譚敏 汪露 甘平 陳朝喜 李云

摘要：為了解牦牛源大腸桿菌agn43基因攜帶情況及其與生物被膜形成能力的相關(guān)性，分別采用PCR擴(kuò)增和改良結(jié)晶紫半定量方法分別對(duì)分離鑒定的203株牦牛源大腸桿菌進(jìn)行agn43基因檢測(cè)和生物被膜形成能力分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分離的203株大腸桿菌中，147株agn43基因檢測(cè)為陽(yáng)性，檢出率為72.4%；87.19%（177/203）的菌株具有生物被膜形成能力；agn43基因攜帶率與生物被膜表型之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性（R2=0.98897）。

關(guān)鍵詞：牦牛；大腸桿菌；agn43基因；生物被膜表型

Correlation analysis of agn43 and biofilm-forming phenotype in Yak-derived Escherichia coli

TANMin1， WANG Lu1，GANPing2，CHENChao-xi1， LIYun3*

（1.College ofAnimalHusbandryandVeterinarymedicine，SouthwestMinzuUniversity，Chengdu，Sichuan， China.；2.Instituteof AnimalHusbandry， GanziTibetanAutonomousPrefectureofSichuanprovince， China.3. HaidResearchInstitute， GuangdongHaidGroupCo.，Ltd，Guangzhou， Guangdong，China；4.ZhongshanYunshengAgricultural TechnologyCo.，Ltd.Zhongshan，Guangdong， China.）

Abstract： Tounderstandthecorrelationofagn43andbiofilm-formingabilityinYak-derivedEscherichia coli，PCRmethodandmodifiedcrystal violetstainingsemi-quantitativemethodwereperformedforagn43detectionandbiofilm-formingabilityanalysis， respectively.Theresultsshowed that147E.coliwereagn43positiveandthedetectionratewas72.4%； 87.19%（177/203）strainsrevealedbiofilm-formingability；Thereexisted correlationof agn43andbiofilm-formingphenotype（R2=0.9889）.

Key words： Yak；Escherichiacoli；Agn43gene；Biofilm-formingphenotype

大腸桿菌是一種常見的人和動(dòng)物腸道寄生菌，可以引起人和動(dòng)物多種不同程度的感染。牦牛大腸桿菌病是嚴(yán)重威脅高原畜牧業(yè)的一種重要疾病，一般呈散發(fā)或地方流行性，每年3～10月份發(fā)生，4～6月份是發(fā)病高峰期，泌乳期的母牦牛最易感染，其次為1～4月齡犢牛，公牦牛不易感。此外，大腸桿菌致病性的產(chǎn)生受毒力因子的調(diào)控，毒力因子相互協(xié)助完成大腸桿菌的粘附、定居、繁殖和致病的過(guò)程。

大腸桿菌同源轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Agn43是一種豐富的抗原外膜蛋白，Agn43是由agn43基因編碼的，主要參與大腸桿菌的聚集、生物被膜的形成和上皮細(xì)胞的微集落的形成。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Agn43在早期生物膜中高表達(dá)，在成熟生物膜中缺乏Agn43，因此認(rèn)為Agn43在生物膜形成過(guò)程中發(fā)揮早期作用[1]。生物膜是抵抗外界不良環(huán)境的影響而產(chǎn)生的一種生存方式，并作為抵抗機(jī)體防御和限制抗菌藥物進(jìn)入細(xì)菌的一道天然屏障[2]。一旦形成成熟的生物膜，大腸桿菌就能逃避宿主的免疫系統(tǒng)和阻礙藥物的滲透，保護(hù)了細(xì)菌及其耐藥基因的同時(shí)導(dǎo)致耐藥性的傳播，并且出現(xiàn)了許多多重耐藥菌株，使得大腸桿菌的耐藥性問(wèn)題變得更加嚴(yán)重，給畜禽疾病的預(yù)防和控制帶來(lái)更多的挑戰(zhàn)。

