楊貝貝，康會茹

（1.石家莊科技信息職業(yè)學院，河北 石家莊 050091；2.韶關(guān)學院 英東食品學院，廣東 韶關(guān) 512005）

隨著消費者對健康飲食越來越關(guān)注，通過牛奶、谷物、水果和蔬菜發(fā)酵制備的益生菌食品正受到科學家和消費者的廣泛關(guān)注[1]。益生菌具有增加食物消化能力，調(diào)節(jié)胃腸道菌落，改善胃腸道功能等多種功能和優(yōu)點。目前，含有益生菌的發(fā)酵乳制品已經(jīng)大量投入市場，最常使用的益生菌有保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和乳雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis）等，其中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌是較為常用的2種益生菌，常作為乳制品發(fā)酵劑[2]。

黑棗含有豐富的營養(yǎng)成分，是研制多種食品、飲料及保健品的理想原料。黑棗果實含有多種維生素、糖分、蛋白質(zhì)及大量游離的氨基酸，并含有豐富的多酚和花色苷等生物活性物質(zhì)[3-5]。近年來，含有植物基質(zhì)及水果的新型酸奶在乳制品市場備受歡迎。李雅乾等[6]開發(fā)了多菌種混合發(fā)酵胡蘿卜牛乳飲料的新工藝。鄭鳳錦等[7]對香蕉酸奶的發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化，并探究了產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)特征。吳倩等[8]發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌與嗜熱鏈球菌及保加利亞乳桿菌聯(lián)合發(fā)酵可增加菌落總數(shù)和胞外多糖含量，從而確定這些益生菌存在互利共生關(guān)系。但是并不是所有的益生菌之間都是共生關(guān)系，也有些菌株表現(xiàn)為相互拮抗[9]。由于不同益生菌組合的相互作用關(guān)系仍不明確，因此需要通過實驗來驗證。酸奶的理化特征是消費者接受的重要因素之一，可以通過添加一些成分來提高酸奶的理化特征，而黑棗就是一種有益的原料，目前還未有黑棗酸奶的相關(guān)研究，尤其是不同益生菌組合對酸奶的營養(yǎng)、發(fā)酵和質(zhì)構(gòu)特性的影響尚不明確。本研究的主要目的是用不同益生菌組合制備黑棗酸奶，并探究不同益生菌組合對酸奶發(fā)酵特性和質(zhì)構(gòu)特性的影響，為黑棗酸奶的生產(chǎn)工藝優(yōu)化及品質(zhì)改善提供理論參考，為益生菌菌種組合的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑棗、純牛奶、酸奶發(fā)酵劑（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）：市售；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和乳雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis）：上海潤盈生物工程有限公司。

MRS培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司；苯酚、氫氧化鈉、濃硫酸等（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ZSH-150型生化培養(yǎng)箱：上海喆圖科學儀器有限公司；UV1800型紫外可見光分光光度計：日本島津公司；FE28型pH計：瑞士Mettler-Toledo公司；TA.XTC-18型質(zhì)構(gòu)儀：上海保圣實業(yè)發(fā)酵有限公司；NDJ-1型旋轉(zhuǎn)黏度計：上海衡平儀器儀表廠；CM-800a型折光儀：日本ATAGO公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌懸液制備

將嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌和乳雙歧桿菌的菌粉分別置于MRS肉體培養(yǎng)基中進行活化復壯，活化復壯后再在MRS肉湯培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24 h，然后4 500 r/min離心15 min，用無菌生理鹽水清洗沉淀菌落，進而將其溶于蒸餾水中，配制成活菌數(shù)為2.5×108CFU/mL左右的菌懸液。

1.3.2 黑棗酸奶的制備

將黑棗去核后加入黑棗質(zhì)量2倍的純水，置于破壁機中進行打漿，加入0.3%抗壞血酸和0.4%檸檬酸護色，5 000 r/min離心15 min，即得黑棗汁[10]。將黑棗汁的pH值調(diào)至6.00，向純牛奶中加入質(zhì)量比為15%的黑棗汁和7%的蔗糖，加熱煮沸15 min，移入100 mL酸奶瓶，冷卻后，分別接入酸奶發(fā)酵劑（接種量為7.11 lg CFU/mL左右）和不同組合益生菌（接種量為7.24 lg CFU/mL左右），混勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h[8]。

