高林晨萌 葉 華 黃圣博 李占明 郭元新 李 超 王周平

(1. 江蘇科技大學(xué)糧食學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212004；2. 江蘇雨潤(rùn)肉食品有限公司肉品加工與質(zhì)量控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211806；3. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

食品危害物是引發(fā)食品安全問(wèn)題的主要因子，是指食品在生產(chǎn)加工過(guò)程中因質(zhì)量控制不到位而產(chǎn)生的可能導(dǎo)致疾病或傷害的生物性、化學(xué)性或物理性因子，包括致病菌、生物毒素、農(nóng)獸藥殘留、重金屬以及非法添加物等。目前對(duì)這些食品危害物檢測(cè)方法主要有生物鑒定法、色譜法、免疫分析法等[1-2]，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍，比如生物鑒定法需要進(jìn)行微生物培養(yǎng)，檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)；色譜法不僅儀器昂貴、前處理繁瑣，而且對(duì)操作人員技術(shù)要求較高；免疫分析法所使用的抗體制備難且容易變性，同時(shí)難以應(yīng)用于無(wú)免疫原性的靶標(biāo)檢測(cè)[3-4]。近年來(lái)，核酸適配體的出現(xiàn)為食品危害物檢測(cè)技術(shù)開辟了一條新途徑。核酸適配體是可以通過(guò)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)體外篩選獲得的單鏈DNA或RNA功能序列，它們能特異性結(jié)合各種靶標(biāo)，小到Hg2+、Mg2+等金屬離子，大到細(xì)胞甚至細(xì)菌[5]。由于其具有合成成本低、親和力高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，在食品安全檢測(cè)[6]、生物醫(yī)學(xué)分析[7]、疾病診斷[8]等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

隨著人們對(duì)食品安全問(wèn)題的關(guān)注，以核酸適配體為分子探針構(gòu)建的分析檢測(cè)方法在食品危害物檢測(cè)方面得到了廣泛應(yīng)用，尤其是在致病菌、生物毒素、重金屬等食品危害物單靶標(biāo)方面的分析檢測(cè)。單靶標(biāo)檢測(cè)技術(shù)針對(duì)性強(qiáng)，由于無(wú)需考慮其他靶標(biāo)的影響，一般來(lái)說(shuō)試驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，很受研究工作者歡迎。然而很多食品危害物如沙門氏菌、大腸埃希氏菌等致病菌，黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A等真菌毒素并不是單獨(dú)存在于某一食品或食品原料中，實(shí)際上多是同時(shí)共存。因此，單一的危害物靶標(biāo)檢測(cè)有可能顧此失彼，難以全面評(píng)價(jià)食品的安全性，多靶標(biāo)同時(shí)檢測(cè)是未來(lái)檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的必然趨勢(shì)。盡管可以通過(guò)多次單靶標(biāo)檢測(cè)進(jìn)行安全監(jiān)測(cè)和分析，但這樣的檢測(cè)方式耗時(shí)長(zhǎng)，有可能有潛在危害的食品或食品原料已進(jìn)入流通市場(chǎng)或人們的消費(fèi)餐桌上，造成食源性疾病事件的發(fā)生。另外多次單靶標(biāo)檢測(cè)取樣用量多、經(jīng)濟(jì)成本高，容易造成資源浪費(fèi)，增加食品安全監(jiān)管成本。因此，多靶標(biāo)同時(shí)檢測(cè)具有良好的時(shí)效性、經(jīng)濟(jì)型和高效性。近年來(lái)相關(guān)研究報(bào)道逐年增多，然而目前尚未有基于核酸適配體技術(shù)的食品危害物多靶標(biāo)同時(shí)檢測(cè)技術(shù)的相關(guān)綜述報(bào)道。基于此，文章擬對(duì)近年來(lái)利用核酸適配體技術(shù)實(shí)現(xiàn)食品危害物如致病菌、毒素、重金屬離子的多靶標(biāo)檢測(cè)研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，以期為今后開發(fā)基于核酸適配體技術(shù)的高靈敏、高通量多靶標(biāo)快速檢測(cè)方法和產(chǎn)品提供借鑒和指導(dǎo)，繼而推動(dòng)核酸適配體在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域方面的發(fā)展。