基于此，本研究對(duì)分離的牦牛源大腸桿菌進(jìn)行毒力基因agn43檢測(cè)，同時(shí)對(duì)分離菌株進(jìn)行生物被膜表型分析，分析agn43基因攜帶與生物被膜形成能力之間的相關(guān)性，以期為后續(xù)深入探討牦牛源大腸桿菌生物膜的形成與毒力基因和多重耐藥性之間的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要儀器設(shè)備和實(shí)驗(yàn)材料

LDZF-50KB型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；TC-96/G/H（b）C基因擴(kuò)增儀（杭州博日科技有限公司）；JY300C 電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；凝膠圖像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；各種規(guī)格移液器（10μL、20μL、100μL、1000μL）；TGL-16 離心機(jī)（四川蜀科儀器有限公司）。LB 肉湯、伊紅美藍(lán)瓊脂和麥康凱瓊脂購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；2 X Premix TaqTM、DL2000 DNA Marker 和瓊脂糖等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)所需試劑購(gòu)自 TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及大腸桿菌分離鑒定 250 份健康牦牛糞便樣本采自四川省廣漢市某牦牛屠宰場(chǎng)：一次性醫(yī)用棉簽蘸取糞便后置于 37℃恒溫培養(yǎng)箱增菌培養(yǎng) 8～12h，接種環(huán)挑取增菌液后在麥康凱瓊脂平板和伊紅美藍(lán)瓊脂平板上交替?zhèn)鞔鷦澗€純化，待培養(yǎng)基上長(zhǎng)出疑似大腸桿菌后挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢。

1.2.2 agn43 基因 PCR 擴(kuò)增 采用水煮法進(jìn)行大腸桿菌 DNA提取：將過(guò)夜培養(yǎng)的 203 株大腸桿菌菌液分別移至 1.5mL 離心管中 10，000r/min 離心 4min，棄去上清液后加入 200μL 蒸餾水混懸均勻后煮沸 10min，冰浴 5min 后 10，000r/min 離心 4min，將上清移至干凈的離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參考Clermont 等[ 3 ]方法設(shè)計(jì)合成agn43 基因擴(kuò)增引物，引物序列如下：agn43-F：5′-GACTATGACCGGATTSTGGCAGGCT-3′；agn43-R：5′-GTGGCTCCAGCATCARTTGTCAG -3′，目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度大約 499bp。

以分離菌株的 DNA 為模板，采用常規(guī) PCR 方法擴(kuò)增 agn43基因。10μL PCR 反應(yīng)體系為：2 X Premix Taq 酶 5μL，上、下游引物各 0.5μL，DNA 模板 1μL，去離子水 3μL，輕輕混勻。PCR 反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 5min；94℃變性 30s，退火溫度為 66.6℃，退火30s，72℃延伸 40s，共 35 個(gè)循環(huán)；最后 72℃延伸 5min。反應(yīng)結(jié)束后，取 4μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳判斷是否與預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致。

1.2.3 生物被膜表型分析 參照 Peeters 等[4]和 Stepanovic 等[ 5 ]的方法進(jìn)行，具體操作如下：無(wú)菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的各孔加入200μL 經(jīng) 1：100 稀釋的菌液，陰性對(duì)照僅加 TSB 肉湯，37℃培養(yǎng)24h 后棄去培養(yǎng)液，滅菌 PBS 溶液漂洗 3 次，200μL 無(wú)水甲醇固定15min 后棄去，室溫下自然風(fēng)干后 2%結(jié)晶紫染色 5min，沖洗多余的染料，過(guò)夜自然風(fēng)干加入160μL 33%冰乙酸，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的OD570 值。根據(jù)測(cè)試孔與陰性對(duì)照孔 OD570 比值的不同將生物被膜表型分為無(wú)成膜能力（-），弱成膜能力（+），中等成膜能力（++）和強(qiáng)成膜能力（+++）四個(gè)表型。每株菌接種 4 孔，重復(fù) 3 次。

