劉洪鍔, 汪麗枝, 劉祖蓮, 衣玫妍, 馮啟理, 黃勇平, 相 輝,*

(1. 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院昆蟲科學(xué)與技術(shù)研究所, 廣東省昆蟲發(fā)育生物學(xué)與應(yīng)用技術(shù)重點實驗室/廣州市昆蟲發(fā)育調(diào)控與應(yīng)用研究重點實驗室, 廣州510631; 2. 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所, 上海200032)

配子生成素結(jié)合蛋白2(gametogenetin binding protein 2, GGNBP2)是鋅指蛋白家族中的一種保守蛋白。該蛋白在睪丸中的表達水平遠(yuǎn)高于在其他組織中的，已有不少文獻揭示其生理功能與生殖過程密切相關(guān)(曹志國, 2005; Zhangetal., 2005; 張進, 2005; 劉凌云, 2017; 郭凱敏, 2018; Guoetal., 2018)。ggnbp2基因最早被發(fā)現(xiàn)時，被認(rèn)為是二噁英的一個目的基因，產(chǎn)物用于調(diào)節(jié)生殖毒性。其在睪丸中以及整個生精過程中高度表達，和DNA的合成和有絲分裂有密不可分的關(guān)系(關(guān)瑞, 2012)。GGNBP2參與整個生精過程，并且與精子發(fā)生中必不可少的有絲分裂存在關(guān)聯(lián)，據(jù)報道(Guoetal., 2018)，GGNBP2可能是與GGN1(gametogenetin protein 1)相互作用介導(dǎo)，在精母細(xì)胞的減數(shù)分裂過程中，在DNA雙鏈斷裂(DNA double strand break,DSB)修復(fù)中起重要作用，GGNBP2敲除的小鼠，在精子分化過程中引起變形缺陷從而導(dǎo)致小鼠生殖腺內(nèi)無成熟的精子(郭凱敏, 2018)。另外，該基因還參與哺乳動物胎兒發(fā)育過程，是成功懷孕的重要因素，并作為關(guān)鍵因子參與胎盤發(fā)育過程中的分化(Lietal., 2016)。

GGNBP2缺失會導(dǎo)致C-Met-Stat3信號激活，改變了滋養(yǎng)層干細(xì)胞(trophoblast stem cells, TSC)增殖與分化，最終導(dǎo)致胎盤血管結(jié)構(gòu)，只有g(shù)gnbp2基因正確表達才能維持TSC增殖平衡而成功懷孕和進行正常的胚盤發(fā)育過程的分化(Lietal., 2016)。在腫瘤研究中，GGNBP2作為抑癌因子參與抑制乳腺癌(李春艷, 2016; 高學(xué)仁等, 2017; Liuetal., 2019)、卵巢癌(Lanetal., 2016)和膠質(zhì)瘤細(xì)胞(王佳等, 2016)的增殖、遷移和侵襲(Zhanetal., 2017)。

盡管在哺乳動物中的研究證實，GGNBP2在配子發(fā)生和生殖過程中發(fā)揮重要作用，但是在昆蟲中的存在性及功能仍完全未知，使用家蠶Bombyxmoriggnbp2基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對(blastx)(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastx)，在斜紋夜蛾Spodopteraitura等諸多昆蟲中都能找到該基因的同源序列，表明該基因在昆蟲亦廣泛存在(Guoetal., 2018; Xiangetal., 2018; Liuetal., 2019)，但是其功能仍然未知。有趣的是，這個未知功能的基因，在家蠶的馴化過程可能發(fā)揮作用。我們前期的研究鑒定到該基因是候選馴化基因之一(Xiangetal., 2018)，但是缺乏該基因的功能證據(jù)。我們猜測其可能對家蠶生殖、繁殖能力產(chǎn)生一定的影響。為此我們在家蠶中來研究ggnbp2的基因功能，以期探討該基因在家蠶馴化過程中可能的作用。

1 材料與方法

1.1 家蠶飼養(yǎng)

本研究所用家蠶B.mori為非滯育品系Nistari蠶卵，由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所和中國科學(xué)院昆明動物研究所提供。幼蟲用新鮮的采摘的桑葉飼養(yǎng)。注射質(zhì)粒pBac[IE-EGFP-Nos-Cas9](Nos-Cas9)后得到的穩(wěn)定傳代的Cas9單品系家蠶Nistari(下稱“Nos-Cas9轉(zhuǎn)基因品系”)，由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所黃勇平教授實驗室提供。