1 食品危害物核酸適配體現(xiàn)狀

自20世紀(jì)90年代Tuerk等[9]和Ellington等[10]報(bào)道核酸適配體技術(shù)以來(lái)，經(jīng)過(guò)30年的發(fā)展，廣大科研工作者開發(fā)了很多新的核酸適配體篩選技術(shù)，獲得上千種靶標(biāo)物質(zhì)的核酸適配體。在食品安全領(lǐng)域，致病菌、生物毒素、農(nóng)獸藥、重金屬離子等危害物受到廣泛關(guān)注，已通過(guò)建立的各種篩選方法篩選獲得并得到應(yīng)用。表1列舉了已報(bào)道篩選或應(yīng)用的各類食品危害物核酸適配體情況。由表1可以看出，自2008年以來(lái)，至今已有60余個(gè)食品危害物核酸適配體被報(bào)道成功篩選獲得，主要為生物毒素、抗生素、致病菌、重金屬和農(nóng)殘獸殘等幾大類，且大多都是ssDNA核酸適配體，僅有大腸埃希氏菌O157、妥布霉素、達(dá)氟沙星、環(huán)丙沙星、孔雀石綠5種危害物篩選過(guò)RNA核酸適配體。這主要是由于ssDNA比RNA相對(duì)穩(wěn)定，在生物傳感器開發(fā)和應(yīng)用上更受青睞。從序列長(zhǎng)度來(lái)看，致病菌、生物毒素等大分子危害物核酸適配體序列基本上都是在80 bp左右，即是從篩選文庫(kù)中直接篩選獲得的。而抗生素、重金屬離子、有機(jī)磷農(nóng)藥等小分子危害物核酸適配體序列長(zhǎng)度大多經(jīng)過(guò)截短優(yōu)化，縮短為21～66 bp，優(yōu)化后其仍然具有較好的親和性和特異性，有利于其生物傳感器性能的提升和經(jīng)濟(jì)成本的降低[70]。

2 食品危害物多靶標(biāo)同時(shí)檢測(cè)

2.1 致病菌多靶標(biāo)同時(shí)檢測(cè)

主要的食源性致病菌如金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特菌和致病性大腸埃希氏菌等，目前已有利用核酸適配體作為分子探針，構(gòu)建了對(duì)多種致病菌的同時(shí)檢測(cè)方法，效果良好。如Zhang等[71]基于核酸適配體特異性識(shí)別技術(shù)和納米離子增強(qiáng)拉曼信號(hào)原理，構(gòu)建了對(duì)鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)的拉曼核酸適配體生物傳感器，最低檢測(cè)限分別達(dá)15，35 CFU/mL。Li等[72]也采用表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)和金納米棒建立了大腸埃希氏菌O157：H7和鼠傷寒沙門氏菌的同時(shí)檢測(cè)。這個(gè)生物傳感器的設(shè)計(jì)策略是適配體不僅作為生物識(shí)別分子，還和拉曼報(bào)告分子一起誘導(dǎo)金納米棒生長(zhǎng)成特定的形狀從而增強(qiáng)拉曼信號(hào)實(shí)現(xiàn)靈敏檢測(cè)。Wang等[73]則將鼠傷寒沙門氏菌核酸適配體和金黃色葡萄球菌核酸適配體分別標(biāo)記在NaGdF4:Eu和NaYF4:Ce/Tb兩種摻鑭時(shí)間分辨熒光納米顆粒上作為信號(hào)探針，以Fe3O4磁性納米顆粒固定化的核酸適配體作為捕獲探針，在同一波長(zhǎng)的激發(fā)光下進(jìn)行激發(fā)，產(chǎn)生不重疊的發(fā)射光譜，從而實(shí)現(xiàn)了鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的核酸適配體同時(shí)檢測(cè)技術(shù)。通過(guò)優(yōu)化試驗(yàn)條件，檢測(cè)限分別達(dá)15，20 CFU/mL，且在102～105范圍內(nèi)具有很好的線性關(guān)系，在實(shí)際樣品檢測(cè)中與平板計(jì)數(shù)法結(jié)果具有較好的一致性。