1.3.3 試驗設置

設置8種不同的發(fā)酵劑分別為接種酸奶發(fā)酵劑（C）；強化乳雙歧桿菌發(fā)酵劑（C+BL）；強化嗜酸乳桿菌發(fā)酵劑（C+LA）；強化植物乳桿菌發(fā)酵劑（C+LP）；強化乳雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌發(fā)酵劑（C+BL+LA，乳雙歧桿菌∶嗜酸乳桿菌為1∶1）；強化乳雙歧桿菌和植物乳桿菌發(fā)酵劑（C+BL+LP，乳雙歧桿菌∶植物乳桿菌為1∶1）；強化嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌發(fā)酵劑（C+LA+LP，嗜酸乳桿菌∶植物乳桿菌為1∶1）；強化乳雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌發(fā)酵劑（C+BL+LA+LP，乳雙歧桿菌∶嗜酸乳桿菌∶植物乳桿菌為1∶1∶1）。

1.3.4 黑棗酸奶的理化指標測定

pH的測定：采用pH計直接測定；可滴定酸度的測定：使用滴定法測定[11]；可溶性固形物的測定：采用折光儀法測定[12]。

持水力的測定：采用重量示差法測定持水力[13]。稱取20 g發(fā)酵樣品（Y），5 000 r/min離心30 min，收集上清液并稱重（S）。持水力的計算公式為：持水力=（Y-W）/Y×100%。

表觀黏度的測定：使用旋轉(zhuǎn)黏度計測定黏度。將樣品放入不銹鋼量筒中，轉(zhuǎn)子浸入樣品，以600 r/min的轉(zhuǎn)速進行測量，即得到黏度讀數(shù)。

胞外多糖的測定：取適量的發(fā)酵樣品與500 μL三氯乙酸（40%）混合，置于-20 ℃冰箱放置10 min，隨后4 ℃靜置1 h，12 000 r/min離心5 min，上清液與1 mL已預冷的無水乙醇混合，4 ℃過夜，12 000 r/min離心5 min收集多糖沉淀，用已預冷的體積分數(shù)75%乙醇清洗兩遍[8]。將提取得到的胞外多糖用蒸餾水溶解，采用苯酚-硫酸法測定胞外多糖含量，以葡萄糖計[14]。

益生菌菌落總數(shù)的測定：使用平板涂布法測定益生菌菌落總數(shù)[15]。

質(zhì)構(gòu)的測定：利用質(zhì)構(gòu)儀測定發(fā)酵樣品的物理特性。將發(fā)酵樣品置于4℃過夜，待其恢復至室溫后進行質(zhì)構(gòu)測定。質(zhì)構(gòu)儀參數(shù)：探頭為P50探頭，距離為10 mm，觸發(fā)點為5 g，測前速度為1 mm/s，測中速度為1 mm/s，測后速度為5 mm/s，測試模式為TPA[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同益生菌組合對黑棗酸奶pH和可滴定酸度的影響

不同益生菌組合對黑棗酸奶pH的影響見圖1A。由圖1A可知，C組發(fā)酵樣品的pH為4.52，顯著高于其他益生菌組合發(fā)酵的樣品（P＜0.05）。C+BL、C+LP和C+BL+LP組合發(fā)酵樣品的pH無顯著差異（P＞0.05），其pH在4.44～4.47之間，表明強化乳雙歧桿菌和植物乳桿菌可降低酸奶的pH。此外，相比C+BL和C+BL+LP的益生菌組合，C+LA組合可顯著降低（P＜0.05）酸奶中的pH，其pH為4.39，表明嗜酸乳桿菌的在酸奶發(fā)酵中具有較強產(chǎn)酸能力，使用嗜酸乳桿菌結(jié)合保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵可增加酸度。C+LA+BL組合發(fā)酵酸奶具有最低的pH，其pH為4.33；而C+LA+BL+LP組合發(fā)酵酸奶的pH為4.36。上述結(jié)果說明乳雙歧桿菌的強化可能會促進嗜酸乳桿菌的產(chǎn)酸，而植物乳桿菌的加入會抑制嗜酸乳桿菌的生長代謝。在酸奶發(fā)酵劑中強化乳雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌會顯著降低發(fā)酵酸奶的pH[16]。

