郭洪剛, 魏春花, 張民照, 覃曉春, 杜艷麗

(北京農(nóng)學(xué)院生物與資源環(huán)境學(xué)院, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 102206)

昆蟲(chóng)氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)是昆蟲(chóng)外周嗅覺(jué)系統(tǒng)氣味識(shí)別過(guò)程中的先鋒分子，其能夠特異性地識(shí)別和篩選特定化學(xué)信號(hào)，進(jìn)而將環(huán)境信號(hào)傳至昆蟲(chóng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引發(fā)昆蟲(chóng)做出行為反應(yīng)(Leal, 2013; 孫小潔等, 2020)。近年來(lái)，基于靶標(biāo)昆蟲(chóng)的嗅覺(jué)通訊行為調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)害蟲(chóng)治理已成為有害生物綠色防控的熱點(diǎn)，其中，昆蟲(chóng)氣味結(jié)合蛋白是該項(xiàng)防治措施的一類(lèi)重要靶標(biāo)(Venthur and Zhou, 2018; 杜迎剛等, 2020; 孫小潔等, 2020)。因此，進(jìn)一步識(shí)別和鑒定靶標(biāo)昆蟲(chóng)的氣味結(jié)合蛋白，了解其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和配體結(jié)合特性，對(duì)開(kāi)發(fā)新的殺蟲(chóng)劑，開(kāi)展害蟲(chóng)生態(tài)防控，實(shí)現(xiàn)害蟲(chóng)綜合治理至關(guān)重要。目前，已鑒定出不同昆蟲(chóng)的氣味結(jié)合蛋白，并且發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)行使嗅覺(jué)功能的大部分OBPs的基因均在觸角中高表達(dá)，如嘴壺夜蛾Oraesiaemarginata的OemaPBP1,桃蛀螟Conogethespunctiferalis的CpunOBP1,CpunOBP2和CpunPBP2等,以及玉米象Sitophituszeamais的SzeaOBP35-36等(Fengetal., 2017; Geetal., 2018; Tangetal., 2019)。進(jìn)一步研究表明，OBPs可以與寄主植物揮發(fā)物結(jié)合，影響昆蟲(chóng)與寄主植物間的信息交流，如：綠盲蝽Apolyguslucorum的AlucOBP22負(fù)責(zé)特異性識(shí)別β-紫羅蘭酮(β-ionone)和β-石竹烯(β-caryophyllene)等萜烯類(lèi)揮發(fā)物，參與綠盲蝽寄主定位和寄主轉(zhuǎn)換(Liuetal., 2019)；煙粉虱Bemisiatabaci的BtabOBP3在其識(shí)別和選擇健康植株而不選擇病毒侵染植株的過(guò)程中具有重要作用(Shietal., 2019)。不僅如此，很多昆蟲(chóng)的OBPs還能識(shí)別昆蟲(chóng)性信息素[如地中海石蠅Ceratitiscapitata的CcapOBP22、蘋(píng)果蠹蛾Cydiapomonella的CpomPBP2、大蠟螟Galleriamellonella的GOBP2等]、報(bào)警信息素[如豌豆蚜Acyrthosiphonpisum的ApisOBP3和禾谷縊管蚜Rhopalosiphumpadi的RpadOBP3和RpadOBP7]等，從而影響昆蟲(chóng)間的互作過(guò)程(交配、產(chǎn)卵和逃避等行為)(Sunetal., 2011; Fanetal., 2017; Falchettoetal., 2019; Lizanaetal., 2020; Tianetal., 2020)。而且，隨著對(duì)OBPs研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)OBPs還具有除嗅覺(jué)感知以外的其他生理功能。如AccOBP10基因參與中華蜜蜂Apisceranacerana響應(yīng)非生物脅迫過(guò)程(Guoetal., 2021)；棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera的HarmOBP3和HarmOBP6基因參與調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)的飛行能力(Wangetal., 2020)；小菜蛾P(guān)lutellaxylostella的PxylOBP13基因與該蟲(chóng)對(duì)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑的抗性有關(guān)(Bautistaetal., 2015)。這些研究表明，OBPs不僅在昆蟲(chóng)化學(xué)通訊過(guò)程中(昆蟲(chóng)與寄主植物、昆蟲(chóng)與昆蟲(chóng))發(fā)揮著重要的嗅覺(jué)作用，而且還行使除嗅覺(jué)以外的其他生理功能(杜亞麗等, 2020)。