除兩種致病菌同時(shí)檢測(cè)之外，Lu等[74]基于雙適配體夾心模型設(shè)計(jì)了一種核酸適配體測(cè)流試紙條，實(shí)現(xiàn)了鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157：H7和金黃色葡萄球菌3種致病菌的同時(shí)檢測(cè)，檢測(cè)原理如圖1所示。但該方法靈敏度相對(duì)較低，其LOD分別達(dá)103，104，104CFU/mL。由此可見，兩種以上的致病菌多靶標(biāo)檢測(cè)由于標(biāo)記的多樣性和體系的復(fù)雜性，其檢測(cè)難度加大，檢測(cè)限下降明顯，還有提升的空間。

2.2 生物毒素多靶標(biāo)同時(shí)檢測(cè)

生物毒素是引發(fā)食品安全問(wèn)題的主要因素之一。生物毒素按其來(lái)源可分為細(xì)菌毒素、真菌毒素、動(dòng)物毒素、植物毒素、海洋生物毒素等，種類繁多、分布廣泛，通常以某種高特異性方式作用于離子通道、酶、受體、基因等靶位，其中微生物毒素不僅影響范圍廣，而且危害極大。目前已報(bào)道篩選獲得的生物毒素類核酸適配體有金黃色葡萄球菌腸毒素核酸適配體、黃曲霉毒素B1核酸適配體、赭曲霉毒素A核酸適配體、T-2毒素核酸適配體、微囊藻毒素等，這些毒素核酸適配體篩選的獲得為它們的多靶標(biāo)檢測(cè)技術(shù)的構(gòu)建奠定了良好的基礎(chǔ)。Huang等[75]則利用篩選獲得的金黃色葡萄球菌腸毒素A、B和C1核酸適配體分別作為識(shí)別探針，以互不干擾的多色鑭系參雜納米顆粒為信號(hào)探針，利用氧化石墨烯作為熒光猝滅劑構(gòu)建了基于多色時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移的檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了3種腸毒素的同時(shí)檢測(cè)，其檢測(cè)限分別達(dá)0.062，0.069，0.040 ng/mL，具有較好的靈敏性和高通量特點(diǎn)。

然而目前生物毒素多靶標(biāo)檢測(cè)報(bào)道較多的還是兩種靶標(biāo)的同時(shí)檢測(cè)，且其檢測(cè)靈敏度明顯高于3種毒素的同時(shí)檢測(cè)。如王成全[76]將赭曲霉毒素A和伏馬菌素B1核酸適配體偶聯(lián)量子點(diǎn)形成納米生物復(fù)合物，建立了基于SiO2@Cd Te和SiO2@Pb S為標(biāo)記物的電化學(xué)核酸適配體生物傳感器實(shí)現(xiàn)了玉米樣品中兩種真菌毒素的同時(shí)檢測(cè)，最低檢測(cè)限分別達(dá)5，20 pg/mL。Qian等[77]利用核酸適配體構(gòu)建了一種磁控?zé)晒馍飩鞲衅鲗?shí)現(xiàn)了赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素B1的同時(shí)檢測(cè)，檢測(cè)原理如圖2 所示。不僅檢測(cè)線性范圍寬，而且檢測(cè)限達(dá)到皮克數(shù)量級(jí)，分別達(dá)0.67，1.70 pg/mL。Wang等[78]將玉米赤霉烯酮核酸適配體和赭曲霉毒素A核酸適配體分別標(biāo)記Cy3和Alexa Fluor488熒光基團(tuán)作為分子探針，設(shè)計(jì)了一種基于氧化石墨烯的核酸適配體生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了兩種毒素的同時(shí)檢測(cè)，最低檢測(cè)限分別達(dá)1.797，1.484 ng/mL。綜上，利用熒光標(biāo)記技術(shù)在生物毒素同時(shí)檢測(cè)方面應(yīng)用更為常見，主要是利用在不同的核酸適配體分子上標(biāo)記不同的熒光分子構(gòu)建相應(yīng)的檢測(cè)方法從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，但是熒光標(biāo)記一定程度上增加了檢測(cè)成本。