1.2 基因相關(guān)信息及表達數(shù)據(jù)的獲得

根據(jù)課題組前期研究成果(Xiangetal., 2018)，以及更新版的家蠶基因組和注釋信息(doi.org/10.5061/dryad.fn82qp6)，得到ggnbp2基因的序列信息。通過與NCBI中的NR庫(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行蛋白質(zhì)序列比對，得到對應(yīng)的家蠶參考序列(GenBank登錄號: XP_004930406.1)。根據(jù)基因芯片探針編號，從家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(https:∥silkworm.genomics.org.cn/)獲得的家蠶5齡第3天幼蟲不同組織的芯片表達數(shù)據(jù)中得該基因的基因芯片數(shù)據(jù)。

1.3 ggnbp2基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

通過blastp比對NCBI數(shù)據(jù)庫中的NR庫(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，下載13個物種的GGNBP2同源蛋白序列，從NCBI的NR蛋白庫中獲取牛Bostaurus和智人Homosapiens的GGNBP序列作為外群，進行后續(xù)分析。將最終確定的蛋白序列通過MEGA7軟件(Kumaretal., 2016)中的ClustalW進行多序列比對，將比對后的文件轉(zhuǎn)化為nex格式，通過beast軟件使用貝葉斯法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其參數(shù)chain length為10 000 000，logEvery為1 000，burnin為0.1。樹文件用FigTree軟件(1.4.3版本)生成圖形文件。

1.4 Bmggnbp2基因的人工選擇信號分析

利用我們前期研究建立的家蠶-野桑蠶(Bombyxmandarina)群體基因組多態(tài)性數(shù)據(jù) (https:∥doi.org/10.5061/dryad.fn82qp6) (Xiangetal., 2018)，并根據(jù)其中篩選馴化過程人工選擇信號的方法(Xiangetal., 2018)，進行Bmggnbp2基因區(qū)域人工選擇信號分析。具體而言，以5 kb基因組區(qū)域為窗口，500 bp為步長，計算全基因組每個窗口進行種群分歧度系數(shù)(Fst)和家蠶地方品種的核苷酸多態(tài)性參數(shù)(π)，以最高1%的Fst以及最低5%的π作為人工選擇信號篩選閾值，對Bmggnbp2基因及上下游2 000 bp區(qū)域進行選擇掃蕩(selective sweep)的掃描。

1.5 家蠶Bmggnbp2基因突變體構(gòu)建

大腸桿菌EscherichiacoliDH5α是本實驗保存的菌種。pMD18-T載體購自TaKaRa公司。pBac[IE1-DsRed-U6-sgRNA1+2]、輔助質(zhì)粒Helper1和Helper2及piggyBac mRNA IFP2載體由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所黃勇平教授實驗室保存。參考Zeng等(2017)的方法，基于Bmggnbp2基因序列，利用sgRNA在線設(shè)計軟件CRISPRdirect(http:∥crispr.dbcls.jp/)設(shè)計了sgRNA1和sgRNA2(間隔2 330 bp)，分別位于第4和第7號外顯子上(圖1)，靶點遵循：5′-N(20)-NGG-3′(N為任意堿基)。利用質(zhì)粒pBac[IE1-DsRed-U6-sgRNA1+2]，通過多輪PCR(KOD-plus, TOYOBO)(引物見表1)多片段重組(MultiS One Step Cloning Kit, Vazyme)的方法將設(shè)計的Bmggnbp2敲除靶位點sgRNA1和sgRNA2通過KpnⅠ(TaKaRa)和HindⅢ(TaKaRa)替換到原質(zhì)粒DNA中，最終獲得piggyBac轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體pBac [IE1-DsRed-U6-Bmggnbp2sgRNA1+2]。

表1 引物信息Table 1 Primer information

piggyBac mRNA IFP2載體用XbaⅠ(Thermo Scientific)按說明書配制酶切體系后37℃過夜酶切進行線性化，用酚/氯 仿/異戊醇進行純化。使mMESSAGE mMACHINE?試劑盒(T7)(Ambion)進行piggyBac mRNA IFP2的體外轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物使用酚/氯仿/異戊醇進行純化，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后分裝備用。

