劉存芳 魏玲玲 王乙穎 吳 睿 田光輝

(1. 陜西理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中 723000；2. 陜西省催化基礎(chǔ)與應(yīng)用重點實驗室，陜西 漢中 723000)

玫瑰紅景天又名薔薇紅景天(RhodiolaroseaL.)[1]，是一種野生的紅景天屬草本植物，分布于中國西藏、甘肅以及芬蘭、保加利亞等地[2]，全草可食用或藥用[3]，是常用的珍稀中藥材。研究表明，玫瑰紅景天有抗輻射、抗自由基損傷、抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫力等功效[4]，可用于治療冠心病、中風(fēng)偏癱、胸痹心痛等病癥，還能益氣通脈、活血平喘[5]。玫瑰紅景天中活性物質(zhì)有紅景天甙[6]、紅景天素、絡(luò)塞維等[7-8]，其深加工研究主要側(cè)重于活性物質(zhì)的分離鑒定[9-11]、測試醇提取物和揮發(fā)性物質(zhì)的活性[12-14]，以及提取物的毒性和安全性[15]，并開發(fā)出了紅景天酸奶、固體飲料等功能產(chǎn)品[16-17]。梁淑珍等[18]曾于80 ℃下用70%乙醇回流提取薔薇紅景天醇提物，并研究其乙酸乙酯相、正丁醇相和水相3種極性部位的抗氧化活性。通常情況下用乙醇水溶液提取出來的多是黃酮、多酚以及水溶性大分子蛋白質(zhì)、多糖等化合物，還會有少量小分子極性物質(zhì)，而無水乙醇提取物中蛋白質(zhì)、多糖相對較少，其活性物質(zhì)及提取物的生物活性可能存在差異。研究擬對玫瑰紅景天無水乙醇提取物的環(huán)己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取物及水相物的活性成分含量及生物活性進(jìn)行測試分析，以期為玫瑰紅景天醇提取物的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

玫瑰紅景天(RhodiolaroseaL.)：收集于西藏林芝地區(qū)，經(jīng)陜西理工大學(xué)趙樺教授識別和確認(rèn)，將其根莖低溫干燥至恒重，粉碎過50目篩后密封保存；

金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC25925)、腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis50040)、大腸桿菌(EscherichiacoliATCC25922)、肺炎鏈球菌(StreptococcuspneumoniaeATCC49619)、肺炎克雷伯氏菌株(KlebsiellapneumoniaeATCC 10031)、傷寒沙門氏菌(SalmonellatyphiCMCC50071)、鼠傷寒沙門菌(Salmonelltyphimurium50013)、短小芽孢桿菌(BacilluspumilusATCC7061)、白色念株菌(CandidaalbicansATCC10231)：中國食品藥品檢定研究院；

紅景天甙、蘆?。杭兌?≥ 98.8%，中國食品藥品檢定研究院；

水解酪蛋白胨肉湯(MHB)、肉湯培養(yǎng)基(CM)、普通瓊脂平板培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司；

無水乙醇、環(huán)己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、磷酸氫鈉、磷酸、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、雙氧水溶液、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、維生素C、三氯乙酸、氯化鐵等：分析純，西安化學(xué)試劑廠；

試驗用水為二次蒸餾水。

1.1.2 儀器

紫外可見光光度計：UV-6100型，上海精密儀器儀表有限公司；

生化培養(yǎng)箱：SPX-150B型，常州市偉嘉儀器制造有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：101-0型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HH-2型，北京科偉永興儀器有限公司；

電子天平：AL-204-IC型，北京瑞澤康科技有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：EYELA型，上海巴玖實業(yè)有限公司；

微型植物粉碎機(jī)：FZ102型，北京格拉威爾科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 玫瑰紅景天醇提物的制備 稱量玫瑰紅景天粉末60.0 g用濾紙筒包好，裝進(jìn)抽提筒，加無水乙醇至虹吸管口浸泡，圓底燒瓶中加總體積1/2的乙醇，80 ℃水浴下循環(huán)提取至抽提筒中乙醇呈無色(約回流24 h)，回收乙醇，得深褐色的玫瑰紅景天乙醇提取物。重復(fù)提取10次，合并提取物，冷凍干燥至恒重。

1.2.2 不同溶劑萃取物和水相物的制備 將玫瑰紅景天乙醇提取物按m乙醇提取物∶V水= 1∶100 (g/mL)分散于水中，搖勻，形成懸濁液，按V水溶液∶V環(huán)己烷= 9∶1先用環(huán)己烷萃取3次，合并萃取液后蒸餾回收環(huán)己烷，得到環(huán)己烷萃取物。同理，按V水溶液∶V有機(jī)溶劑= 9∶ 1依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。水相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干得到水相物。冷凍干燥后稱重。

