于浩洋，李顏巖，馮靜，華正罡

(遼寧省疾病預(yù)防控制中心，沈陽 110005)

隨著生活節(jié)奏日益加快、競爭日益加劇，越來越多的人產(chǎn)生焦慮障礙，從而給當(dāng)今人類的身心健康造成嚴重威脅。焦慮是人們生活中產(chǎn)生的一種正常的生理反應(yīng)，而焦慮、緊張過度或出現(xiàn)某些病理性焦慮時稱為焦慮障礙。焦慮障礙會使患者的生活質(zhì)量和社會功能下降，還會引發(fā)軀體功能障礙，導(dǎo)致其它疾病的發(fā)病率升高［1］。其中焦慮和失眠是較為常見的癥狀，也是各型神經(jīng)癥的中心癥狀。鎮(zhèn)靜催眠藥是一類中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制藥，第1 代鎮(zhèn)靜催眠藥為巴比妥類藥，其不良反應(yīng)大，抑制呼吸，過量可致死，治療安全范圍小，易蓄積中毒，有明顯潛在的成癮性。目前臨床應(yīng)用廣泛的是第2 代鎮(zhèn)靜催眠類藥物［2］，其具有較強的多巴胺受體和5-羥色胺受體阻斷作用［3］，主要包括氯氮平、氟哌定醇、氟奮乃靜、丙咪嗪等。氯氮平為二苯二氮卓類抗精神病藥，是一種新型廣譜抗精神病藥物，對腦內(nèi)5-羥色胺(5-HT2A)受體和多巴胺(DA1)受體的阻滯作用較強，吸收迅速；氟哌啶醇是一種典型丁酰苯類抗精神分裂藥，有較強的多巴胺受體拮抗作用，主要用于多種急、慢性精神分裂癥、躁狂癥、抽動穢語綜合癥［4］；鹽酸氟奮乃靜屬于吩噻嗪類藥物，具有較強的抗精神病作用和輕度的鎮(zhèn)靜作用；丙咪嗪為三環(huán)類抗抑郁藥，有較強的抗抑郁作用。

適量服用鎮(zhèn)靜催眠類藥物可改善患者焦慮障礙癥狀和生活質(zhì)量，服用過量則會引起嚴重的椎體外系癥狀（EPSs）［5］。近年來因該藥物服用過量引起的急性中毒事件發(fā)生率很高［6］。中毒程度與藥物種類、血藥濃度密切相關(guān)，迅速定性、定量檢測中毒患者的血藥濃度對臨床搶救具有重大意義［7–9］。

目前測定鎮(zhèn)靜催眠類藥物的方法主要有高效液相色譜（HPLC）法［10–12］、氣相色譜–質(zhì)譜（GC–MS）法［13–14］以及液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜（LC–MS／MS）法［15–16］。HPLC 法的靈敏度和特異性相對較低，無法適應(yīng)高靈敏度要求的中毒樣本血藥濃度檢測；GC–MS 法不適合檢測難揮發(fā)、熱穩(wěn)定性差的鎮(zhèn)靜催眠藥；LC–MS／MS 法的多通道檢測可一次性檢測多種化合物且無干擾，可縮短分析時間，靈敏度比GC–MS 法高。目前大多數(shù)高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法的前處理采用液液萃取或固相萃取等方式，操作繁瑣，耗時長，樣本用量大，無法適應(yīng)中毒樣本快速定性定量的要求。筆者建立一種以乙腈沉淀蛋白的HPLC–MS／MS 法同時測定人血清中氯氮平、氟哌啶醇、氟奮乃靜和丙咪嗪的濃度，操作簡單，可快速測定已中毒患者的血藥濃度。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜儀：Acquity Xevo TQ 型，美國沃特世公司。

渦旋振蕩器：Lab Dancer 型，德國艾卡公司。

高速冷凍離心機：Thermo ST16R 型，美國賽默飛世爾公司。

氯氮平標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度不小于99.6%，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號為CCHM701181，美國CATO 公司。

氟哌啶醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度不小于99%，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號為CDCT–C13801600，德國Dr. Ehrenstorfer公司。

鹽酸氟奮乃靜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度不小于99%，編號為CDCT–C14059400，德國Dr. Ehrenstorfer 公司。

丙咪嗪標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度不小于99%，編號為CDCT–C13402100，德國Dr. Ehrenstorfer 公司。

乙腈：色譜純，美國費希爾公司。

甲酸：優(yōu)級純，北京化工廠有限責(zé)任公司。

血清樣品來自于遼寧省疾病預(yù)防控制中心。

實驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國沃特世公司）；柱溫：40℃；樣品室溫度：4 ℃；流動相：A 相為乙腈，B 相為0.05%甲酸溶液，流量為0.3 mL／min；梯度洗脫程序見表1；進樣體積：10 μL。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2 串聯(lián)質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI+）；毛細管電壓：2.64 kV；離子源溫度：350℃；脫溶劑氣流量：650 L／min；4 種鎮(zhèn)靜催眠類藥物質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 4 種鎮(zhèn)靜催眠類藥物的質(zhì)譜參數(shù)