將新羽化的家蠶Nistari雄、雌成蟲交配5 h以上，將雄雌成蟲分開，收集新鮮的Nistari卵，在2 h內(nèi)用Eppendorf雙針顯微注射系統(tǒng)完成蠶卵的顯微注射。注射體系：pBac [IE1-DsRed-U6-Bmggnbp2sgRNA1+2]質(zhì)粒400 ng/μL, Helper1質(zhì)粒400 ng/μL, Helper2質(zhì)粒400 ng/μL, piggyBac mRNA IFP2的mRNA 200 ng/μL, RNase-free water補齊到25 μL。每個蠶卵注射10 nL，注射結(jié)束后，將補洞后的卵在通風(fēng)櫥吹風(fēng)10 min；結(jié)束后放入培養(yǎng)箱中26℃、相對濕度70%、黑暗條件下催青。

1.6 Bmggnbp2敲除突變體熒光篩選

取1.5節(jié)注射的G0代蟻蠶孵出，桑葉正常喂食飼養(yǎng)至化蛾后，相互交配。待G1代卵孵化出后，由于pBac[IE1-DsRed-U6-Bmggnbp2sgRNA1+2]載體帶有紅色熒光蛋白標(biāo)記基因，在熒光顯微鏡下，篩選帶有紅色熒光的蟻蠶，穩(wěn)定飼養(yǎng)傳代，即可認(rèn)定為pBac [IE1-DsRed-U6-Bmggnbp2sgRNA1+2]轉(zhuǎn)基因品系(下稱U6-sgRNA轉(zhuǎn)基因品系)。U6-Bmggnbp2sgRNA轉(zhuǎn)基因品系與Nos-Cas9轉(zhuǎn)基因品系(綠色熒光標(biāo)記)雜交，后代篩選具有既有紅色熒光又有綠色熒光的蟻蠶，表明[IE1-DsRed-U6-Bmggnbp2sgRNA1+2]載體和Nos-Cas9載體在蠶體內(nèi)正常表達，不斷表達的sgRNA和Cas9蛋白結(jié)合后，當(dāng)代通過熒光篩選既有紅色熒光又有綠色熒光的個體可以獲得Bmggnbp2基因的敲除突變體△Bmggnbp2。同時U6-Bmggnbp2sgRNA轉(zhuǎn)基因品系與Nos-Cas9轉(zhuǎn)基因品系分別自由交配后代飼養(yǎng)傳代作為對照組。

1.7 Bmggnbp2突變體基因型檢測

隨機取10頭1.6節(jié)篩選到具有雙熒光的家蠶突變體△Bmggnbp2 2齡幼蟲組成混合樣，用DNA抽提液(pH≥7.5，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)提取混合樣品基因組DNA。在靶基因位點周圍300-500 bp設(shè)計引物(表1)，以基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系(25 μL): Premix Taq Version 2.0 12.5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL, 基因組DNA模板1.0 μL, 滅菌雙蒸水補足至25 μL。擴增程序: 95℃預(yù)變性3 min; 95℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 2 min, 32個循環(huán); 72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物連接到pMD-18T載體，挑單克隆送到廣州擎科生物技術(shù)公司測序，進行基因型檢測，測序結(jié)果與野生型基因組進行BLAST比對以確定突變情況。

1.8 Bmggnbp2突變體表型檢測

對1.6節(jié)篩選到的突變體后代和對照(U6-Bmggnbp2sgRNA和Nos-Cas9兩個單品系)后代進行正常的飼養(yǎng)，稱量突變體△Bmggnbp2(n=75), U6-Bmggnbp2sgRNA品系(n=77)和Nos-Cas9品系(n=50)的全繭重、蛹重和繭殼重；分別統(tǒng)計突變體△Bmggnbp2個體(n=30)和Nos-Cas9對照個體(n=10)的單雌產(chǎn)卵量和卵孵化率。 實驗數(shù)據(jù)用SPSS25.0進行ANOVA統(tǒng)計分析，采用t檢驗分析處理與對照間在0.05水平的差異顯著性，用GraphPad Prism 6作圖。

解剖10頭雄性蛹期第4天的突變體△Bmggnbp2的精巢和相同時期的Nos-Cas9對照雄蛹精巢，放置于生理鹽水中，于體視顯微鏡(Nikon, DS-Ri2)觀察比對精巢的形態(tài)變化并拍照。

2 結(jié)果

2.1 Bmggnbp2的系統(tǒng)發(fā)育分析

序列比對分析發(fā)現(xiàn)該基因在斜紋夜蛾等幾種鱗翅目昆蟲中都呈現(xiàn)高度保守性。貝葉斯法構(gòu)樹結(jié)果顯示(圖2)，家蠶的BmGGNBP2與粉紋夜蛾Trichoplusiani、斜紋夜蛾Spodopteralitura、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、煙芽夜蛾Heliothisvirescens和車前角夜蛾Arctiaplantaginis的GGNBP2聚到一支，揭示了該基因在斜紋夜蛾等鱗翅目中高度保守，且在鱗翅目昆蟲中亦普遍存在，但與哺乳動物存在差異。

