心10 min富集菌體，用PBS重懸并再次富集菌體后用細(xì)胞裂解液(20 mmol/L Tris-HCl, 含1 mmol/L PMSF,細(xì)菌專用蛋白酶抑制劑混合物，pH 8.0)重新懸浮，于冰上進(jìn)行超聲破碎20 min，將超聲破碎的細(xì)胞裂解液于4℃ 10 000 r/min離心20 min，收集沉淀。包涵體經(jīng)過變復(fù)性的方式，重溶目標(biāo)蛋白，通過Ni柱親和純化獲得目標(biāo)蛋白，使用12% SDS-polyacrylamide gels (Bio-Rad)進(jìn)行SDS-PAGE并用考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)合Western blotting進(jìn)行重組蛋白質(zhì)量檢測(楊青泰等, 2018)。

表1 引物信息Table 1 Primer information

參照Dawadi等(2018)制備大腸桿菌DH5α和金黃色葡萄球菌的懸浮液，進(jìn)行重組蛋白RfPGRP-L2體外功能分析試驗(yàn)。RfPGRP-L2的細(xì)菌凝集反應(yīng)體系總體積為30 μL，包括5 μL細(xì)菌懸浮液和25 μL重組蛋白RfPGRP-L2(含或不含Zn2+，對照組用Tris-HCl緩沖液替代重組蛋白RfPGRP-L2)組成，混勻后于25℃水浴中孵育1 h，隨后將樣品制成玻片在Nikon ECLIPSE NI顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。RfPGRP-L2的抑菌活性反應(yīng)體系為30 μL，反應(yīng)體系與細(xì)菌凝集反應(yīng)體系相同，混勻并離心，于25℃水浴中孵育5 h后，在超凈工作臺中向每管樣品中加入1 mL LB培養(yǎng)基，于37℃ 200 r/min過夜培養(yǎng)；在96孔板中加入上述培養(yǎng)物樣品，每孔100 μL，利用酶標(biāo)儀SpectraMax(Molecular Devices Corp., 美國)測量菌液的OD600值。每個處理和對照設(shè)3個平行實(shí)驗(yàn)。

1.6 RfPGRP-L2的RNAi

根據(jù)1.2節(jié)獲得的RfPGRP-L2全長序列，使用在線軟件E-RNAi (https:∥www.dkfz.de/signaling/e-rnai3/idseq.php)設(shè)計并評估篩選最佳引物(表1)，利用MEGAscript? RNAi試劑盒(ThermoFisher Scientific, 美國)合成靶向該基因和EGFP的dsRNA，其中用于合成dsEGFP的引物序列引自王興紅(2018)(表1)。用無菌水清洗蟲體，并將其放于冰上進(jìn)行冷凍麻醉處理3 min，然后用10 μL Hamilton注射器(WPI Corp., 美國)給每頭4齡試蟲從腹部的節(jié)間膜注射2 μL dsRNA(500 ng/μL)，對照組試蟲注射等量的dsEGFP作為參照。注射處理的試蟲放回人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)，48 h后解剖收集腸道和脂肪體并提取總RNA，利用表1中的特異性引物進(jìn)行RT-qPCR檢測基靶因的沉默效率和該基因沉默對4個抗菌肽基因RfColeopericin,RfAtacin,RfCecropin和RfDefensin表達(dá)的影響，總RNA提取方法、RT-qPCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同1.3節(jié)。每個處理設(shè)4個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)含3頭試蟲。

1.7 RNAi干擾RfPGRP-L2后紅棕象甲對細(xì)菌感染的響應(yīng)檢測

根據(jù)Dawadi等(2018)的方法，注射dsRNA后的幼蟲置于正常飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)45 h后，注射2 μL EGFP標(biāo)記的大腸桿菌DH5α菌液(OD600=2.0)于4齡幼蟲體腔內(nèi)，3 h后在超凈工作臺中每頭幼蟲抽取100 μL血淋巴置于含有3 μL 5 mmol/L苯基硫脲(phenylthiourea, PTU)溶液的無菌EP管中，用無菌PBS進(jìn)行梯度稀釋，在稀釋的過程中用移液槍抽打使之充分混勻，隨后取稀釋液100 μL均勻涂布于含AMP的LB平板，LB平板倒置放于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，次日在Nikon ECLIPSE NI顯微鏡下統(tǒng)計每個平板上的細(xì)菌菌落數(shù)并拍照記錄，分析RfPGRP-L2沉默對紅棕象甲的血淋巴清除感染細(xì)菌能力的影響。每個處理設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)含3頭試蟲。

