周 密 韓 智 朱正偉 朱松松 王會霞 江 豐 朱 芊

(1. 湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北 武漢 430075；2. 湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430075)

氟是人體重要的微量元素之一，參與人體的許多生命活動[1]。氟適量攝入有益于人體骨骼和牙齒的鈣化，增加骨骼的強度并維持口腔健康[2-3]，但攝入過量則會導致全身慢性蓄積性中毒，形成“地氟病”，輕者形成氟斑牙，重者造成氟骨病，嚴重影響生長發(fā)育，危害身體健康[4-5]。茶樹[Camelliasinensis(L.) O. Kuntze]有較強富集氟的能力[6-8]，葉片是茶樹富集氟的主要器官，盡管不同質(zhì)量、不同產(chǎn)地、不同品牌的茶含氟量不同[9]，但隨著茶葉葉齡的增加，葉片中氟含量也逐漸升高[10-14]，老葉含氟量更是高出嫩葉近10倍[15]。隨著近年來消費提檔升級，有學者[16]將超微茶粉直接開發(fā)成固體飲料，提高茶葉中有效成分的利用率，以滿足市場多元化需求，但缺少對該類產(chǎn)品中總氟含量的關(guān)注，如若生產(chǎn)商使用老葉或劣質(zhì)茶葉為原料加工生產(chǎn)，必定增加食用人群對于氟的攝入量，對身體健康構(gòu)成威脅。

茶葉中氟的測定前處理方法主要有浸泡法[17]、灰化堿熔法[18]和氧彈燃燒法[19-20]。現(xiàn)行國標[17]中茶葉氟的測定方法主要是針對水溶性氟，但植物細胞內(nèi)的氟難以被完全提取，無法準確反映產(chǎn)品中總氟含量；灰化堿熔法在高溫、開放的體系中進行，處理時間長達3～5 h，氟易損失[20]；氧彈燃燒使茶葉(粉)樣品在密閉富氧的條件下反應(yīng)，將氟元素全部轉(zhuǎn)化為無機態(tài)氟[20]，樣品損失小，適合茶葉總氟含量測定[19]。

定量核磁共振技術(shù)(quantitative nuclear magnetic resonance，qNMR)已被廣泛用于天然產(chǎn)物表征[21-22]、參考物質(zhì)質(zhì)量控制[23-24]和藥物分析[25-26]中，其中，核磁共振氟譜(19F quantitative nuclear magnetic resonance，19F qNMR)具備化學位移范圍大、靈敏度高、結(jié)構(gòu)近似的化合物不易出現(xiàn)峰重疊[27]等優(yōu)勢，在定量分析中應(yīng)用廣泛。研究擬選擇19F qNMR技術(shù)，以三氟乙酸為內(nèi)標，測定茶葉中氟含量，可為茶葉及其制品中總氟的數(shù)據(jù)監(jiān)控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要儀器設(shè)備

全數(shù)字化超導核磁共振譜儀：AVANCE Ⅲ 600 MHz型，德國Bruker公司；

超純水系統(tǒng)：Purelab Chorus型，英國ELGA公司；

刀式搗磨儀：GM 300型，德國Retsch GmbH公司；

強制對流通用烘箱：UF 110 PLUS型，德國Memmert公司；

電子天平：ME 204型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

粉末壓片機：FW-5型，天津市拓普儀器有限公司；

鹵素分析前裝置：WBLS-1型，含充氧裝置、點火裝置，萬邦儀表科技有限公司；

恒溫振蕩水浴鍋：WNB 29型，德國Memmert公司；

超聲波雙頻清洗機：SB25-12DTS型，寧波新芝生物科技有限公司。

1.1.2 材料與試劑

重水：純度99.9%，Cambridge Isotope Laboratories, Inc；

高純氧：純度99.999%，四川天一科技股份有限公司武漢供氣分公司；

氟化鈉、碳酸銨、檸檬酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、三氟乙酸：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

測試茶葉樣品：湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院；

茶葉(綠茶粉)中氟質(zhì)控樣品(P24307)：廣州譜恩科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 譜儀測定條件 在前人[28]的基礎(chǔ)上，根據(jù)儀器硬件條件，對譜儀測定條件適當修改。脈沖序列為zgfhigqn，采樣點數(shù)64 000，采樣時間0.961 2 s，掃描次數(shù)32次，譜寬34 091 Hz，觀察道中心頻率偏置-56 468 Hz，去耦道中心頻率偏置4 801 Hz，脈沖寬度12.0 μs，測定溫度298 K。采用t1irpg脈沖序列，確定譜儀的測定參數(shù)延遲時間d1。