圖2 基于核苷酸序列構(gòu)建的家蠶Bmggnbp2和其他鱗翅目昆蟲ggnbp2的分子進化分析Fig. 2 Molecular evolution analysis of Bmggnbp2 of Bombyx mori and ggnbp2from other lepidopteran insects based on nucleotide sequence同源序列來源物種及其GenBank登錄號 Source species of homologous sequences and their GenBank accession numbers: Bm: 家蠶Bombyx mori (XP_004930406.1); Ha: 棉鈴蟲Helicoverpa armigera (XP_021185134.1); Ms: 煙草天蛾Manduca sexta (XP_030023210.1); Tn: 粉紋夜蛾Trichoplusia ni (XP_026724666.1); Sl: 斜紋夜蛾Spodoptera litura (XP_022819345.1); Hv: 煙芽夜蛾Heliothis virescens(PCG81109.1); Ap:車前角夜蛾Arctia plantaginis (CAB3228591); Gm:大蠟螟Galleria mellonella (XP_026757917.1); Vt: 夏威夷紅蛺蝶Vanessa tameamea (XP_026494965.1); Of: 亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis (XP_028163466.1); Hk: 海波斯莫科馬屬蛾Hyposmocoma kahamanoa (XP_026329683.1); Pm: 金鳳蝶Papilio machaon (KPJ06248.1); Ba: 偏瞳蔽眼蝶Bicyclus anynana (XP_023946886.1); Dp: 黑脈金斑蝶Danaus plexippus (XP_032513369.1); Bt: 牛Bos taurus (XP_010814079.1); Hs: 智人Homo sapiens (XP_005257746.1). 基因樹節(jié)點上的數(shù)字是可信度參數(shù)后驗概率；系統(tǒng)樹下方的刻度值代表核酸替代率。Number in each node indicates the posterior probability. The scale value below the phylogenetic tree represents the nucleic acid substitution rate.

2.2 Bmggnbp2的人工選擇信號分析

Bmggnbp2所在的基因組區(qū)域種群分歧度參數(shù)(Fst)在此區(qū)域有明顯的上升，形成選擇掃蕩；核苷酸多態(tài)性參數(shù)(π)也顯示，該區(qū)域家蠶呈現(xiàn)多態(tài)性極低，而野桑蠶則保持較高的多態(tài)性(圖3)。結(jié)果表明，Bmggnbp2的基因組區(qū)域有明顯的人工選擇信號。該基因也在我們之前的研究中也被鑒定為候選馴化基因(Xiangetal., 2018)。

圖3 家蠶Bmggnbp2基因區(qū)的人工選擇信號分析Fig. 3 Selection signatures of Bmggnbp2 of Bombyx moriA和B圖分別是該基因區(qū)域的選擇信號參數(shù)——種群分歧度系數(shù)(Fst) (家蠶三眠蠶品系與野蠶種群)和兩個群體的核苷酸多態(tài)性參數(shù)(π)的分布圖?；疑摼€表示最高5% Fst閾值；綠色方塊為該基因的結(jié)構(gòu)示意圖，位于10號染色體。Signature indexes population divergence coefficient (Fst) between the Chinese local trimoulting domestic silkworm strain and Bombyx mandarina (A) and the nucleotide diversity index (π) in the silkworm population (B), are shown along the genomic regions covering the Bmggnbp2 gene. Dashed lines represent the top 5% Fst cutoff. The green square represents the Bmggnbp2 gene region which is located on Chromosome 10.

2.3 Bmggnbp2基因相關(guān)信息以及其在家蠶組織中的表達特征

Bmggnbp2基因ORF全長1 827 bp，編碼608個氨基酸，包含8個外顯子。家蠶芯片組織數(shù)據(jù)顯示該基因在家蠶各個組織位置均有表達，且在家蠶5齡第3天幼蟲的腦、卵巢、精巢和絲腺中有很高的表達量(圖4)。

圖4 基于基因芯片數(shù)據(jù)的Bmggnbp2在家蠶5齡第3天幼蟲中的組織表達格局Fig. 4 Tissue expression pattern of Bmggnbp2 in the day-3 5th instar larvae of Bombyx mori based on gene chip dataOv: 卵巢Ovary; Te: 精巢Testis; Br: 腦部Brain; In: 表皮Integument; Fb: 脂肪體Fat body; Mg: 中腸Midgut; Mt: 馬氏管Malpighian tubules; ASG: 前部絲腺Anterior silk gland; MSG: 中部絲腺Middle silk gland; PSG: 后部絲腺Posterior silk gland.