注射RfPGRP-L2的dsRNA后將4齡幼蟲放回培養(yǎng)箱正常飼養(yǎng)，12 h后對幼蟲進(jìn)行饑餓處理12 h后喂食含有EGFP標(biāo)記的大腸桿菌DH5α菌液(OD600=2.0)的新鮮甘蔗片24 h后，解剖提取腸道并放入含有1 mL無菌PBS的滅菌勻漿器中，充分研磨后取100 μL腸道勻漿液均勻涂布在含AMP的LB平板上，LB平板的培養(yǎng)條件和菌落計數(shù)方法同上，分析RfPGRP-L2沉默對紅棕象甲的腸道清除感染細(xì)菌能力的影響。每個處理設(shè)4個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)含3頭試蟲。

1.8 RNAi干擾RfPGRP-L2后健康紅棕象甲4齡幼蟲腸道菌群結(jié)構(gòu)組成檢測

注射RfPGRP-L2的dsRNA 48 h后，參照Muhammad等(2017)的描述方法，先用75%酒精清洗蟲體表面90 s，接著用無菌水淋洗蟲體3次，隨后在超凈工作臺中解剖獲取腸道并迅速放入事先盛有1 mL無菌PBS的潔凈EP管中，立即放入液氮中迅速冷凍后置于-80℃中保存，利用DNeasy Blood & Tissue試劑盒(Qiagen, 德國)提取腸道細(xì)菌總DNA，用NanoDrop 2000(ThermoFisher Scientific,美國)和1%凝膠電泳分別檢測所提DNA的濃度和質(zhì)量。每個處理設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)含3頭幼蟲。以利用DNeasy Blood & Tissue試劑盒提取的腸道細(xì)菌總DNA作為模板，用帶有barcode的特異性引物341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA的V3+V4區(qū)，PCR反應(yīng)體系: 0.2 μmol/L引物, Phusion? PCR預(yù)混液(New England Biolabs, 美國)15 μL, 腸道菌群總DNA模板10 ng，最后用滅菌的去離子水補(bǔ)足至30 μL。PCR反應(yīng)程序: 98℃預(yù)變性1 min; 98℃變性10 s, 50℃退火30 s, 72℃退火延伸60 s, 30個循環(huán); 72℃最后延伸5 min。技術(shù)重復(fù)3次，將PCR產(chǎn)物切膠回收，然后用QuantiFluorTM熒光計進(jìn)行定量。將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物等量混合并連接測序接頭、構(gòu)建測序文庫，Hiseq2500 PE250上機(jī)測序。參照Muhammad等(2017)和Dawadi等(2018)的數(shù)據(jù)分析流程，利用軟件工具Quantitative Insight into Microbial Ecology (QIIME)(V17.0, http:∥qiime.org/index.html)和Uprase(V7.0.1001，http:∥drive5.com/uprase)將測序獲得的raw reads進(jìn)行過濾、拼接組裝和再過濾，保證利用最有效的數(shù)據(jù)聚類成可操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)；獲得OTU后，利用QIIME軟件(17.0)比較分析干擾RfPGRP-L2對不同處理組間樣品腸道菌群的物種豐富度(Chao1指數(shù)和Ace指數(shù))、群落多樣性(Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù))和不同類群相對豐度的影響。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用單因素方差分析(ANOVA)檢測RfPGRP-L2在不同組織中的表達(dá)量差異、細(xì)菌感染對其在腸道和脂肪體中表達(dá)量的影響以及重組蛋白RfPGRP-L2對細(xì)菌生長的影響。采用t檢驗(yàn)分析RNAi效率以及RNAi對抗菌肽表達(dá)量、細(xì)菌清除效率、腸道可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)和腸道菌群多樣性的影響。所有統(tǒng)計分析使用SPSS 21.0軟件完成，利用Sigmaplot 12.0軟件制圖片。