1.2.2 內(nèi)標物選擇及氟標準曲線 稱取0.200 0 g三氟乙酸于100 mL容量瓶中配制成含氟當量為1.0 mg/mL的三氟乙酸溶液，將氟化鈉于120 ℃烘干2 h，準確稱取0.221 0 g，加水溶解，定容至100 mL，搖勻，濃度為1.0 mg/mL，進一步配制質(zhì)量濃度為2.0，4.0，8.0，12.0，20.0 μg/mL溶液，均含氟當量為10.0 μg/mL 的三氟乙酸溶液。精密移取540 μL標準溶液，60 μL重水于核磁管中，混勻。按1.2.1所述方法采集19F NMR譜圖，考察標物三氟乙酸與目標物氟標準溶液的分離情況，確定內(nèi)標物；以目標物、內(nèi)標物峰面積之比為縱坐標，目標物、內(nèi)標物質(zhì)量濃度之比為橫坐標，考察線性關(guān)系。

1.2.3 樣品前處理 參照文獻[19—20]，試樣經(jīng)搗磨儀粉碎、過40目篩，于80 ℃烘干至恒重，稱取約0.50 g茶葉試樣，壓片后放入氧彈坩堝中，于氧彈反應(yīng)釜內(nèi)加入15 mL 20 mmol/L碳酸銨溶液作為吸收液，擰緊氧彈蓋，緩慢充入3.0 MPa純氧，將氧彈置于振蕩水浴中，點火燃燒灰化，充分反應(yīng)后開啟放氣閥，加入金屬螯合劑，用溫水少量多次潤洗、超聲，定容至50 mL，過0.45 μm濾膜，待測。按1.2.1所述方法采集核磁氟譜，比較加入不同金屬螯合劑(檸檬酸鈉溶液、EDTA-2Na溶液、檸檬酸鈉—EDTA-2Na混合溶液，均含氟當量為10.0 μg/mL的三氟乙酸)對氟譜信號的影響。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理及計算公式 使用Bruker Topspin 3.5軟件對譜圖進行相位和基線校正，對內(nèi)標及目標峰進行峰面積積分，按式(1)計算積分結(jié)果。

(1)

式中：

X——待測物含量，mg/kg；

m——稱樣量，g；

mstd——每50.0 mL含有內(nèi)標物的質(zhì)量，μg；

Mx——待測物分子量；

Mstd——內(nèi)標分子量；

Ax——待測物定量峰信號面積；

Astd——內(nèi)標物定量峰信號面積；

nx——待測樣品包含的氟原子數(shù)，按F-計為1；

nstd——內(nèi)標物包含的氟原子數(shù)，按CF3COOH計為3。

2 結(jié)果與分析

2.1 延遲時間d1的選擇

使用NMR定量分析時，一定要保證選擇足夠長的延遲時間d1(≥5×T1)，否則對結(jié)果影響很大[28]。試驗通過t1irpg脈沖序列，測定三氟乙酸和氟化鈉的延遲時間d1，分別為3.0 s和1.6 s，故使用三氟乙酸為內(nèi)標測定樣品中氟離子時，選擇d1為15.0 s。

2.2 內(nèi)標物及定量峰的選擇

使用內(nèi)標進行定量分析過程中，需要保證內(nèi)標物質(zhì)峰與待測物質(zhì)峰良好分離。加入一定量的內(nèi)標溶液及氟化鈉標準溶液，加入10% D2O，于1.2.1所述條件進行19F NMR測試，測試譜圖見圖1。

圖1中δ=-120的尖銳單峰為氟化鈉信號峰，δ=-75的尖銳單峰為三氟乙酸信號峰，與文獻[28]相符，被測物質(zhì)的定量峰與內(nèi)標物的定量峰完全分離，說明使用三氟乙酸作為內(nèi)標具有可行性。

2.3 線性關(guān)系的確定

取質(zhì)量濃度為2.0，4.0，8.0，12.0，20.0 μg/mL溶液(均含氟當量為10.0 μg/mL的三氟乙酸溶液)進行線性關(guān)系考察。以樣品積分面積與內(nèi)標物的積分面積比(S1/S2)為縱坐標，以樣品的濃度與內(nèi)標物的質(zhì)量濃度比(C1/C2)為橫坐標，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，當樣品質(zhì)量濃度為2.0～20.0 μg/mL時，S1/S2與C1/C2呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=1.027 1x+0.037 8，回歸系數(shù)R2=0.999 5，進一步說明使用三氟乙酸作為內(nèi)標對樣品中氟進行定量分析是可行的。

2.4 金屬螯合劑的選擇

氟離子作為性質(zhì)活潑的陰離子之一，易與Ca2+、Fe3+、Mg2+、Al3+等金屬陽離子形成絡(luò)合物從而影響測定，GB 19965—2005通過添加檸檬酸鈉屏蔽金屬離子，也有學者[29]通過添加EDTA-2Na絡(luò)合金屬Al元素。試驗選取2.50%檸檬酸鈉溶液和1.25% EDTA-2Na溶液作為金屬螯合劑，考察金屬螯合劑添加與否、不同金屬螯合劑添加量對測定結(jié)果的影響。