桃蛀螟是一類(lèi)以幼蟲(chóng)鉆蛀危害板栗、桃、玉米、向日葵等多種果樹(shù)和經(jīng)濟(jì)作物的多食性害蟲(chóng)。近年來(lái)，伴隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，桃蛀螟為害亦日趨嚴(yán)重。如在黃淮海夏玉米和西南山地夏玉米產(chǎn)區(qū)，桃蛀螟在玉米果穗上的種群數(shù)量迅速增加，使其為害程度超過(guò)亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis，成為當(dāng)?shù)叵挠衩姿肫诘闹饕οx(chóng)(王振營(yíng)和王曉鳴, 2015)。然而，由于桃蛀螟幼蟲(chóng)鉆蛀為害的特性，幼蟲(chóng)期防治困難重重；目前有關(guān)成蟲(chóng)的防治措施也僅限于性誘劑，而性誘劑只對(duì)雄蛾有效，如果雄蛾在誘殺前已完成交配，對(duì)壓低下一代蟲(chóng)口基數(shù)起不到任何作用。最近研究人員發(fā)現(xiàn)，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引誘劑或驅(qū)避劑來(lái)防治桃蛀螟或通過(guò)基因編輯等方式定向調(diào)控桃蛀螟等鉆蛀類(lèi)害蟲(chóng)的嗅覺(jué)行為符合環(huán)境友好和可持續(xù)發(fā)展理念的防治策略(杜艷麗等, 2014; 賈小儉等, 2015; Xiaoetal., 2016; 朱秀云等, 2017; 翟浩等, 2019)。但目前有關(guān)桃蛀螟氣味結(jié)合蛋白的研究還較少，尚不能滿(mǎn)足實(shí)際開(kāi)發(fā)的巨大需求。基于此，本研究根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(Jiaetal., 2016)，篩選鑒定兩個(gè)桃蛀螟氣味結(jié)合蛋白基因(CpunOBP3和CpunOBP4)，采用原核表達(dá)及蛋白純化得到CpunOBP3和CpunOBP4重組蛋白，通過(guò)熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)定重組蛋白CpunOBP3和CpunOBP4與24種配體的結(jié)合能力，為探討桃蛀螟感受氣味化合物的分子響應(yīng)機(jī)制提供一定的科學(xué)依據(jù)，為開(kāi)發(fā)基于桃蛀螟氣味結(jié)合蛋白的綠色防控措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源

將2009年10月9日在北京農(nóng)學(xué)院東大地玉米試驗(yàn)田采集桃蛀螟老熟幼蟲(chóng)，于實(shí)驗(yàn)室用新鮮甜玉米長(zhǎng)期繼代飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：溫度23±1℃，相對(duì)濕度70%±5%，光周期16L∶8D。本實(shí)驗(yàn)所用桃蛀螟成蟲(chóng)已在室內(nèi)累計(jì)飼養(yǎng)80代，默認(rèn)成蟲(chóng)羽化72 h后雌雄蛾完成交配。

1.2 觸角總RNA的提取與cDNA第1鏈合成

分別取80對(duì)羽化后72 h的桃蛀螟雌、雄蛾觸角置于1.5 mL離心管中，用RNeasy Plus Mini Kit試劑盒提取總RNA，于-80℃保存?zhèn)溆?。?jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)觸角總RNA的完整性、核酸濃度測(cè)定儀(K5500)檢測(cè)RNA樣品的濃度及OD260/OD280值后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega Co., 美國(guó))合成cDNA第1鏈，在-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 目的基因片段擴(kuò)增

基于前期桃蛀螟觸角轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，根據(jù)桃蛀螟CpunOBP3和CpunOBP4基因開(kāi)放閱讀框去信號(hào)肽序列后的序列，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，依照pET-30a(+)質(zhì)粒圖譜在引物5′端添加內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)(表1)。以1.2節(jié)合成的cDNA為模板，分別利用特異性引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(50.0 μL): ddH2O 21.3 μL, cDNA 模板1.7 μL, 2×ES Taq MasterMix 25.0 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1.0 μL。反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入40個(gè)循環(huán)(CpunOBP3: 94℃變性40 s, 57℃退火40 s, 72℃延伸10 min;CpunOBP4: 94℃變性40 s, 53℃退火40 s, 72℃延伸10 min)，之后72℃再延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，按TIANgel Midi Purification Kit試劑盒步驟純化回收PCR產(chǎn)物。