2.3 農(nóng)獸藥殘留多靶標(biāo)同時(shí)檢測(cè)

在農(nóng)作物生產(chǎn)和畜產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中，為了保證其良好生長(zhǎng)和健康成長(zhǎng)，通常要使用農(nóng)藥和獸藥，因此農(nóng)獸藥殘留在農(nóng)產(chǎn)品、畜產(chǎn)品中較為常見。中國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)獸藥殘留是食品安全監(jiān)督管理部門重點(diǎn)監(jiān)測(cè)方向之一。農(nóng)獸藥分子的核酸適配體篩選目前報(bào)道將近20種(見表1)，以它們?yōu)榉肿犹结橀_發(fā)的同時(shí)檢測(cè)技術(shù)報(bào)道近年來(lái)逐漸增多。如周佳偉[79]基于核酸適配體識(shí)別和量子點(diǎn)技術(shù)構(gòu)建了一種熒光生物傳感器用于卡那霉素和妥布霉素的同時(shí)檢測(cè)，最低檢測(cè)限分別為0.11，0.21 mg/L，并成功應(yīng)用于牛奶產(chǎn)品中的卡那霉素和妥布霉素殘留檢測(cè)。王葉[80]結(jié)合熒光法和微流控方法構(gòu)建了一種新型的適配體生物傳感器用于同時(shí)檢測(cè)卡娜霉素和氯霉素殘留，經(jīng)優(yōu)化試驗(yàn)條件，其最低檢測(cè)限分別為0.7，0.9 pg/mL。

表1 已報(bào)道的食品危害物核酸適配體情況

圖1 構(gòu)建核酸適配體測(cè)流試紙條實(shí)現(xiàn)3種致病菌同時(shí)檢測(cè)原理圖[74]

圖2 磁控?zé)晒馍飩鞲衅魍瑫r(shí)檢測(cè)OTA和AFB1設(shè)計(jì)原理圖[77]

除了利用多條核酸適配體實(shí)現(xiàn)多靶標(biāo)同時(shí)檢測(cè)之外，人們還通過(guò)改進(jìn)篩選技術(shù)或裁剪優(yōu)化序列獲得廣譜型核酸適配體，用于同一類危害物分子的同時(shí)檢測(cè)。如Kwon等[70]對(duì)長(zhǎng)度76 bp的土霉素OTC核酸適配體進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)序列同源性分析，獲得保守序列并對(duì)其加以優(yōu)化最終獲得一條長(zhǎng)8 bp的廣譜型四環(huán)素類核酸適配體，它能同時(shí)識(shí)別四環(huán)素、土霉素、脫氧土霉素、氯四環(huán)素4種抗生素，并以此為分子探針構(gòu)建了超靈敏比色法實(shí)現(xiàn)了多種抗生素的同時(shí)檢測(cè)，檢測(cè)原理如圖3所示。該方法的最低檢測(cè)限達(dá)0.1 nmol/L。而Zhang等[81]通過(guò)裁剪、突變等手段設(shè)計(jì)了一種有機(jī)磷農(nóng)藥的廣譜適配體，并結(jié)合分子信標(biāo)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)4種有機(jī)磷農(nóng)藥(甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷和氧化樂(lè)果)的同時(shí)檢測(cè)。這些通過(guò)下游工程改造核酸適配體分子探針為廣譜型探針，實(shí)現(xiàn)了一個(gè)核酸適配體分子探針能同時(shí)識(shí)別多個(gè)危害物靶標(biāo)，在定性分析中具有較好的應(yīng)用前景。