2 結(jié)果

2.1 紅棕象甲RfPGRP-L2的序列特征

RfPGRP-L2(GenBank登錄號: MT830864)的cDNA序列全長為1 140 bp，其ORF長897 bp，編碼一個由298個氨基酸組成的多肽。該多肽無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，是一種胞質(zhì)型肽聚糖識別蛋白。其中的第121-264位氨基酸構(gòu)成一個保守的PGRP結(jié)構(gòu)域，RfPGRP-L2僅有第152位、第260位的組氨酸(H)和第186位酪氨酸(Y) 3個保守的酰胺酶活性位點(diǎn)，而第266位的酪氨酸(T)和第268位的半胱氨酸(C)均被替換，這表明該蛋白不具有酰胺酶活性所必需的5個保守氨基酸位點(diǎn)(圖1)。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，RfPGRP-L2與赤擬谷盜Triboliumcastaneum和黃粉蟲Tenebriomolitor的PGRP-LE聚為一小支，與黑腹果蠅D.melanogaster和騷擾阿蚊Armigeressubalbatus的PGRP-LE聚為一個大支(圖2)，表明RfPGRP-L2是黑腹果蠅PGRP-LE的直系同源蛋白。有趣的是，該RfPGRP-L2具有一個cRHIM基序——VRIG，該基序是形成功能性淀粉樣蛋白進(jìn)而激活NF-кB信號途徑所必需的保守結(jié)構(gòu)域(Kleinoetal., 2017)，這暗示RfPGRP-L2可能作為一種識別細(xì)菌肽聚糖的免疫識別受體參與調(diào)控紅棕象甲免疫反應(yīng)的應(yīng)答。

圖1 紅棕象甲RfPGRP-L2核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列分析Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of RfPGRP-L2 of Rhynchophorus ferrugineus下劃線表示PGRP保守結(jié)構(gòu)域；灰色底紋表示Ami_2結(jié)構(gòu)域；黑色方框表示保守的酰胺酶活性位點(diǎn)；圓圈表示突變的酰胺酶活性位點(diǎn)；紅色方框表示RHIM基序。The PGRP domain is underlined. Gray background represents the Ami_2 domain. The black boxes represent the conserved amidase activity sites. Circles represent the mutant amidase activity sites. The red box represents the RHIM motif.

圖2 最大似然法構(gòu)建的基于氨基酸序列的紅棕象甲RfPGRP-L2與其他昆蟲PGRP蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(1 000次重復(fù))Fig. 2 Phylogenetic tree of RfPGRP-L2 of Rhynchophorus ferrugineus with PGRP proteins from other insect species constructedby maximum likelihood method based on amino acid sequence (1 000 replicates)PGRP蛋白來源物種和GenBank登錄號Origin species of PGRP proteins and their GenBank accession numbers: AsPGRP-LE: 騷擾阿蚊Armigeres subalbatus (AEX31482.1); CqPGRP-LC: 致倦庫蚊Culex quinquefasciatus (XP_001842237.1); DmPGRP-LE: 黑腹果蠅Drosophila melanogaster (NP_573078.1); TcPGRP-LE: 赤擬谷盜Tribolium castaneum (XP_968926.1); TmPGRP-LE: 黃粉蟲Tenebrio molitor (HF935084.1); AaPGRP-LB: 埃及伊蚊Aedes aegypti (DQ023277.1); DmPGRP-LB: 黑腹果蠅Drosophila melanogaster (AAG23731.1); BtPGRP-LB: 歐洲熊蜂Bombus terrestris (XP_003400160.1); PrPGRP-LF: 菜粉蝶Pieris rapae (XP_022121530.1).