1.2.4 agn43 基因與生物被膜表型相關(guān)性分析 利用 Origin8. 5軟件分析 agn43 基因攜帶率與生物被膜表型之間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌分離鑒定結(jié)果

從 250 份牦牛糞便樣本中共分離鑒定 203 株疑似大腸桿菌，麥康凱培養(yǎng)基上為表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊、微凸起的紅色菌落，在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上呈現(xiàn)金屬光澤；革蘭氏染色鏡檢為陰性短桿菌，兩頭略微鈍圓，成對(duì)或散在分布。與大腸桿菌的菌落特征和革蘭氏染色鏡檢結(jié)果一致，初步確定為大腸桿菌，其分離率為81.2%（203/250）。

2.2 agn43基因 PCR檢測(cè)結(jié)果

203 株牦牛源大腸桿菌中 147 株菌株檢出 agn43 基因，檢出率為 72.4%（147/203）。部分菌株 agn43 基因 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴(kuò)增片段大小約為 499bp，與預(yù)期大小基本一致（圖 1）。

2.3 生物被膜形成能力分型

203 株牦牛源大腸桿菌中，87.19%（177/203）菌株表現(xiàn)出生物被膜形成能力。強(qiáng)、中、弱、無(wú)四種生物被膜表型的菌株數(shù)量分別為6、47、124、26 株，分別占菌株總數(shù)的 2.96%、23.15%、61.08%、12.81%。不同生物被膜表型大腸桿菌中，agn43 基因陽(yáng)性菌株數(shù)量分別為2、31、103、11株，分別占agn43基因陽(yáng)性菌株總數(shù)的1.36%、21.09%、70.07%、7.48%。

2.4 agn43基因與生物被膜表型相關(guān)性分析

對(duì)不同生物被膜表型菌株所占例與agn43基因攜帶率進(jìn)行線性回歸，agn43基因攜帶率與生物被膜表型之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性（R2=0.98897）。

3討論

生物被膜是指細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程為了適應(yīng)生存環(huán)境而粘附于物體或活性組織表面，并包被細(xì)胞外多糖基質(zhì)中形成的一種與浮游細(xì)菌生長(zhǎng)方式完全不同的細(xì)菌微生物群落，是細(xì)菌的一種特殊存在形式。

大腸桿菌產(chǎn)生致病性在于在體內(nèi)繁殖和產(chǎn)生大量毒素，是粘附素定植和毒素致病機(jī)理的主要組成部分[6]。agn43基因是大腸桿菌的一種毒力基因，其編碼一種主要的可變相外膜蛋白抗原Agn43，在大腸桿菌自身聚集和菌落形態(tài)中發(fā)揮重要作用，與大腸桿菌粘附和生物膜形成有關(guān)[7，8]。

本研究從四川某屠宰場(chǎng)牦牛糞便中分離鑒定的203株大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)147株攜帶agn43基因，檢出率為72.4%。而實(shí)驗(yàn)菌株均來(lái)源于屠宰場(chǎng)的健康牛，因此后續(xù)研究應(yīng)檢測(cè)agn43基因表達(dá)水平與致病性之間的相關(guān)程度。相關(guān)研究對(duì)大腸桿菌毒力基因、耐藥性和生物被膜均進(jìn)行檢測(cè)[9-11]，但未對(duì)其相關(guān)性進(jìn)行分析。基于此，本研究對(duì)牦牛大腸桿菌的agn43基因進(jìn)行檢測(cè)，一方面了解其在牦牛中的檢出率，另一方面為后續(xù)研究生物被膜的形成和細(xì)菌耐藥性奠定基礎(chǔ)，從而為深入探究抗生素壓力下生物被膜的形成與耐藥性和致病性的相關(guān)性提供思路和方法。█

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