2.4 重金屬多靶標(biāo)同時(shí)檢測(cè)

隨著工業(yè)化進(jìn)程的加快發(fā)展，工業(yè)三廢給生態(tài)環(huán)境帶來(lái)嚴(yán)重危害，尤其是汞、鎘、砷、鉛等的排放不僅污染了土壤、水資源，還對(duì)其周圍種植養(yǎng)殖的農(nóng)作物、畜產(chǎn)品及水產(chǎn)品等帶來(lái)危害，進(jìn)而通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，可能聚集于某些器官造成慢性中毒，對(duì)人類健康危害極大[82]。目前汞、鎘、砷、鉛等重金屬的核酸適配體均已成功篩選并報(bào)道，因此，基于核酸適配體的多種重金屬同時(shí)檢測(cè)方法相應(yīng)受到關(guān)注。如Wu等[83]引入雙色上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒構(gòu)建了一種可控的金納米材料為熒光能量受體的雙重?zé)晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移檢測(cè)體系，實(shí)現(xiàn)了Pb2+和Hg2+的同時(shí)檢測(cè)，其檢測(cè)限分別為50，150 pmol/L。Khoshbin等[55]開發(fā)了一種簡(jiǎn)單易行、快速靈敏的紙基核酸適配體傳感器，可在10 min內(nèi)完成Hg2+和Ag+的同時(shí)檢測(cè)，其檢測(cè)限分別低至1.33，1.01 pmol/L，且成功應(yīng)用于水、牛奶等實(shí)際樣品的分析檢測(cè)。周羽婷等[54]用Hg2+、Pb2+和Sr2+離子核酸適配體作為分子探針，根據(jù)核酸結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換原理，結(jié)合納米孔膜技術(shù)開發(fā)了一種新型高靈敏電化學(xué)傳感器，實(shí)現(xiàn)了3種金屬離子的分步同時(shí)檢測(cè)。該電化學(xué)傳感器具有優(yōu)秀的靈敏性和選擇性，最低檢測(cè)限分別達(dá)0.013，0.017，0.022 nmol/L。

圖3 四環(huán)素類廣譜型核酸適配體設(shè)計(jì)原理圖

2.5 非同類型危害物多靶標(biāo)同時(shí)檢測(cè)