1.4 生物信息學(xué)分析

桃蛀螟CpunOBP3和CpunOBP4序列通過(guò)DNAMAN 4.0軟件進(jìn)行分析，并利用在線軟件(http:∥www.Expasy.org/compute_pi/)對(duì)CpunOBP3和CpunOBP4蛋白的等電點(diǎn)和分子量等基本物理性狀進(jìn)行預(yù)測(cè)；使用IPSORT(http:∥www.ipsort.hgc.jp/)對(duì)CpunOBP3和CpunOBP4蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行分析；利用MEGA5.0軟件和鄰接法(neighbor-joining, NJ)對(duì)序列進(jìn)行1 000次重復(fù)構(gòu)建，完成系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

1.5 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將1.3節(jié)膠回收產(chǎn)物與pMD-19T載體16℃過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在LB平板(含100 μg/mL Amp)上，于37℃培養(yǎng)16 h構(gòu)建T載體。T載體依次通過(guò)菌液PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定后，將測(cè)序結(jié)果與已知基因序列相同的菌液在LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL Amp)中擴(kuò)大培養(yǎng)，同時(shí)將實(shí)驗(yàn)室保存的pET-30a(+)菌種在LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL Kna)中擴(kuò)大培養(yǎng)，待菌液渾濁后，提取重組質(zhì)粒pMD-19T/OBPs和pET-30a(+)，使用指定的限制性?xún)?nèi)切酶(表1)于37℃進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，再根據(jù)片段大小回收OBPs目的片段和表達(dá)載體，并檢測(cè)回收產(chǎn)物的濃度和純度。回收的OBPs目的片段和用同樣內(nèi)切酶切開(kāi)的質(zhì)粒pET-30a(+)于16℃過(guò)夜連接構(gòu)建表達(dá)載體。表達(dá)載體先后經(jīng)菌液PCR鑒定、雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定后，將測(cè)序正確的菌液加高溫滅菌的甘油制成菌種保存液，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.6 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將1.5節(jié)鑒定成功的重組質(zhì)粒pET-30a/CpunOBP3和pET-30a/CpunOBP4活化后，參照賈小儉等(2015)的研究方法進(jìn)一步誘導(dǎo)表達(dá)。取1 mL菌液作為未誘導(dǎo)樣品，加入1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h。期間，每隔2 h取1 mL菌液，12 000 r/min離心1 min后除盡上清，加100 μL ddH2O混勻。處理后的菌液，以未誘導(dǎo)菌液為陰性對(duì)照，用15% SDS-PAGE電泳檢測(cè)不同時(shí)間段的誘導(dǎo)表達(dá)效果。參照賈小儉等(2015)的研究方法，將誘導(dǎo)好的CpunOBP3和CpunOBP4大腸桿菌菌液進(jìn)一步純化。由于CpunOBP3和CpunOBP4均為包涵體蛋白，所以利用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行蛋白純化；蛋白純化過(guò)程中收集洗脫峰，經(jīng)電泳檢測(cè)后在4℃下20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)中透析24～48 h，除去鹽離子；隨后采用重組腸激酶(欣百諾生物，上海)對(duì)純化好的蛋白于37℃酶切16 h以去除 His-tag，將切除His標(biāo)簽的重組蛋白利用截留分子量規(guī)格為10 kD的超濾濃縮管將重組蛋白濃縮至1 mg/mL，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)

參照賈小儉等(2015)的研究方法，利用多功能酶標(biāo)儀，通過(guò)熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究重組蛋白CpunOBP3和CpunOBP4與2種桃蛀螟性信息素和22種植物揮發(fā)物的結(jié)合能力。首先，分別檢測(cè)CpunOBP3和CpunOBP4蛋白溶液與熒光探針1-NPN(Sigma Co.，德國(guó))的解離常數(shù)Ki，然后測(cè)定蛋白與配體的結(jié)合能力，結(jié)合能力差異依據(jù)解離常數(shù)Ki值來(lái)比較。計(jì)算公式為Ki=[IC50]/(1+[1-NPN]/K1-NPN)(Banetal., 2003; 宋月芹等, 2014)，其中[1-NPN]為未結(jié)合的1-NPN濃度，K1-NPN為CpunOBP3/1-NPN或CpunOBP4/1-NPN蛋白的解離常數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 桃蛀螟CpunOBP3和CpunOBP4基因的序列特征