可滴定酸度可以有效的反映樣品中可電離的全部氫離子的含量，因此測定可滴定酸度可更好的揭示不同益生菌組合發(fā)酵酸奶的產(chǎn)酸情況，不同益生菌組合對黑棗酸奶可滴定酸度的影響見圖1B。由圖1B可知，可滴定酸度的結(jié)果與pH變化正好相反。C組發(fā)酵樣品的可滴定酸度顯著低于其他益生菌組合發(fā)酵的樣品（P＜0.05），其可滴定酸度為71°T。C+LA+BL組合發(fā)酵酸奶具有最高的可滴定酸度，其可滴定酸度為113°T。C+LA+BL+LP組合發(fā)酵酸奶的可滴定酸度為104°T，說明多菌株混合發(fā)酵具有比傳統(tǒng)酸奶發(fā)酵劑發(fā)酵更好的產(chǎn)酸能力，從而增加產(chǎn)品的口感[17]。

圖1 不同益生菌組合對黑棗酸奶pH值（A）及可滴定酸度（B）的影響Fig.1 Effect of different combinations of probiotics on pH value (A) and titration acidity (B) of black date yogurt

2.2 不同益生菌組合對黑棗酸奶可溶性固形物的影響

不同益生菌組合對黑棗酸奶可溶性固形物的影響見圖2。

圖2 不同益生菌組合對黑棗酸奶可溶性固形物的影響Fig.2 Effect of different combinations of probiotics on soluble solids content of black date yogurt

由圖2可知，相比C組發(fā)酵的樣品，C+BL、C+LA及C+LA+BL組合發(fā)酵樣品中可溶性固形物含量顯著降低（P＜0.05），分別降低了14.16%、15.30%和8.92%；而C+LP和C+BL+LP組合卻可以顯著提高發(fā)酵樣品中可溶性固形物含量（P＜0.05），分別提高了13.50%和6.87%。該結(jié)果表明強化嗜酸乳桿菌和乳雙歧桿菌及兩者的混合物均會改變產(chǎn)品的理化特性，而強化植物乳桿菌則會顯著改善產(chǎn)品的理化特性。保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌協(xié)同發(fā)酵酸奶中可溶性固形物含量會顯著高于嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌屬協(xié)同發(fā)酵酸奶[18]。此外，C+LA+BL+LP組合發(fā)酵樣品中可溶性固形物含量可達12.69%，略高于C組發(fā)酵樣品。多菌株混合發(fā)酵（含有植物乳桿菌）具有比嗜酸乳桿菌和動物雙歧桿菌組合發(fā)酵更高的可溶性固形物含量[19]。

2.3 不同益生菌組合對黑棗酸奶持水力的影響

不同益生菌組合對黑棗酸奶持水力的影響見圖3。由圖3可知，C組發(fā)酵樣品的持水力為87.24%，而C+LP組合卻可以顯著提高發(fā)酵樣品的持水力（P＜0.05），可提高6.95%，說明強化植物乳桿菌可增加與水結(jié)合的能力，從而獲得更高持水力的產(chǎn)品。C+BL和C+LA組合均會顯著降低（P＜0.05）發(fā)酵樣品的持水力，可能是乳雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌均具有較強產(chǎn)酸能力，加速酸奶的酸化，使保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌生長代謝受到抑制。此外，多株益生菌的復合強化對發(fā)酵樣品持水力的影響也存在差異，只有C+BL+LP和C+LA+BL+LP組合會增加發(fā)酵樣品的持水力，其持水力分別為92.62%和91.38%，表明多菌株協(xié)同發(fā)酵必然會存在益生菌之間的互利共生及拮抗競爭關(guān)系，而植物乳桿菌的加入會減弱乳雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌對保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌的生長抑制作用。酸奶持水力與可溶性固形物含量呈正相關(guān)，持水力越高說明體系中的大分子可以通過較強的親水作用力結(jié)合更多的水分子，而結(jié)合水含量越高，產(chǎn)品的穩(wěn)定性也越好[20]。

