李 堅 梁 茉 郭焱雄 胡軍祖

(1 湖南省郴州市第一人民醫(yī)院南院急診科，郴州市 423000，電子郵箱：11830027@qq.com；2 桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨科，廣西桂林市 541000)

根性神經痛是指脊神經根受到各種有害性刺激而引起的疼痛，是腰椎間盤突出癥中最常見的癥狀，嚴重影響患者的生活質量[1]。根性神經痛發(fā)病率較高，其發(fā)病機制與治療仍存在很大的爭論。以往的觀點認為機械性壓迫是導致神經根疼痛的最主要因素，但近年來有研究表明自身免疫反應和相關炎癥介質是導致神經根疼痛的關鍵因素[2-3]，但其引起的神經根損傷的具體機制仍有待進一步闡明。本研究通過檢測非壓迫性椎間盤髓核突出導致神經根損傷大鼠血清中白細胞介素(interleukin，IL)-17、IL-23的表達水平，探討IL-23/IL-17炎癥軸在神經損傷中的作用，為根性神經痛的治療提供新策略。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑 雄性SD大鼠48只購自桂林醫(yī)學院動物實驗中心[動物合格證號： SCXK (桂)2013-0001]，10月齡，體重在300～350 g之間，并飼養(yǎng)于無特定病原體級環(huán)境中，同組每2只大鼠飼養(yǎng)于一個鋼絲籠中，室溫度為 22℃～26℃，每日早晨8:00至晚20:00開燈，晚20:00至次日8:00熄燈，給予充足的食物和水。大鼠IL-17 酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒、IL-23 ELISA試劑盒均購于Santa Cruz Biotechnology公司(批號：A1324、A1316)。

1.2 模型建立、分組與處理 采用隨機數(shù)字表法將48只大鼠分為實驗組與對照組，每組24只。參考文獻[4]的方法進行動物造模：采用7%水合氯醛(1.5 mL/只)腹腔內注射后將大鼠固定于動物手術臺上，常規(guī)備皮、消毒;以L4～5椎間隙為中心，做約長2 cm的后正中切口，顯露L4～5關節(jié)突關節(jié)及橫突，小型咬骨鉗咬除L4～5右側關節(jié)突及椎板，顯露L4～5神經根；消毒實驗組大鼠尾，距根部1 cm處切斷，切開尾椎間盤，取4～5個椎間盤髓核組織，放置在L4～5神經根周圍，但不壓迫神經根，消毒后縫合，制作成非壓迫性椎間盤髓核突出的動物模型。對照組采用同樣的手術方法造模，但神經根旁不放置髓核組織。

1.3 檢測指標 分別于術后1周、3周、5周，每組采用隨機數(shù)字表法選取8只大鼠，檢測大鼠的右后肢疼痛縮爪閾值及血清IL-17、IL-23水平，并觀察大鼠腰椎神經根形態(tài)學變化。(1)參考文獻[4]中的方法檢測大鼠右后肢疼痛縮爪閾值：將大鼠右后肢外露并固定，待大鼠安靜后，用自制的痛閾測量器檢測大鼠右后肢縮爪閾值。測量器由1個5 mL注射器和水銀血壓計改裝而成，將注射器的內芯做成活塞，20 mL注射器的針尖磨鈍并粘在活塞上，注射器與血壓計用硅膠管相連。將磨鈍的注射器針頭置于大鼠右后爪的第2～3跖骨之間，捏皮囊給血壓計充氣，將大鼠出現(xiàn)尖叫或縮爪時的血壓計讀數(shù)作為疼痛縮爪閾值，間隔至少20 min后再次測量1次，取平均值。(2)檢測血清IL-17、IL-23水平：抽取大鼠腹腔靜脈血2 mL，置于血清分離管中在室溫放置2 h，然后室溫下以2 000 r/min離心20 min，取上清并置于-20℃保存；采用ELISA法檢測大鼠血清中IL-23、IL-17的表達水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。(3)觀察大鼠腰椎神經根形態(tài)學變化：將大鼠脫臼處死后顯露其腰神經根，切取1 cm L4～5神經根標本，然后浸泡在福爾馬林液中固定1周；然后將神經根包埋在石蠟中進行切片，厚度為10 μm；將切片脫蠟并進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色；常規(guī)脫水、透明、樹膠封片，在顯微鏡下觀察大鼠腰椎神經根形態(tài)學變化并照相保存。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

實驗組大鼠術后逐漸出現(xiàn)易激惹、多動等現(xiàn)象，術后3周時最為明顯，術后5周時恢復正常；而對照組大鼠術后未出現(xiàn)易激惹、多動等現(xiàn)象。術后1周、3周時，實驗組大鼠右后肢疼痛縮爪閾值均低于對照組，血清IL-23與IL-17水平均高于對照組(均P<0.05)；而術后5周時，兩組大鼠的右后肢縮爪閾值及血清IL-23、IL-17水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表1～3。

表1 兩組大鼠右后肢疼痛縮爪閾值的比較(x±s，mmHg)

表2 兩組大鼠血清IL-17及IL-23水平的比較(x±s，pg/mL)

HE染色結果顯示：對照組大鼠術后神經纖維排列規(guī)律，大小基本一致，髓鞘完整，呈紅色，位于軸突周圍，未發(fā)現(xiàn)變性改變和炎癥細胞浸潤。術后1周時實驗組大鼠神經根縱切面可見神經纖維髓鞘部分崩解并呈空泡病變，可見炎癥細胞浸潤；術后3周時其神經根損傷加重，神經纖維排列不規(guī)律，大小不一，髓鞘崩解，空泡樣病變嚴重；術后5周時其神經根基本恢復正常。見圖1。