對(duì)CpunOBP3和CpunOBP4基因氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，CpunOBP3(GenBank登錄號(hào): GEDO010000010.1)開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)387 bp，編碼128個(gè)氨基酸，分子量為14.72 kD，等電點(diǎn)7.52, 不含信號(hào)肽；CpunOBP4(GenBank登錄號(hào): GEDO010000011.1)開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)438 bp，編碼145個(gè)氨基酸，在N端前30個(gè)氨基酸組成信號(hào)肽，去除信號(hào)肽后的序列長(zhǎng)度為348 bp，分子量為12.82 kD，等電點(diǎn)6.58(圖1)。另外，CpunOBP3和CpunOBP4均具有6個(gè)保守的半胱氨酸殘基，與典型的氣味結(jié)合蛋白家族特征X18-Cys1-X30-Cys2-X3-Cys3-X42-Cys4-X8-14-Cys5-X8-Cys6-X24-26(X代表任意氨基酸)一致，說(shuō)明CpunOBP3與CpunOBP4在結(jié)構(gòu)上屬于OBPs家族。

圖1 桃蛀螟CpunOBP3和CpunOBP4基因(去除信號(hào)肽序列) cDNA全長(zhǎng)克隆Fig. 1 Cloning of the full-length cDNA sequences ofCpunOBP3 and CpunOBP4 genes (without signalpeptide sequence) of Conogethes punctiferalisM: DL2000 DNA marker.

2.2 桃蛀螟CpunOBP3和CpunOBP4的序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育

將桃蛀螟CpunOBP3和CpunOBP4的氨基酸序列與夜蛾科的棉鈴蟲(chóng)以及草螟科6種昆蟲(chóng)的50個(gè)氣味結(jié)合蛋白通過(guò)DNAMAN 7.0進(jìn)行多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)桃蛀螟CpunOBP3和CpunOBP4氨基酸序列中均有6個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)。通過(guò)對(duì)氨基酸的同源性和多態(tài)性進(jìn)行分析，可以看出CpunOBP3與亞洲玉米螟的OfurOBP8和稻縱卷葉螟Cnaphalocrocismedinalis的CmedOBP1聚為一支，支持率為100%；CpunOBP4與亞洲玉米螟的OfurOBP16聚為一支，支持率為67%；表明它們之間的親緣關(guān)系較近(圖2)。

圖2 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的桃蛀螟與其他昆蟲(chóng)OBPs的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(1 000次重復(fù))Fig. 2 Phylogenetic tree of OBPs from Conogethes punctiferalis and other insects by neighbor-joining methodbased on amino acid sequences (1 000 replicates)蛋白來(lái)源物種及其GenBank登錄號(hào)Origin species of proteins and their GenBank accession numbers: 二化螟Chilo suppressalis (CsupGOBP1: ACJ07129.1; CsupOBP: AGM38605.1; CsupGOBP2: ACJ07120.1; CsupOBP5: AGK24581.1; CsupOBP4: AGK24580.1; CsupOBP3: AGK24579.1; CsupOBP2: AGK24578.1; CsupPBP1: ADK66921.1; CsupPBP2: ACJ07123.1; CsupPBP3: ADL09140.1); 桃蛀螟Conogethes punctiferalis (CpunOBP3; CpunOBP4); 棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera (HarmOBP2: AEB54586.1; HarmOBP17: AFI57166.1; HarmGOBP1: AAL09821.1; HarmOBP31: ASA40067.1; HarmGOBP2: CAC08211.1; HarmOBP: AEX07279.1); 稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis (CmedGOBP2: AFG72997.1; CmedOBP1: AFG72998.1; CmedGOBP1: AFG72996.1; CmedPBP2: AGI37364.1; CmedPBP1: AFG72999.1; CmedOBP13: ALT31643.1; CmedOBP26: APY22693.1; CmedOBP2: AFG73000.1; CmedGOBP3: AGI37362.1); 臍橙螟Amyelois transitella (AtraPBP1: ACX47890.1; AtraGOBP2: ACX47894.1; AtraGOBP1: ACX47893.1); 歐洲玉米螟Ostrinia nubilalis (OnubPBP5: ADT78499.1; OnubPBP3: ADT78492.1; OnubPBP2: ADT78496.1; OnubPBP1: ADT78491.1; OnubPBP4: ADT78493.1; OnubGOBP2: BBB15978.1; OnubGOBP1: BBB15959.1); 亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis (OfurPBP4: ADT78503.1; OfurPBP5: ADT78504.1; OfurPBP3: ADT78502.1; OfurPBP2: ADT78501.1; OfurPBP1: ADT78500.1; OfurOBP14: BAV56801.1; OfurOBP15: BAV56802.1; OfurOBP16: BAV56803.1; OfurOBP17: BAV56804.1; OfurOBP12: BAV56799.1; OfurOBP11: BAV56798.1; OfurOBP9: BAV56796.1; OfurOBP4: BAV56791.1; OfurOBP5: BAV56792.1; OfurOBP6: BAV56793.1; OfurOBP7: BAV56794.1; OfurOBP8: BAV56795.1; OfurOBP3: BAV56790.1; OfurOBP2: BAV56789.1; OfurOBP1: BAV56788.1); 瓜絹野螟Diaphania indica (DindPBP: BAG71419.1).