2.2 紅棕象甲RfPGRP-L2的組織表達(dá)譜

RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，RfPGRP-L2在紅棕象甲4齡幼蟲的血淋巴、前腸、中-后腸、頭、脂肪體、表皮各組織中均有表達(dá)，而且在不同組織中的表達(dá)量存在顯著差異(ANOVA:F5, 12=11.884,P<0.01)(圖3)。其中，該基因在血淋巴中的表達(dá)量顯著高于在中-后腸、脂肪體等其他組織，其中在前腸、中-后腸、頭和脂肪體中的表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差異(P>0.05)，說明RfPGRP-L2可能參與介導(dǎo)紅棕象甲體內(nèi)相關(guān)的免疫反應(yīng)。

圖3 RfPGRP-L2在健康紅棕象甲4齡幼蟲不同組織中的相對表達(dá)量Fig. 3 Relative expression levels of RfPGRP-L2 indifferent tissues of the healthy 4th instar larvaeof Rhynchophorus ferrugineus圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；柱上不同字母表示不同組織間基因表達(dá)量差異顯著(P<0.05, LSD多重比較檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SD. Different letters above bars represent significant difference in the gene expression level (P<0.05, LSD multiple comparison test). 圖8同The same for Fig. 8.

2.3 細(xì)菌感染對紅棕象甲腸道和脂肪體中RfPGRP-L2表達(dá)量的影響

比較發(fā)現(xiàn)，RfPGRP-L2對革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌的響應(yīng)更迅速，在被感染6 h后其表達(dá)量就顯著上調(diào)，而該基因的表達(dá)量在革蘭氏陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌感染12 h后才出現(xiàn)明顯上調(diào)(圖4)。在腸道中，注射感染金黃色葡萄球菌12 h后，RfPGRP-L2的表達(dá)量顯著高于注射大腸桿菌組和對照組(ANOVA:F2, 6=16.46,P<0.01)(圖4: A)；而注射感染大腸桿菌6, 12和24 h后，其表達(dá)量在腸道中均沒有顯著變化，表明金黃色葡萄球菌的注射感染會影響腸道中RfPGRP-L2表達(dá)量的變化。注射感染金黃色葡萄球菌12 h后，脂肪體中RfPGRP-L2的表達(dá)量顯著增加(ANOVA:F2, 6=6.61,P<0.05)(圖4: B)。喂食感染大腸桿菌6 h后，腸道中RfPGRP-L2的表達(dá)量顯著地高于喂食金黃色葡萄球菌組和對照組(ANOVA:F2, 6=16.99,P<0.01)(圖5: A)，而且喂食金黃色葡萄球菌不能明顯地誘導(dǎo)腸道中RfPGRP-L2的表達(dá)量上調(diào)。喂食感染大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均沒有明顯地影響該基因在脂肪體中的表達(dá)量(圖5: B)。以上結(jié)果表明，RfPGRP-L2參與調(diào)控紅棕象甲對革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌的腸道免疫反應(yīng)。

圖4 不同細(xì)菌注射感染后紅棕象甲4齡幼蟲腸道(A)和脂肪體(B)中RfPGRP-L2表達(dá)量的變化Fig. 4 Changes in expression level of RfPGRP-L2 in the gut (A) and fat body (B) of the 4th instar larvaeof Rhynchophorus ferrugineus after injection challenge with different bacteria各組織分別注射1 μL無菌磷酸鹽緩沖液(對照)、大腸桿菌菌液(OD600=1.6)和金黃色葡萄球菌(OD600=1.6)菌液。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；柱上大寫字母表示同一時間點(diǎn)不同處理間的基因表達(dá)量差異顯著，小寫字母表示同一處理不同時間點(diǎn)間基因表達(dá)量差異顯著(P<0.05, LSD多重比較檢驗(yàn))。Each tissue was injected with 1 μL sterile phosphate buffered saline (control), Escherichia coli suspension (OD600=1.6) and Staphylococcus aureus suspension (OD600=1.6), respectively. Data in the figure are mean±SD. Capital letters above bars represent significant difference in the gene expression level between different treatments at the same time point, and the lowercase letters represent significant difference in the gene expression level between different time points in the same treatment (P<0.05, LSD multiple comparison test). 圖5同The same for Fig. 5.

圖5 不同細(xì)菌喂食感染后紅棕象甲4齡幼蟲腸道(A)和脂肪體(B)中RfPGRP-L2表達(dá)量的變化Fig. 5 Changes in expression levels of RfPGRP-L2 in the gut (A) and fat body (B) of the 4th instar larvaeof Rhynchophorus ferrugineus after oral challenge with different bacteria幼蟲取食涂抹了1 mL OD600=1.6的菌液的甘蔗薄片Larvae were fed with the sugarcane slices smeared with 1 mL bacterial suspension with the OD600 value of 1.6.