圖1 造模后兩組大鼠腰椎神經根形態(tài)學變化(HE染色，×200)注：圖A～C分別為對照組術后1周、3周、5周神經根縱切面，圖D～F分別為實驗組術后1周、3周、5周神經根縱切面。

3 討 論

有研究表明，椎間盤髓核是一種自身抗原，在暴露或纖維環(huán)損傷后，淋巴細胞會在局部椎間盤組織中聚集[5]。Kimura等[6]研究發(fā)現(xiàn)，椎間盤髓核可導致神經根損傷。背根神經節(jié)是軀體感覺的初級傳入神經元，其周圍分布著大量的痛覺感受器，當機體組織損傷或發(fā)生炎癥時，受損細胞釋放的內源性致痛物質能激活痛覺感受器，或使其閾值降低。Kato等[7]報告，5-羥色胺可以使大鼠出現(xiàn)明顯的痛覺過敏。動物實驗證實，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)可以使大鼠的下肢出現(xiàn)明顯的痛覺過敏，背根神經節(jié)出現(xiàn)明顯的形態(tài)學變化[8]。本研究結果顯示，術后1周、3周實驗組大鼠的腰椎神經根縱切面可見神經根損傷，術后5周時其神經根形態(tài)基本恢復正常，表明髓核組織具有自身免疫源性，顯露后可激發(fā)免疫炎癥反應導致神經根損傷。因此，進一步研究免疫炎癥反應對神經根損傷的具體作用機制意義重大。

IL-23屬于IL-12超家族中的一員，是由P19和P40亞單位以共價二硫鍵結合組成的異二聚體分子。Oppmann等[9]于2000年首次報告IL-23是一種新的促炎癥細胞因子。近年來許多研究關注IL-23的生物學功能及其在免疫相關性疾病中的潛在治療作用，例如感染、炎癥、自身免疫和腫瘤等領域。Jiang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，腰椎間盤突出癥患者的髓核組織中IL-23表達增高，且在纖維環(huán)破裂髓核組織完全暴露者中IL-23的表達進一步增高，提示IL-23參與椎間盤突出的發(fā)病過程。IL-17是一種強烈的促炎癥細胞因子，主要由Th17/調節(jié)性T細胞(T regulatory cell，Treg)分泌，有極強大的募集和激活嗜中性粒細胞的能力，能誘導活化T淋巴細胞和刺激巨噬細胞、成纖維細胞和上皮細胞產生多種細胞因子，如IL-1、IL- 6、TNF-α、金屬蛋白酶和化學增活素等[11]。此外，IL-17與TNF-α等炎癥因子具有協(xié)同作用，可以放大并加強其致炎效應[12]。IL-23主要是由活化的樹突狀細胞和巨噬細胞分泌，它可以誘導CD4+T淋巴細胞分化成Th17/Treg，同時促進Th17增殖并維持其存活[13-14]，此外其可促進IL-17的產生，且不需要γσ受體T淋巴細胞的參與[15]。因此，IL-23和IL-17通過Th17形成新的炎癥軸，在許多炎癥和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用，如類風濕性關節(jié)炎、實驗性自身免疫性腦脊髓炎和炎癥性腸病等[16]。Tian等[17]的研究表明，IL-17通過促進自身免疫炎癥、趨化作用和血管生成作用參與椎間盤突出癥的發(fā)生。Cauvi等[18]研究發(fā)現(xiàn)，過度刺激IL-23/IL-17通路可能對多菌性膿毒癥所致的肺部炎癥進展產生不利影響，而恢復IL-23和IL-17表達水平之間的平衡可能有刊于敗血癥的治療。

本研究建立了非壓迫性椎間盤髓核突出大鼠模型，檢測其血清中IL-17、IL-23的表達水平，結果顯示，實驗組大鼠術后1周、3這周時血清中IL-17、IL-23的表達水平均高于對照組，右后肢疼痛縮爪閾值均低于對照組(均P<0.05)；HE染色結果提示，實驗組大鼠術后1周、3周時，神經纖維排列不規(guī)律，大小不一，髓鞘崩解，呈空泡樣病變，炎癥細胞入侵，而對照組大鼠未見明顯異常。以上結果說明 IL-17、IL-23在椎間盤髓核突出早期所致的免疫炎癥反應發(fā)揮著重要作用。在椎間盤突出早期，隱蔽的髓核組織暴露在自身免疫系統(tǒng)中，可激活免疫反應，促使IL-17、IL-23的表達水平升高而引起免疫炎癥反應，從而損傷神經根，最終導致臨床癥狀的出現(xiàn)。本研究結果顯示，術后5周時，兩組大鼠的血清IL-23與IL-17的表達水平，以及右后肢疼痛縮爪閾值比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，且神經根HE染色提示實驗組大鼠神經根基本恢復正常，這可能是由于免疫系統(tǒng)具有負調控機制。

綜上所述，非壓迫性椎間盤髓核突出導致的神經根損傷大鼠模型血清中有IL-17、IL-23的表達水平增高，IL-23/IL-17炎癥軸在可能在根性神經根痛發(fā)病過程起關鍵作用，其可能成為椎間盤突出癥所致腰腿痛的一個新治療靶點。但本研究存在一定的局限性，如未檢測神經根中IL-17、IL-23的表達水平，也沒有進一步研究其他細胞因子(如IL-1、IL-6等)對非壓迫性椎間盤髓核突出導致的神經根損傷的影響，這些細胞因子在椎間盤突出癥發(fā)病過程的作用有待研究。