2.3 桃蛀螟CpunOBP3和CpunOBP4的原核表達(dá)與純化

對(duì)構(gòu)建的原核表達(dá)載體 pET-30a/CpunOBP3和pET-30a/CpunOBP4進(jìn)行雙酶切和菌液PCR鑒定，結(jié)果顯示酶切產(chǎn)物大小以及PCR產(chǎn)物條帶大小均與預(yù)期的CpunOBP3和CpunOBP4目的片段大小相近，說(shuō)明表達(dá)載體構(gòu)建成功。隨后分別對(duì)pET-30a/CpunOBP3和pET-30a/CpunOBP4菌液進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并利用15% SDS-PAGE電泳檢測(cè)不同時(shí)間段CpunOBP3和CpunOBP4蛋白誘導(dǎo)表達(dá)效果，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)所產(chǎn)生的CpunOBP3和CpunOBP4條帶隨誘導(dǎo)時(shí)間推移逐漸變寬，在6 h時(shí)表達(dá)量最多。并且SDS-PAGE電泳顯示CpunOBP3和CpunOBP4重組蛋白主要以包涵體蛋白形式表達(dá)。所以經(jīng)過(guò)蛋白純化過(guò)程中的尿素變性、純化及透析復(fù)性后用重組腸激酶去除His-tag標(biāo)簽，對(duì)去除標(biāo)簽后的目的蛋白再次純化得到目的蛋白。經(jīng)15% SDS-PAGE電泳檢測(cè)，切除His-tag標(biāo)簽后的CpunOBP3及CpunOBP4(去除信號(hào)肽)目的蛋白條帶分別約為14.72和12.82 kD(圖3)。

圖3 重組表達(dá)蛋白CpunOBP3和CpunOBP4的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the recombinant expression proteins CpunOBP3 and CpunOBP4M: 蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量Protein molecular weight marker; A: IPTG誘導(dǎo)不同時(shí)間下CpunOBP3表達(dá)量CpunOBP3 expression levels at different time after IPTG induction; B: IPTG誘導(dǎo)不同時(shí)間下CpunOBP4表達(dá)量CpunOBP4 expression levels at different time after IPTG induction; C: 不同分流液中CpunOBP3的表達(dá)CpunOBP3 expression in different separating media; D: 不同分流液中CpunOBP4的表達(dá)CpunOBP4 expression in different separating media. 0: 未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-30a/CpunOBP3表達(dá)產(chǎn)物 Expression product of pET-30a/CpunOBP3 non-induced by IPTG; 1-6: 分別經(jīng)IPTG誘導(dǎo)1, 2, 3, 4, 5和6 h的pET-30a/CpunOBPs表達(dá)產(chǎn)物 Expression products of pET-30a/CpunOBPs induced by IPTG for 1, 2, 3, 4, 5, and 6 h, respectively. a: pET-30a/CpunOBP3菌液經(jīng)超聲破碎后的上清Supernatant of bacteria liquid of pET-30a/CpunOBP3 after sonication; b: 經(jīng)超聲破碎后的pET-30a/CpunOBP3全菌液Total bacteria liquid of pET-30a/CpunOBP3 after sonication; c: 上柱后的pET-30a/CpunOBP3蛋白流穿液Protein fluid of pET-30a/CpunOBP3 after flowing through the column; d: 純化后的CpunOBP3蛋白 Purified CpunOBP3 protein; e: 重組腸激酶切除His-tag標(biāo)簽后的CpunOBP3蛋白Purified CpunOBP3 with His-tag removed by recombinant enterokinase; h, i: 經(jīng)超聲破碎后的pET-30a/CpunOBP4菌液沉淀Pellet of bacteria liquid of pET-30a/CpunOBP4 after sonication; j: pET-30a/CpunOBP4上柱后的蛋白流穿液Protein fluid of pET-30a/CpunOBP4 after flowing through the column; k: 純化后的CpunOBP4蛋白 Purified CpunOBP4 protein; l: 重組腸激酶切除His-tag標(biāo)簽后的CpunOBP4蛋白Purified CpunOBP4 with His-tag removed by recombinant enterokinase. 箭頭指示目的條帶。Arrows indicate the target bands.