重復(fù)操作3次，合并各相應(yīng)的萃取物和水相物，密封備用。

1.2.3 總酚和總黃酮含量的測定

(1) 總酚含量：參照文獻(xiàn)[19]，以紅景天甙為對照品，乙醇為溶劑。分別稱取萃取物和水相物各200.00 mg 用乙醇溶解，定容于5個100 mL容量瓶中配成2.0 mg/mL溶液。

(2) 總黃酮含量：參照文獻(xiàn)[1]，以蘆丁為對照品，乙醇為溶劑。

1.2.4 體外抗氧化活性試驗 現(xiàn)配現(xiàn)用溶液，1.5 mmol/L 鄰二氮菲乙醇溶液、1.5 mmol/L硫酸亞鐵水溶液、0.1 mmol/mL的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼乙醇溶液即DPPH溶液及質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%過氧化氫溶液。pH 7.4摩爾濃度150 mmol/L PBS緩沖溶液：稱取3.121 g 磷酸二氫鈉用水溶解定容于100 mL容量瓶中，14.328 g磷酸氫鈉定容于200 mL容量瓶中，分別吸量38.0 mL磷酸二氫鈉溶液和162.0 mL磷酸氫鈉溶液于300 mL容量瓶中定容。

(1) 清除DPPH·能力：根據(jù)文獻(xiàn)[20]，修改如下：調(diào)配0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mg/mL系列質(zhì)量濃度的萃取物、水相物、維生素C無水乙醇溶液，作為測試液。取36支 10 mL比色管，取1 mL不同質(zhì)量濃度的測試液，每管加入2 mL DPPH溶液，無水乙醇定容混勻，避光室溫放置30 min；以無水乙醇為空白，以無水乙醇代替DPPH溶液為對照，在517 nm下測定吸光度A。重復(fù)測量3次。按式(1)計算DPPH·清除率。

(1)

式中：

D——DPPH·清除率，%；

A0——空白試驗吸光度；

A1——測試液吸光度；

A2——對照試驗吸光度。

(2) 清除·OH能力：根據(jù)文獻(xiàn)[13]，修改如下：取8支 10 mL比色管，均加入3.0 mL PBS溶液及1.0 mL鄰二氮菲溶液搖勻，再加入2.0 mL硫酸亞鐵溶液搖勻，分別吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL的2.0 mg/mL環(huán)己烷萃取物無水乙醇溶液加入編號為1～6號管中，作為測試液；另2支管標(biāo)為損傷管和未損傷管，不加環(huán)己烷萃取物溶液，其中1～6號管和損傷管中再滴加1 mL過氧化氫溶液，未損傷管不加過氧化氫溶液。8支管中補(bǔ)水至刻度搖勻，置于生化培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃下反應(yīng)50 min后取出冷至室溫，在510 nm下測定吸光度A。重復(fù)測量3次。同樣，分別用氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水相物和維生素C溶液代替環(huán)己烷萃取物溶液。按式(2)計算·OH清除率。

(2)

式中：

H——·OH清除率，%；

A0——未損傷管吸光度；

A1——損傷管吸光度；

A2——加測試液吸光度。

(3) 還原能力：根據(jù)文獻(xiàn)[18]，修改如下：配置環(huán)己烷萃取物1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mg/mL不同濃度的測試液。在6支10 mL離心管中加入3.0 mL PBS溶液、1.5 mL 0.01 g/mL鐵氰化鉀溶液搖勻后，依次加2 mL不同濃度的測試液，搖勻，50 ℃水浴下反應(yīng)20 min，冷卻至室溫，再分別加入1 mL水和2.5 mL體積分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液，搖勻后離心。在6支比色管中加入3 mL離心液、2 mL 0.1 g/mL氯化鐵溶液以及1mL水，搖勻靜置10 min，在700 nm下測定吸光度，重復(fù)測量3次。同樣，分別用氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水相物和維生素C替代環(huán)己烷萃取物。

1.2.5 萃取物和水相物的抗菌試驗 依據(jù)文獻(xiàn)[20—21]，將萃取物和水相物分別溶于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% Tween-80的肉湯中配成20.00 mg/mL的6種測試溶液，微量二倍稀釋法測試最小抑菌濃度(MIC)，平面轉(zhuǎn)種法測試最小殺菌濃度(MBC)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，相關(guān)性分析用SPSS軟件，繪圖用OriginLab Origin V8.0軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同溶劑萃取物的提取率

如表1所示，不同溶劑萃取物間有顯著性差異(P<0.05)，其中乙酸乙酯萃取物是氯仿萃取物的2倍，環(huán)己烷萃取物和水相物的提取率相當(dāng)。玫瑰紅景天乙醇提取物中乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和氯仿萃取物占總提取物重量的87.34%。

2.2 萃取物和水相物中總酚和總黃酮含量

由表2可知，不同溶劑萃取物和水相物中均含總酚和總黃酮，且二者在各萃取物中的含量存在顯著性差異(P<0.05)，其中乙酸乙酯萃取物中總酚和總黃酮含量最高，分別為(469.32±1.15)，(338.57±0.92) mg/g萃取物。