2.4 重組蛋白RfPGRP-L2的細(xì)菌凝集和抑菌活性

重組蛋白RfPGRP-L2在上清液和沉淀中均有表達(dá)，而且沉淀中的表達(dá)量明顯高于上清液，表明靶蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。經(jīng)變復(fù)性實(shí)驗(yàn)純化回收和Western blot檢測證實(shí)，純化所得RfPGRP-L2的分子量大小符合預(yù)期且條帶單一，可用于后續(xù)功能分析實(shí)驗(yàn)(圖6)。在沒有RfPGRP-L2的情況下，反應(yīng)體系中的細(xì)菌細(xì)胞在載玻片上呈現(xiàn)均勻分布的狀態(tài)；當(dāng)RfPGRP-L2與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌液在25℃ 孵育1 h后， 兩種菌液體系都已發(fā)生細(xì)菌細(xì)胞凝集的現(xiàn)象，而且Zn2+的添加對凝集現(xiàn)象沒有明顯的影響(圖7)。結(jié)果表明RfPGRP-L2能夠識別結(jié)合大腸桿菌和金黃色葡萄球菌并引起凝集反應(yīng)。抑菌測試證實(shí)， RfPGRP-L2對大腸桿菌(ANOVA:F3,8=2.92,P=0.10)(圖8: A)和金黃色葡萄球菌(ANOVA:F3,8=0.73,P=0.56)(圖8: B)的生長都沒有顯著影響。

圖6 重組蛋白RfPGRP-L2純化后Western blot檢測Fig. 6 Western blot verification of the purifiedrecombinant protein RfPGRP-L2M: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker.

2.5 RfPGRP-L2的干擾效率

注射dsRNA 48 h后，RfPGRP-L2在紅棕象甲4齡幼蟲脂肪體(t6=3.10,P<0.05)和腸道(t6=2.59,P<0.05)中的表達(dá)量都顯著地低于對照組 (圖9)， 沉默效率分別為66.1%和53.3%， 表明注射dsRfPGRP-L2能夠顯著地降低RfPGRP-L2在該害蟲體內(nèi)的表達(dá)水平。

圖7 重組蛋白RfPGRP-L2對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的凝集作用Fig. 7 Agglutination of Escherichia coli and Staphylococcus aureus by the recombinant RfPGRP-L2紅色箭頭表示觀察到的細(xì)菌凝集現(xiàn)象；加號表示反應(yīng)體系中添加重組蛋白RfPGRP-L2或Zn2+，減號表示反應(yīng)體系中沒有添加重組蛋白RfPGRP-L2或Zn2+。The red arrow represents the bacterial agglutination observed. The plus symbol represents the addition of the recombinant protein RfPGRP-L2 or Zn2+ in the reaction system, while the minus symbol represents the absence of the recombinant protein RfPGRP-L2 or Zn2+ in the assays.

圖8 重組蛋白RfPGRP-L2對大腸桿菌(A)和金黃色葡萄球菌(B)生長的影響Fig. 8 Effect of the recombinant protein RfPGRP-L2 on the growth of Escherichia coli (A) and Staphylococcus aureus (B)Tris: 只添加Tris鹽酸緩沖液Only Tris-HCl buffer was added; Tris+Zn2+: 添加了Tris鹽酸緩沖液和Zn2+ Addition of Tris-HCl buffer and Zn2+; RfPGRP-L2: 只添加了重組表達(dá)蛋白Only the recombinant protein was added; RfPGRP-L2+Zn2+: 同時添加了重組表達(dá)蛋白和Zn2+ Addition of recombinant protein and Zn2+.

圖9 紅棕象甲4齡幼蟲腸道和脂肪體中RfPGRP-L2的RNAi干擾效率Fig. 9 RNAi efficiency of RfPGRP-L2 in the gutand fat body of the 4th instar larvae ofRhynchophorus ferrugineus注射dsEGFP為對照組；圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；柱上星號表示兩組之間基因表達(dá)量有顯著性差異(P<0.05, t檢驗(yàn))。Injection of dsEGFP as the control group. Data in the figure are mean±SD. Asterisk above bars indicates significant difference in the gene expression level between the two groups (P<0.05, t-test). 圖10-12同The same for Figs. 10-12.