圖3 不同益生菌組合對黑棗酸奶持水力的影響Fig.3 Effect of different combinations of probiotics on water holding capacity of black date yogurt

2.4 不同益生菌組合對黑棗酸奶黏度的影響

黏度是決定酸奶品質(zhì)重要的指標之一，黏度高的酸奶不僅可以增強酸奶的口感，還可以減少增稠劑的使用。不同益生菌組合對黑棗酸奶黏度的影響見圖4，由圖4可知，C+LP組合的黏度最高，可達902 mPa·s，C、C+BL+LP、C+LA+LP及C+LA+BL+LP組合的黏度無顯著性差異（P＞0.05）。相比C組發(fā)酵的樣品，C+BL和C+LA組合均會顯著降低（P＜0.05）發(fā)酵樣品的黏度，分別降低了8.66%和20.05%，說明乳雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的加入可能會抑制保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌的生長代謝，改變產(chǎn)品的黏度。有文獻表明酸奶的黏度與胞外多糖含量呈正相關(guān)。酸羊奶的發(fā)酵原料添加杏仁粉和菊粉可顯著增加酸羊奶的黏度，并增加酸羊奶的口感及風味[21-22]。

圖4 不同益生菌組合對黑棗酸奶黏度的影響Fig.4 Effect of different combinations of probiotics on viscosity of black date yogurt

2.5 不同益生菌組合對黑棗酸奶胞外多糖的影響

胞外多糖是益生菌在生長代謝過程中分泌至細胞外的一類多糖類化合物的總稱，也是表征酸奶品質(zhì)的指標之一。不同益生菌組合對黑棗酸奶胞外多糖的影響見圖5。

圖5 不同益生菌組合對黑棗酸奶胞外多糖含量的影響Fig.5 Effect of different combinations of probiotics on extracellular polysaccharides content of black date yogurt

由圖5可知，不同益生菌組合發(fā)酵所產(chǎn)的胞外多糖含量存在顯著差異（P＜0.05）。C組發(fā)酵樣品的胞外多糖含量為8.47 g/L，是C+BL和C+LA組合發(fā)酵樣品的1.23倍和1.61倍。該結(jié)果也進一步說明乳雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的強化會抑制胞外多糖的生成，影響酸奶的黏度。此外，相比C組發(fā)酵的樣品，C+LP、C+BL+LP和C+LA+BL+LP組合均會顯著增加（P＜0.05）發(fā)酵樣品中胞外多糖含量，分別增加了41.44%、27.15%和12.63%。該結(jié)果與吳倩等[8]的研究結(jié)果相似，其發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌混合保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌聯(lián)合發(fā)酵，可以顯著提高胞外多糖的產(chǎn)生量。胞外多糖含量與可溶性固形物和黏度呈正相關(guān)，胞外多糖可增加乳制品的黏度、穩(wěn)定性及保水性，使乳制品具有良好的質(zhì)地、口感和風味[23]。