2.3 萃取物和水相物的抗氧化活性

2.3.1 清除DPPH·的能力 由圖1可知，不同溶劑萃取物和維生素C對DPPH·的清除作用均存在量效關(guān)系，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.02～0.12 mg/mL時，隨著萃取物質(zhì)量濃度的增加，清除率也相應(yīng)地增加，而維生素C清除DPPH·的能力相對最強(qiáng)。不同溶劑萃取物對DPPH·有明顯的清除作用，與文獻(xiàn)[22]報道的紅景天提取物有較好的體外抗氧化作用有相似性。相同濃度下不同溶劑萃取物和水相物對DPPH·清除能力大小為：乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>氯仿萃取物>環(huán)己烷萃取物>水相物。

表1 玫瑰紅景天乙醇提取物和不同溶劑萃取物的提取率?

圖1 不同溶劑萃取物和水相物清除DPPH·的效果

2.3.2 清除·OH的能力 由圖2可知，不同溶劑萃取物和水相物對H2O2/Fe2+體系經(jīng)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH 有清除作用。不同溶劑萃取物、水相物和維生素C對·OH均表現(xiàn)出明顯的清除效果，在0.02～0.12 mg/mL 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，清除能力呈量效關(guān)系，維生素C清除·OH的能力最強(qiáng)。不同溶劑萃取物和水相物清除·OH的能力存在差異，相同質(zhì)量濃度下對·OH 清除能力大小為正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物>氯仿萃取物和水相物>環(huán)己烷萃取物，與文獻(xiàn)[18]報道的相同濃度下正丁醇相清除·OH的能力強(qiáng)于乙酸乙酯相的結(jié)果一致。

圖2 不同溶劑萃取物和水相物清除·OH的效果

2.3.3 還原能力 由圖3可知，不同溶劑萃取物、水相物和維生素C均有不同程度的還原能力，在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其抗氧化活性隨質(zhì)量濃度的增加而增大，呈較好的量效關(guān)系。維生素C還原能力最強(qiáng)，乙酸乙酯萃取物的還原能力明顯高于其他萃取物，與文獻(xiàn)[22—23]報道的紅景天乙醇提取物有抗氧化作用的結(jié)果一致。

2.3.4 活性成分含量與氧化活性的相關(guān)性 通過Spearman分析不同溶劑萃取物和水相物的抗氧化活性(清除DPPH·、清除·OH、還原能力)與其活性成分(總酚和總黃酮)含量之間的相關(guān)性[24]，結(jié)果如表3所示。由表3可知，抗氧化活性與活性成分含量之間均存在顯著的相關(guān)性(P<0.05)，此外，抗氧化活性之間表現(xiàn)出強(qiáng)相關(guān)性，說明抗氧化活性測定是可靠的；總酚和總黃酮含量之間也表現(xiàn)出相關(guān)性。

2.4 萃取物和水相物的抗菌效果

由表4可知，不同溶劑萃取物及水相物對試驗菌株均有抑制和滅活作用。從MIC值來看，對9種細(xì)菌抑制作用強(qiáng)弱為氯仿萃取物>乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>環(huán)己烷萃取物>水相物，在9種細(xì)菌中對金黃色葡萄球菌和腸炎沙門氏菌均有較強(qiáng)的抑制作用，氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物的抑菌殺菌活性與文獻(xiàn)[19]的結(jié)果一致。從MBC值來看，不同溶劑萃取物和水相物對試驗菌株有不同程度的滅活作用，對金黃色葡萄球菌ATTCC25925株滅活作用更明顯。

圖3 不同溶劑萃取物和水相物的還原能力

表3 活性成分含量與氧化活性的Spearman相關(guān)系數(shù)?

表4 不同溶劑萃取物和水相物對試驗菌株的MIC值和MBC值

3 結(jié)論

以無水乙醇為溶劑對玫瑰紅景天進(jìn)行回流提取，將醇提物溶于水并分別用環(huán)己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取。經(jīng)測定，乙酸乙酯萃取物中總酚和總黃酮含量最高；乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的抗氧化活性更為明顯；不同溶劑萃取物和水相物的抗氧化活性與其活性成分含量呈顯著相關(guān)性(P<0.05)；不同溶劑萃取物和水相物對9種試驗菌株均有抑制作用和滅活作用，對金黃色葡萄球菌和腸炎沙門氏菌的作用效果更好，氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物的抗菌活性較為顯著。試驗僅對玫瑰紅景天醇提取物的不同溶劑萃取物和水相物的抗氧化和抗菌活性進(jìn)行了初步測試，其萃取物和水相物中所含活性物質(zhì)的種類和結(jié)構(gòu)等還需要進(jìn)一步研究。