2.6 干擾RfPGRP-L2對紅棕象甲4齡幼蟲清除感染大腸桿菌能力的影響

RfPGRP-L2沉默組試蟲血淋巴中的綠色熒光蛋白標(biāo)記的大腸桿菌菌落數(shù)為4 025.00±2 345.74 CFU/mL，是對照組的10倍(t6=3.00,P<0.05)(圖10: A)，表明RfPGRP-L2的沉默顯著降低了血淋巴對感染細(xì)菌的清除能力。脂肪體中RfCecropin的表達(dá)量顯著降低(t6=2.75,P<0.05)，而其他3個抗菌肽基因RfDefensin(t6=0.51,P=0.63),RfAttacin(t6=1.60,P=0.16)和RfColeoptericin(t6=2.15,P=0.075)的表達(dá)量沒有顯著變化(圖11: A)。腸道中綠色熒光蛋白標(biāo)記大腸桿菌的菌落數(shù)顯著增加(t4=2.81,P<0.05)(圖10: B)，表明該害蟲對腸道中感染細(xì)菌的清除能力因RfPGRP-L2的沉默而被削弱。腸道中RfCecropin的表達(dá)量顯著下降(t6=2.78,P<0.05)(圖11: B)。上述結(jié)果證明RfPGRP-L2不僅參與紅棕象甲系統(tǒng)免疫的激活，還介導(dǎo)腸道內(nèi)的免疫反應(yīng)來清除所感染的非腸道細(xì)菌。

2.7 干擾RfPGRP-L2對紅棕象甲4齡幼蟲腸道菌群結(jié)構(gòu)組成的影響

圖10 大腸桿菌侵染RNAi干擾RfPGRP-L2后的紅棕象甲4齡幼蟲血淋巴(A)和腸道(B)中菌落數(shù)Fig. 10 Number of Escherichia coli colonies in the hemolymph (A) and gut (B) of the 4th instar larvaeof Rhynchophorus ferrugineus after RNAi of RfPGRP-L2

圖11 RNAi干擾RfPGRP-L2后紅棕象甲4齡幼蟲脂肪體(A)和腸道(B)中抗菌肽基因的表達(dá)量變化Fig. 11 Changes in the expression levels of antimicrobial peptide genes in the fat body (A) and gut (B)of the 4th instar larvae of Rhynchophorus ferrugineus after RNAi of RfPGRP-L2

RfPGRP-L2被沉默后，腸道中可培養(yǎng)細(xì)菌的菌落數(shù)為7 733.33±1 950.21 CFU/mL，而對照組腸道中的可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)為3 300.00±1 452.58 CFU/mL，前者顯著大于后者(t4=3.16,P<0.05)(圖12)，說明RfPGRP-L2的沉默會導(dǎo)致紅棕象甲幼蟲腸道菌群數(shù)量的明顯增加。RfPGRP-L2的干擾對菌群物種豐富度(Chao1指數(shù):t6=-0.004,P=0.10; Ace指數(shù):t6=0.34,P=0.75)(圖13: A)和群落多樣性(Shannon-Wiener指數(shù):t6=-0.25,P=0.81; Simpson指數(shù):t6=-0.11,P=0.92)(圖13: B)都沒有顯著的影響。但是一些腸道細(xì)菌的相對豐度因RfPGRP-L2的沉默而發(fā)生了改變。例如，變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和軟壁菌門(Tenericutes)為腸道優(yōu)勢菌(Muhammadetal., 2017)，但是RfPGRP-L2被干擾后，軟壁菌門的相對豐度增加了41.1%，厚壁菌門的相對豐度減少了67.9%(圖14: A)。在科水平上，RfPGRP-L2的干擾導(dǎo)致乳酸桿菌科(Lactobacillaceae)細(xì)菌的相對豐度降低了60.9%，而蟲原體科(Entomoplasmataceae)和明串珠菌科(Leuconostocaceae)細(xì)菌的相對豐度分別增加了68.0%和91.8%(圖14: B)。這些數(shù)據(jù)表明RfPGRP-L2的沉默能夠造成紅棕象甲幼蟲腸道菌群的數(shù)量增加并改變腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)，說明RfPGRP-L2在紅棕象甲腸道菌群穩(wěn)態(tài)的調(diào)控中具有重要作用。