圖1 內(nèi)標物與目標物的19F qNMR譜圖

圖2 積分面積與質(zhì)量濃度線性關(guān)系

結(jié)果表明，在不添加金屬螯合劑和只添加1.25% EDTA-2Na溶液5 mL時，經(jīng)過氧彈燃燒后的樣品在δ=-119處無目標峰出現(xiàn)，如圖3(c)和圖3(d)所示；圖3(b)中，在添加2.50%檸檬酸鈉溶液5 mL時，樣品在δ=-119處出現(xiàn)目標峰，但峰型較差，定量困難；而在添加金屬混合螯合劑(1.25% EDTA-2Na溶液、2.50%檸檬酸鈉溶液)5 mL時，樣品在δ=-119處目標峰峰型良好，如圖3(a) 所示，通過增加掃描時間，即可對目標物質(zhì)進行定量分析。這可能是由于不同螯合劑對不同價態(tài)金屬螯合作用不同，進一步將性質(zhì)活潑的絡(luò)合態(tài)氟元素，從與金屬絡(luò)合的狀態(tài)下釋放出來。另外，增加金屬螯合劑至10 mL 時結(jié)論一致，但不同金屬混合螯合劑添加量對峰響應(yīng)強度有一定影響。

進一步添加0.0，2.5，5.0，7.5，10.0 mL不同水平的金屬混合螯合劑，比較目標峰響應(yīng)響度，見圖4。結(jié)果表明，未添加金屬混合螯合劑時無目標峰響應(yīng)，金屬混合螯合劑添加至5.0 mL后響應(yīng)強度趨于穩(wěn)定，繼續(xù)添加7.5，10.0 mL 金屬混合螯合劑，信號響應(yīng)強度無明顯變化，說明在試樣稱樣量為0.5 g水平下，金屬混合螯合劑與溶液中的金屬離子充分絡(luò)合。故氧彈反應(yīng)完全，添加5.0 mL金屬混合螯合溶液為宜。

2.5 方法學考察

2.5.1 最低檢測濃度 依據(jù)《中國藥典》(2015版)第4部通則，以S/N≥3時確定最低檢測濃度，在1.2.1所述條件下，當δ為-70～-130，測定時間為8 min 31 s時，最低檢測濃度為2.0 μg/mL。

2.5.2 重復性試驗 選取茶葉(綠茶粉)中氟質(zhì)控樣品(P24307)、磚茶樣品，按1.2.3所述方法，重復測定6次，氟質(zhì)控樣品典型測試譜圖如圖5所示，定義三氟乙酸峰面積為1.000 0(原始積分數(shù)據(jù)3 568 081.9)，目標峰氟離子面積為0.293 7(原始積分數(shù)據(jù)1 047 966.5)。測試結(jié)果如表1所示，其相對偏差為6.04%～6.98%，方法重復性良好。另外，茶葉(綠茶粉)中氟質(zhì)控樣品(P24307)中位值為319 mg/kg，|Z|≤2.0時測試值范圍為258～380 mg/kg，測試值為301 mg/kg，測試結(jié)果滿意。

圖3 螯合劑對響應(yīng)強度的影響

圖4 不同體積螯合劑對響應(yīng)響度的影響

2.5.3 精密度試驗 隨機選取茶葉樣品，通過19F qNMR平行測定總氟含量6次，定義三氟乙酸峰面積為1.000 0，對目標峰積分，計算相對峰面積，6次積分面積結(jié)果相對偏差為2.50%，表明使用19F qNMR測定總氟含量具有較高的精密度。

圖5 典型樣品測試譜圖

2.5.4 回收率試驗 茶葉樣品基質(zhì)(1 226 mg/kg)中添加氟含量分別為200，400，2 000 mg/kg三水平的標準溶液，每個水平平行測定3次，計算回收率和相對偏差，結(jié)果如表2所示，加標回收率為96.3%～107.0%，相對偏差為4.20%～6.07%。

3 結(jié)論

采用氧彈燃燒對樣品進行前處理，以三氟乙酸為內(nèi)標，在無外部校準曲線的情況下，結(jié)合19F qNMR對茶葉中的總氟進行快速定量分析，填補中國使用19F qNMR測定茶葉樣品總氟含量的技術(shù)空白，30 min內(nèi)可完成單個樣品分析，檢測效率高，方法準確、穩(wěn)定性良好，具有一定的實用性。在對茶葉樣品總氟含量的分析測定中，可以考慮添加混合螯合劑，進一步釋放與金屬離子絡(luò)合的氟元素。該方法在靈敏度上存在一定的局限，后續(xù)研究中可考慮優(yōu)化譜儀脈沖條件、采用變溫試驗等方式來提高檢測靈敏度。

表1 重復性試驗

表2 回收率試驗