2.4 基于轉(zhuǎn)基因CRISPR系統(tǒng)的家蠶Bmggnbp2突變體

注射pBac[IE1-DsRed-U6-Bmggnbp2sgRNA1+2]轉(zhuǎn)基因載體于Nistari品系野生型家蠶共880顆卵，成功孵化出775頭，卵孵化率為85%。正常飼養(yǎng)至化蛾時期后。G0代雌雄相互交配，總共得到203個蛾圈后代(G1)。待G1代卵孵化后，對G1代的每個蛾圈進行紅色熒光篩選。總共篩選到25頭帶有紅色熒光的蟻蠶。該品系與Nos-Cas9品系雜交后，得到既有紅色熒光又有綠色熒光的雜交后代(圖5)，即為Bmggnbp2敲除嵌合突變體△Bmggnbp2。與前期的研究(Zengetal., 2016, 2017)相比較，利用該方法得到的嵌合突變體敲除率較高。

2.5 家蠶Bmggnbp2突變體基因型

隨機挑選突變體文庫的9個單克隆進行測序，發(fā)現(xiàn)豐富的敲除突變，9個樣品均有大于2 000 bp的大片段堿基缺失，大片段的基因組敲除導(dǎo)致了Bmggnbp2基因的第4, 5, 6和7號外顯子缺失(數(shù)據(jù)未展示)，結(jié)果再次證實轉(zhuǎn)基因CRISPR系統(tǒng)的有效性。

2.6 家蠶Bmggnbp2突變體的表型

在生殖相關(guān)性狀方面，Bmggnbp2突變體△Bmggnbp2蛹期第4天的精巢在形狀上表現(xiàn)為橢圓形(圖6: A)，而對照Nos-Cas9呈現(xiàn)經(jīng)典的腎形精巢(圖6: B)，并且突變體精巢表面還出現(xiàn)一層較厚的黃色覆蓋物。 就繭絲經(jīng)濟性狀而言，Bmggnbp2突變體△Bmggnbp2(n=75)相對于U6-Bmggnbp2sgRNA(n=77)和Nos-Cas9兩個對照品系(n=50)，在全繭重、蛹重和繭殼重上均沒有顯著差異(P>0.05)(圖7: A)。 與對照Nos-Cas9對比，突變體△Bmggnbp2的單雌產(chǎn)卵量及卵孵化率均沒有顯著差異(P>0.05)(圖7: B, C)。結(jié)果表明，BmGGNBP2對家蠶的產(chǎn)絲性狀沒有明顯的影響，盡管對雄性生殖腺形態(tài)有一定的影響，但并沒有影響到產(chǎn)卵、孵化這些性狀。

圖6 家蠶突變體△Bmggnbp2 (A)與對照Nos-Cas9 (B)蛹期第4 天的精巢對比Fig. 6 Testis comparison of the 4 day-old pupa between the mutant △Bmggnbp2 (A)and the control Nos-Cas9 (B) of Bombyx mori

圖7 家蠶突變體△Bmggnbp2產(chǎn)絲性能(A)以及單雌產(chǎn)卵量(B)和卵孵化率(C)對比Fig. 7 Comparison of silk production performance (A), and number of eggs laid per female (B)and egg hatching rate of mutant △Bmggnbp2 (C) of Bombyx moriA: △Bmggnbp2(n=75)與對照U6-Bmggnbp2sgRNA(n=77)和Nos-Cas9(n=50)的全繭重、繭殼重和蛹重Cocoon weight, cocoon shell weight and pupal weight of the mutant △Bmggnbp2 (n=75) and the controls U6-Bmggnbp2sgRNA (n=77) and Nos-Cas9 (n=50); B: △Bmggnbp2與對照Nos-Cas9的單雌產(chǎn)卵量Number of eggs laid per female of △Bmggnbp 2 and the control Nos-Cas9; C: △Bmggnbp 2與對照Nos-Cas9的卵孵化率Egg hatching rate of △Bmggnbp 2 and the control Nos-Cas9. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；采用t檢驗檢測突變體分別與兩種對照間在0.05水平的差異顯著性。Data in the figure are mean±SD. Significance of differences between the values of the mutants and the two controls at the 0.05 level was tested by t-test.