除了同一類型危害物多靶標(biāo)的同時(shí)檢測(cè)技術(shù)外，還有學(xué)者報(bào)道了不同類型食品危害物混合多靶標(biāo)同時(shí)檢測(cè)技術(shù)。這種不同類型危害物多靶標(biāo)同時(shí)檢測(cè)體系可能更復(fù)雜，但是更能適應(yīng)實(shí)際需求。如Yan等[84]利用Fe3O4和SiO2納米顆粒作為載體，將赭曲霉毒素A適配體和ATP適配體通過(guò)非共價(jià)鍵方式固定在納米顆粒上，建立了一種發(fā)光化學(xué)分析法，實(shí)現(xiàn)了啤酒樣品中赭曲霉毒素A和ATP的同時(shí)檢測(cè)。該檢測(cè)方法線性范圍寬，回收率好，最低檢測(cè)限分別達(dá)9.02，9.31 nmol/L。除了兩種不同類型危害物同時(shí)檢測(cè)外，Jin等[85]還設(shè)計(jì)了3種不同類型危害物的同時(shí)檢測(cè)方法，將Hg2+、赭曲霉毒素A和沙門氏菌核酸適配體分別標(biāo)記在不同上轉(zhuǎn)換納米材料上，構(gòu)建了一種測(cè)流適配體分析技術(shù)，并結(jié)合智能手機(jī)開發(fā)了一種便攜式檢測(cè)設(shè)備，該方法靈敏特異、操作方便，可滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)要求，其最低檢測(cè)限分別為5 ng/mL，3 ng/mL 和85 CFU/mL，進(jìn)一步研究表明其可在30 min內(nèi)完成水樣中3種危害物的同時(shí)檢測(cè)。He等[86]則將卡那霉素、黃曲霉毒素M1和17β-雌二醇3種核酸適配體分子探針組裝到磁性納米顆粒上，建立了一種微流控芯片技術(shù)實(shí)現(xiàn)了多靶標(biāo)同時(shí)檢測(cè)，檢測(cè)原理如圖4所示。最低檢測(cè)限分別達(dá)0.32，0.95，6.80 pg/mL。該微流控芯片不僅解決了復(fù)雜基質(zhì)的干擾問(wèn)題，還極大地增強(qiáng)了檢測(cè)的靈敏性和選擇性，而且檢測(cè)性能穩(wěn)定，耗時(shí)短，3 min即能實(shí)現(xiàn)牛奶樣品中卡那霉素、黃曲霉毒素M1和17β-雌二醇3種靶標(biāo)的同時(shí)檢測(cè)。

圖4 基于磁納米三元DNA分子探針的微流控芯片同時(shí)檢測(cè)卡那霉素、黃曲霉毒素M1和17β-雌二醇原理圖[86]

3 展望

綜上所述，核酸適配體作為分子探針在食品安全檢測(cè)研究領(lǐng)域的應(yīng)用已取得了一定的成果，多靶標(biāo)高通量檢測(cè)技術(shù)的開發(fā)是未來(lái)發(fā)展必然趨勢(shì)。結(jié)合當(dāng)前研究開發(fā)現(xiàn)狀和未來(lái)實(shí)際應(yīng)用需求，基于核酸適配體技術(shù)的食品危害物生物傳感器的研發(fā)還需在以下4個(gè)方面加強(qiáng)研究：① 要進(jìn)一步加大單靶標(biāo)檢測(cè)向多靶標(biāo)同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)變的力度，結(jié)合新興的科學(xué)技術(shù)進(jìn)行學(xué)科和技術(shù)交叉融合，開發(fā)更多、更靈敏、更快速而準(zhǔn)確的高通量檢測(cè)方法，其中微流控芯片是未來(lái)重點(diǎn)發(fā)展的方向之一；② 要進(jìn)一步通過(guò)截短、裁剪等方式優(yōu)化核酸適配體序列，在獲得性能更好的分子探針基礎(chǔ)上，短序列不僅有利于多靶標(biāo)同時(shí)檢測(cè)生物傳感器的設(shè)計(jì)還有利于降低經(jīng)濟(jì)成本；③ 要進(jìn)一步拓寬多靶標(biāo)食品危害物檢測(cè)方法范圍，當(dāng)前主要以熒光法為主，核酸適配體需要進(jìn)行熒光標(biāo)記，這在一定程度上增加了檢測(cè)成本，因此免標(biāo)記的同時(shí)檢測(cè)方法具有較好的開發(fā)和應(yīng)用前景；④ 要進(jìn)一步加強(qiáng)快速、靈敏、便攜的檢測(cè)設(shè)備的研發(fā)，可利用大數(shù)據(jù)技術(shù)、可視化技術(shù)、人工智能技術(shù)等開發(fā)基于核酸適配體分子探針的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)設(shè)備，以滿足實(shí)際應(yīng)用需求。相信隨著科技的不斷發(fā)展和廣大科研工作者的不懈努力，基于核酸適配體的高靈敏、高通量的多靶標(biāo)快速檢測(cè)技術(shù)必將迎來(lái)美好的春天。