2.6 不同益生菌組合對黑棗酸奶乳酸菌總數(shù)的影響

良好的生長能力是益生菌發(fā)酵的先決條件。不同益生菌組合對黑棗酸奶乳酸菌總數(shù)的影響見圖6，由圖6可知，不同益生菌組合發(fā)酵樣品中乳酸菌總數(shù)同樣也存在顯著差異（P＜0.05）。多株益生菌的復合強化發(fā)酵樣品的乳酸菌總數(shù)顯著高于酸奶發(fā)酵劑和強化單株及兩株益生菌組合的發(fā)酵（P＜0.05），其乳酸菌菌落總數(shù)可達9.63 lg CFU/mL，是C組的6.92倍、單菌強化組的4.78倍和雙菌強化組的1.58倍，這是由于菌株間的相互作用關(guān)系促進樣品中益生菌活菌數(shù)的增加。同時，C+LP和C+BL+LP組合的乳酸菌總數(shù)也顯著高于酸奶發(fā)酵劑組（P＜0.05），這可能與強化植物乳桿菌可以增加發(fā)酵樣品中胞外多糖有關(guān)，胞外多糖有利于益生菌的增殖，改善酸奶的組織形態(tài)，增加酸奶的營養(yǎng)價值[24]。酸奶中乳酸菌活菌數(shù)大于6.00 lg CFU/mL才能使乳酸菌在人體腸道中定植，從而發(fā)揮其益生功效[8]。

圖6 不同益生菌組合對黑棗酸奶乳酸菌總數(shù)的影響Fig.6 Effect of different combinations of probiotics on the total number of colonies of black date yogurt

2.7 不同益生菌組合對黑棗酸奶質(zhì)構(gòu)的影響

酸奶的質(zhì)構(gòu)特性是評價酸奶品質(zhì)的主要指標之一。不同益生菌組合對黑棗酸奶質(zhì)構(gòu)的影響見表1，根據(jù)表1可知，不同益生菌組合發(fā)酵樣品的流變特性存在顯著差異（P＜0.05），其C+LA組合發(fā)酵樣品具有最高的硬度及最低的彈性、內(nèi)聚性和回復性，而C+LP組合發(fā)酵樣品則相反。C+LA+BL+LP組合發(fā)酵樣品的硬度值為151.24 g，比酸奶發(fā)酵劑組降低了10.26%（P＜0.05）；而C+LA+BL+LP組合發(fā)酵樣品的彈性、內(nèi)聚性和回復性分別為1.04 mm、0.96 g·s和0.28，比酸奶發(fā)酵劑組分別提高了9.47%、9.09%和3.70%。該結(jié)果與SETYAWARDANI T等[17]的研究結(jié)果相一致，其發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌混合發(fā)酵制備的奶酪具有比單一菌株更好的質(zhì)地。此外，酸奶的彈性、內(nèi)聚性和回復性與胞外多糖呈正相關(guān)，而硬度與胞外多糖則呈負相關(guān)。胞外多糖的存在可增強酪蛋白大分子的結(jié)合能力，形成致密且穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，降低酸奶的硬度，提高體系的凝膠能力，從而增強酸奶的彈性、內(nèi)聚性及回復性[25-26]。

表1 不同益生菌組合對黑棗酸奶質(zhì)構(gòu)的影響Table 1 Effect of different combinations of probiotics on the texture of black date yogurt

3 結(jié)論

本研究探究了不同益生菌組合對黑棗酸奶的發(fā)酵和質(zhì)構(gòu)特性的影響。研究發(fā)現(xiàn)，不同益生菌組合會顯著影響黑棗酸奶的理化、營養(yǎng)和質(zhì)構(gòu)特性。盡管嗜酸乳桿菌結(jié)合保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵的黑棗酸奶具有最高的可滴定酸度和最低的pH；植物乳桿菌結(jié)合保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵的黑棗酸奶具有最高的持水力、可溶性固形物含量、黏度、胞外多糖含量、彈性、內(nèi)聚性和回復性及最低的硬度。但是，綜合所有結(jié)果，發(fā)現(xiàn)強化植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和乳雙歧桿菌發(fā)酵的黑棗酸奶具有更適宜的理化、營養(yǎng)及質(zhì)構(gòu)特性，有利于黑棗酸奶的貯藏，且乳酸菌活菌數(shù)最高，更有利于益生菌在人體腸道中存活并發(fā)揮對人體的保健作用。因此，多種益生菌混合發(fā)酵會改善黑棗酸奶的質(zhì)地和品質(zhì)及更優(yōu)良的益生潛能。本研究有助于乳制品行業(yè)開發(fā)新的益生菌產(chǎn)品，并為益生菌菌種組合的選擇提供依據(jù)。