2.4 重組蛋白CpunOBP3和CpunOBP4與配體的結(jié)合特性

根據(jù)Scatchard方程繪制回歸直線，計(jì)算得到CpunOBP3和CpunOBP4與1-NPN的解離常數(shù)Ki值分別為1.87 μmo1/L和2.23 μmo1/L(圖4: A, B)。通過(guò)熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)定了重組蛋白CpunOBP3和CpunOBP4分別與2種桃蛀螟性信息素以及22種植物揮發(fā)物的結(jié)合能力。結(jié)果表明，CpunOBP3可以與測(cè)定的7種植物揮發(fā)物相結(jié)合，但不能與測(cè)試的2種桃蛀螟性信息素相結(jié)合；其中，與3-蒈烯的結(jié)合能力最強(qiáng)，解離常數(shù)Ki值為10.33 μmol/L；與其他6種植物揮發(fā)物的結(jié)合能力依次為莰烯(Ki=11.45 μmol/L)、α-水芹烯(Ki=12.65 μmol/L)、2-甲基丁醇(Ki=13.74 μmol/L)、2-甲基丁酸乙酯(Ki=18.21 μmol/L)、反-4-葵烯酸乙酯(Ki=19.84 μmol/L)以及α-法尼烯(Ki=23.34 μmol/L)(圖5: A, B; 表2)。CpunOBP4不僅能與桃蛀螟2種性信息素十六醛(Ki=7.83 μmol/L)和順-10-十六碳烯醛(Ki=14.65 μmol/L)結(jié)合，還能與8種植物揮發(fā)物結(jié)合，結(jié)合能力從大到小依次為丁酸乙酯、2-甲基丁醇、苯乙烯、檜烯、反-4-葵烯酸乙酯、3-蒈烯、γ-松油烯和α-法尼烯，Ki值分別為4.32, 8.65, 12.31, 14.53, 15.75, 16.04, 18.94和19.73 μmol/L(圖5: C, D; 表2)。

圖4 重組蛋白CpunOBP3(A)和CpunOBP4(B)與1-NPN的結(jié)合曲線Fig. 4 Binding curves of the recombinant CpunOBP3 (A) and CpunOBP4 (B) with 1-NPN

3 討論

本研究基于桃蛀螟成蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，利用PCR技術(shù)成功克隆了桃蛀螟兩個(gè)氣味結(jié)合蛋白基因CpunOBP3和CpunOBP4，并利用熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)定了表達(dá)純化的重組蛋白CpunOBP3和CpunOBP4與24種配體(包括2種桃蛀螟性信息素和22種植物揮發(fā)物)的結(jié)合特性。結(jié)果表明，CpunOBP3和CpunOBP4都具有6個(gè)保守的半胱氨酸殘基，是典型的OBPs結(jié)構(gòu)(C1-X25-30-C2-X3-C3-X36-42-C4-X8-14-C5-X8-C6)，符合Xu等(2009)鑒別鱗翅目昆蟲(chóng)OBPs的經(jīng)典模式。經(jīng)信號(hào)肽預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)CpunOBP4 N端有信號(hào)肽，而CpunOBP3 N端無(wú)信號(hào)肽，這種N端無(wú)信號(hào)肽的現(xiàn)象在其他昆蟲(chóng)中也有發(fā)現(xiàn)，如小菜蛾的PxylOBP13基因、棉鈴蟲(chóng)的HarmGOBP1基因以及梨小食心蟲(chóng)Grapholitamolesta的GmolOBP3基因氨基酸序列的N端均不存在信號(hào)肽序列(Zhangetal., 2011; 宋月芹等, 2014; 覃江梅等, 2016)。

氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系表明，CpunOBP3和CpunOBP4與亞洲玉米螟的氣味結(jié)合蛋白同源性較高，位于同一分支上(圖2)。從分類(lèi)地位來(lái)看，桃蛀螟與亞洲玉米螟均隸屬于草螟科；就危害特性而言，兩者均以幼蟲(chóng)鉆蛀危害玉米雌穗(Lietal., 2015; Lietal., 2020)。本研究結(jié)果從一定程度上暗示兩種昆蟲(chóng)的氣味結(jié)合蛋白在識(shí)別寄主植物過(guò)程中起著相似的化學(xué)感受作用。

為進(jìn)一步了解這兩個(gè)氣味結(jié)合蛋白的生理功能，我們測(cè)定了其重組蛋白與多種揮發(fā)性氣味物質(zhì)的結(jié)合能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)桃蛀螟CpunOBP3和CpunOBP4與配體的結(jié)合特性存在明顯差異(圖5； 表2)。這種差異首先表現(xiàn)在兩者與不同氣味的選擇性結(jié)合上，如：CpunOBP3只能與莰烯等7種植物揮發(fā)物相結(jié)合，而CpunOBP4既能與桃蛀螟性信息素(十六醛和順-10-十六碳烯醛)結(jié)合，也能與植物揮發(fā)物(檜烯、丁酸乙酯等8種化合物)相結(jié)合。結(jié)果也說(shuō)明，普通氣味結(jié)合蛋白主要與寄主植物揮發(fā)物結(jié)合(Venthur and Zhou, 2018)，但也可以與性信息素結(jié)合，如梨小食心蟲(chóng)等昆蟲(chóng)的OBPs能顯著結(jié)合其性信息素(Chenetal., 2018; Jingetal., 2019)。我們前期研究也表明，CpunOBP3在雌、雄蛾觸角中的表達(dá)量差異不大，而CpunOBP4則主要在雄蛾觸角中表達(dá)(Jiaetal., 2016)，這也進(jìn)一步解釋和說(shuō)明了CpunOBP4可能在桃蛀螟雄蛾尋找配偶的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。其次，CpunOBP3和CpunOBP4與配體結(jié)合特性的差異還表現(xiàn)在兩者對(duì)相同氣味物質(zhì)的結(jié)合能力有所不同，如：CpunOBP3和CpunOBP4均能與3-蒈烯結(jié)合，但解離常數(shù)卻相差很大，分別為10.33 μmol/L與16.04 μmol/L。因此，本研究結(jié)果也說(shuō)明，一種氣味物質(zhì)并不僅僅由一種氣味結(jié)合蛋白負(fù)責(zé)識(shí)別，同時(shí)一種氣味結(jié)合蛋白也不是只負(fù)責(zé)一種氣味化合物的識(shí)別與運(yùn)輸，這與之前有關(guān)小菜蛾和二化螟Chilosuppressalis等昆蟲(chóng)OBPs與氣味分子結(jié)合功能的研究結(jié)果(Zhuetal., 2016; Khuhroetal., 2017)一致。這些研究表明，昆蟲(chóng)不同的OBPs可以協(xié)同互作，通過(guò)與寄主植物、昆蟲(chóng)性信息素等揮發(fā)物特異性識(shí)別，來(lái)共同調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)取食、寄主選擇以及交配產(chǎn)卵等行為(Britoetal., 2016)。綜上，我們推測(cè)CpunOBP3僅在桃蛀螟定位寄主植物的過(guò)程中發(fā)揮作用，而CpunOBP4在尋找配偶和定位寄主植物的過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。本研究的結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)展以桃蛀螟氣味結(jié)合蛋白為靶標(biāo)的綠色防控措施的靶點(diǎn)選擇提供了科學(xué)參考。