3 討論

本研究利用雙元轉(zhuǎn)基因體系對家蠶的Bmggnbp2進行了基因敲除，在突變體△Bmggnbp2中，Bmggnbp2有2 000多個堿基的缺失，導(dǎo)致BmGGNBP2蛋白氨基酸的大片段缺失。表型觀察發(fā)現(xiàn)，突變體跟對照品系相比，突變體的精巢形態(tài)發(fā)生變化并且出現(xiàn)一層厚厚的黃色覆蓋物(圖6)，說明基因敲除對家蠶的精巢形態(tài)產(chǎn)生了一定的影響。這些變化以及覆蓋物成分的進一步分析，將可能對于理解該基因的功能提供進一步的線索。我們進一步統(tǒng)計其產(chǎn)卵量和卵孵化率發(fā)現(xiàn)，精巢的形態(tài)改變并沒有影響突變體的產(chǎn)卵量和卵孵化率(圖7)。統(tǒng)計突變體△Bmggnbp2以及對照U6-Bmggnbp2sgRNA和Nos-Cas9的全繭重、蛹重和繭殼重，但沒有發(fā)現(xiàn)有明顯的差異，表明Bmggnbp2的缺失同樣沒有影響到重要的馴化性狀——繭絲性狀。就本研究的結(jié)果而言，ggnbp2這一在哺乳動物中具有重要功能的基因在家蠶的生殖發(fā)育中的作用似乎并不至關(guān)重要。一種可能是，在家蠶中存在某種互補機制，可以替代GGNBP2基因缺失可能引起的精細(xì)胞功能缺陷的補救措施。為了解其機理，后續(xù)使用生物化學(xué)技術(shù)對其結(jié)合因子進行進一步研究有助于回答這一問題。GGNBP2基因起作用的復(fù)雜性，提示我們在進行表型檢測時，可能需要進行更為精細(xì)的條件設(shè)置。正如一項家蠶蛻皮激素氧化酶(ecdysone, EO)的研究中(Sunetal., 2014)，該基因的不同基因型的表型差異僅在饑餓處理時才能檢測到，而在正常喂食條件下，兩種品系之間沒有差異。因此，引發(fā)Bmggnbp2基因敲除并未發(fā)現(xiàn)家蠶突變體的繁殖力發(fā)生變化，也可能是需要一定的外力誘導(dǎo)才有可能產(chǎn)生性狀改變，后續(xù)深入探索該基因的調(diào)控機制將有助于回答這一問題。

轉(zhuǎn)基因CRISPR系統(tǒng)可以使得sgRNA和Cas9蛋白在同一時期表達和傳遞，在轉(zhuǎn)基因幼蟲中，轉(zhuǎn)基因普遍且持續(xù)地表達，但可能較弱，后代容易產(chǎn)生嵌合體；而直接顯微注射Cas9 mRNA和sgRNA在胚胎中較短時間內(nèi)就能實現(xiàn)對目的基因的破壞，但由于存在Cas9蛋白和sgRNA傳遞的差異，可能導(dǎo)致表型不規(guī)則(Zengetal., 2016)。我們運用轉(zhuǎn)基因CRISPR對Bmggnbp2基因進行基因敲除發(fā)現(xiàn)，敲除比例偏低，但敲除片段較大；另外可以穩(wěn)定表達熒光蛋白的突變體品系可能為嵌合體而不是完全敲除的純合體，從而使得基因還能發(fā)揮一部分的功能。

綜上所述，本研究在家蠶中利用雙元轉(zhuǎn)基因體系獲取了Bmggnbp2敲除的家蠶突變體△Bmggnbp2，對其與對照Nos-Cas9品系和U6-Bmggnbp2 sgRNA在精巢形態(tài)、全繭重、蛹重和繭殼重等性狀進行了比較，同時統(tǒng)計了突變體△Bmggnbp2與對照Nos-Cas9的產(chǎn)卵量和卵孵化率。盡管本研究觀察到該基因的敲除對精巢形態(tài)有一定的影響，但對繁殖性狀、繭絲經(jīng)濟性狀均沒有顯著影響。后續(xù)針對該基因的深入功能剖析以及體內(nèi)對于該基因通路可能的補償機制探究，將為理解家蠶精巢發(fā)育機制提供新的啟示。