圖12 RfPGRP-L2干擾后對紅棕象甲4齡幼蟲腸道中可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)量的影響Fig. 12 Effect of RNAi of RfPGRP-L2 on the numberof culturable bacterial colonies in the gut of the 4thinstar larvae of Rhynchophorus ferrugineus

圖13 RNAi干擾RfPGRP-L2對紅棕象甲4齡幼蟲腸道細(xì)菌物種豐富度(A)和群落多樣性(B)的影響Fig. 13 Effect of RNAi of RfPGRP-L2 on the species richness (A) and community diversity (B)of gut bacteria of the 4th instar larvae of Rhynchophorus ferrugineusChao: Chao1指數(shù)Chao1 index; Ace: Ace指數(shù)Ace index; Shannon: Shannon-Wiener指數(shù)Shannon-Wiener index; Simpson: Simpson指數(shù)Simpson index. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。Data in the figure are mean±SD.

圖14 RNAi干擾RfPGRP-L2對紅棕象甲4齡幼蟲腸道菌群在門(A)和科(B)水平上組成的影響Fig. 14 Effect of RNAi of RfPGRP-L2 on the composition of gut bacteria of the 4th instar larvaeof Rhynchophorus ferrugineus at the levels of phylum (A) and family (B)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)RfPGRP-L2編碼的多肽具有一個PGRP功能結(jié)構(gòu)域(圖1)，但沒有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，表明RfPGRP-L2的編碼蛋白是一種胞質(zhì)型肽聚糖識別蛋白(Royetetal., 2011)?，F(xiàn)有證據(jù)表明具有酰胺酶活性的PGRP一般都有HYHTC 5個保守的氨基酸位點(diǎn)(Chenetal., 2014; Dawadietal., 2018)。但是RfPGRP-L2僅有其中的3個保守酰胺酶活性位點(diǎn)，而另外兩個位點(diǎn)均被替換，這暗示紅棕象甲的RfPGRP-L2可能不具有酰胺酶活性，從而無法像T7噬菌體溶菌酶和酰胺酶活性PGRPs能夠降解肽聚糖(Mellrothetal., 2003; Zaidman-Rémyetal., 2006; Dawadi etal., 2018)。然而有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)RfPGRP-L2具有一個由VRIG這 4個氨基酸殘基所構(gòu)成的RHIM基序。RHIM基序參與介導(dǎo)形成的功能性淀粉樣纖維(Amyloid fibril)為激活I(lǐng)MD免疫信號所必需(Aggarwaletal., 2008; Kleinoetal., 2017)。因此，RfPGRP-L2中的RHIM基序可能在將細(xì)菌識別的信號傳遞至細(xì)胞核內(nèi)、激活相關(guān)的免疫信號通路并激發(fā)效應(yīng)因子(如抗菌肽)的產(chǎn)生過程中扮演關(guān)鍵角色。此外，Pirk是NF-кB信號通路中的一個重要負(fù)調(diào)控因子(Kleinoetal., 2008)，可以通過PGRP-LC和-LE中的RHIM基序特異性地與Imd互作進(jìn)而抑制功能性淀粉樣纖維的形成，從而阻礙IMD下游信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)(Lhocineetal., 2008; Kleinoetal., 2017)。因此，該保守基序的存在暗示RfPGRP-L2可能是紅棕象甲相關(guān)免疫信號通路中的一個重要負(fù)調(diào)控作用靶標(biāo)，以避免該害蟲體內(nèi)免疫系統(tǒng)的過度激活從而維持健康的免疫穩(wěn)態(tài)。

RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)RfPGRP-L2在血淋巴、脂肪體和腸道等免疫相關(guān)組織中的表達(dá)豐度明顯高于其他組織(圖3)，這暗示RfPGRP-L2可能參與介導(dǎo)調(diào)控紅棕象甲的免疫反應(yīng)(Dawadietal., 2018)。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的感染均能顯著誘導(dǎo)RfPGRP-L2的表達(dá)。Muhammad等(2019b)研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群能夠上調(diào)紅棕象甲的相關(guān)免疫基因并增強(qiáng)其免疫防御活性。這些證據(jù)說明部分對宿主無害的微生物能夠刺激宿主體內(nèi)免疫基因的表達(dá)從而提高宿主對病原微生物的免疫力。另外，重組表達(dá)的RfPGRP-L2可以引起大腸桿菌和金黃色葡萄球菌發(fā)生凝集反應(yīng)(圖7)，這說明RfPGRP-L2既可以識別含DAP型PGN的革蘭氏陰性細(xì)菌，也能識別含Lys型PGN的革蘭氏陽性細(xì)菌。細(xì)菌的喂食感染能夠使腸道中RfPGRP-L2的表達(dá)顯著上調(diào)(圖5: A)，而對脂肪體中的表達(dá)量無顯著影響(圖5: B)，這可能是由于脂肪體和腸道中可能存在不同的免疫調(diào)控機(jī)制(Tzouetal., 2000)。更為有趣的是，RfPGRP-L2被干擾后，紅棕象甲幼蟲的血淋巴和腸道清除綠色熒光蛋白標(biāo)記的大腸桿菌的能力被顯著地抑制(圖10)，脂肪體中抗菌肽基因RfCecropin的表達(dá)量顯著低于對照組(圖11: A)。這些數(shù)據(jù)說明RfPGRP-L2干擾在一定程度上阻礙了該害蟲的系統(tǒng)免疫和腸道局部免疫的應(yīng)答反應(yīng)。另外，體外研究還證實(shí)重組蛋白RfPGRP-L2不能抑制細(xì)菌的生長(圖8)，說明紅棕象甲的RfPGRP-L2不具有酰胺酶活性，無法降解細(xì)菌PGN抑制細(xì)菌的生長。這可能是由于RfPGRP-L2不含有酰胺酶活性所必需的5個保守氨基酸位點(diǎn)所致(Chenetal., 2014; Dawadietal., 2018)。

我們的前期工作發(fā)現(xiàn)，相比Toll-like pathway而言，核轉(zhuǎn)錄因子RfRelish介導(dǎo)的IMD-like信號通路在紅棕象甲與其腸道菌群共生關(guān)系的維持中占主導(dǎo)地位，這可能是由于腸道菌群主要由革蘭氏陰性細(xì)菌所構(gòu)成(Xiaoetal., 2019; Muhammadetal., 2020)。在本研究中，RfPGRP-L2的沉默造成了腸道中可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)的顯著增加(圖12)，并且改變了其腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)(圖14)；而且腸道中RfCecropin的表達(dá)量也顯著低于對照組(圖11: B)。這表明RfPGRP-L2的沉默阻礙了腸上皮細(xì)胞對來自腸道菌群PGN的識別，進(jìn)而影響了相關(guān)免疫信號通路的激活及抗菌肽的產(chǎn)生?？咕氖莿游镎{(diào)控其腸道微生物的一種關(guān)鍵免疫效應(yīng)因子(Ryuetal., 2008)。因此，RfPGRP-L2沉默導(dǎo)致腸道免疫效應(yīng)基因表達(dá)的降低削弱了該害蟲對其腸道菌群的調(diào)控，從而造成了腸道細(xì)菌數(shù)量的增加及其組成的改變。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)紅棕象甲具有跨膜型、分泌型和胞質(zhì)型3種不同類型的PGRP，其中兩個具有酰胺酶活性的肽聚糖識別蛋白RfPGRP-S1和RfPGRP-LB都能降解肽聚糖而避免腸道免疫的過度激活來調(diào)控該害蟲的腸道菌群穩(wěn)態(tài)(Dawadietal., 2018; 王興紅, 2018)。然而，調(diào)控這些分泌型PGRP產(chǎn)生的機(jī)理還不清楚。例如，RfPGRP-L2是否與這些分泌型PGRP之間存在互作？它們之間的互作在該害蟲腸道菌群穩(wěn)態(tài)的調(diào)控中扮演什么角色？這些問題還需要進(jìn)一步的深入研究。