1.3 樣品預(yù)處理

移取100 μL 血清樣品于3 mL 離心管中，加入300 μL 乙腈，震蕩渦旋3 min，以15 000 r／min 離心15 min，取上清液250 μL，加入250 μL 水，渦旋均勻，過0.22 μm 濾膜，待測。

1.4 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：分別準(zhǔn)確稱取4 種鎮(zhèn)靜催眠藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用乙腈溶解，配制成鹽酸氟奮乃靜、氟哌啶醇、氯氮平、丙咪嗪的質(zhì)量濃度分別為0.732、0.802、1.115、0.888 8 mg／mL 的4 種鎮(zhèn)靜催眠藥的單一標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別移取適量4 種鎮(zhèn)靜催眠藥標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于10 mL 容瓶中，用乙腈定容至標(biāo)線，配制成鹽酸氟奮乃靜、氟哌啶醇、氯氮平、丙咪嗪的質(zhì)量濃度分別為0.55、1.20、31.36、35.55 μg／mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于–20℃下保存。

系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別吸取適量混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于適量乙腈中，配制成系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于–20℃下保存，4 種鎮(zhèn)靜催眠藥的質(zhì)量濃度見表3。

表3 系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中各化合物的質(zhì)量濃度μg／mL

基質(zhì)系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確吸取90 μL 血清，分別加入10 μL 系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，得4種鎮(zhèn)靜催眠藥的質(zhì)量濃度見表4，按1.3 處理后得基質(zhì)系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

表4 基質(zhì)系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中各化合物的質(zhì)量濃度ng／mL

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

4 種鎮(zhèn)靜劑均屬于含有氮原子的堿性化合物，適用于ESI 正離子模式掃描，可獲得豐度較高的［M+H］+母離子，采用離子掃描方式選擇響應(yīng)最大的兩個碎片作為子離子，確定定量離子對和定性離子對，并對碰撞能量等質(zhì)譜條件進行優(yōu)化。優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.2 色譜條件優(yōu)化

4 種化合物均采用正離子模式進行掃描，在流動相中加入適量甲酸有利于化合物的電離，可提高離子響應(yīng)。分別考察0.05%、0.1%、0.15%甲酸溶液對測定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，在上述3 種濃度甲酸溶液下4 種化合物的峰形與響應(yīng)值均未見顯著性差異，最終選擇0.05%甲酸溶液作為流動相。

當(dāng)樣品溶液的溶劑強度高于流動相溶劑強度時，易造成峰展寬、峰分叉現(xiàn)象。采用乙腈提取血清樣品，按照乙腈與水體積比為1∶1 加入水，混勻后進樣測定，可有效防止溶劑效應(yīng)、改善峰形以及提高響應(yīng)值。

2.3 前處理條件優(yōu)化

蛋白質(zhì)沉淀是一種較為常用的樣本前處理方法，能防止色譜分析過程中色譜柱的堵塞和質(zhì)譜分析過程中的離子源污染。分別采用乙腈、乙醚、二氯甲烷沉淀血清中蛋白質(zhì)。由于乙醚與二氯甲烷不可作為溶劑直接上機進樣，因此采用乙醚和二氯甲烷沉淀蛋白后，分別于40 ℃水浴氮氣吹干，用乙腈–水（1+1）溶液復(fù)溶后進樣。試驗結(jié)果表明，采用二氯甲烷沉淀蛋白的回收率低于乙腈與乙醚，用乙醚沉淀時需要氮氣吹干再復(fù)溶，操作繁瑣，與急性中毒患者快速定性、定量的訴求相悖，因此最終選擇乙腈沉淀蛋白。

2.4 線性范圍的設(shè)定

根據(jù)各藥物有效血藥濃度設(shè)定其線性范圍。根據(jù)神經(jīng)精神藥理學(xué)與藥物精神病學(xué)協(xié)會（AGNP）治療藥物監(jiān)測（TDM）專家組指導(dǎo)方案，推薦氯氮平的有效濃度為350～600 μg／L［17］；于欣等［18］通過對既往有關(guān)氟哌啶醇治療精神分裂癥濃度–效應(yīng)分析，提出氟哌啶醇治療精神分裂癥合宜的血藥濃度為2.7～22.7 μg／L；鹽酸氟奮乃靜血藥濃度參考值范圍為0.6～2.4 μg／L［19］；丙咪嗪為三環(huán)類抗抑郁藥，一般認為各三環(huán)類抗抑郁藥的中毒濃度均不低于500 μg／L［20］。線性范圍包含有效血藥濃度范圍，線性范圍最高濃度包含實驗室警戒濃度，最終設(shè)定氯氮平為26.1～1 045.3 μg／L、氟哌啶醇為1.0～40.1 μg／L、鹽酸氟奮乃靜為0.5～18.3 μg／L、丙咪嗪為29.6～1 185.1 μg／L。

2.5 線性方程和檢出限

在1.2 儀器條件下，測定1.4 配制的基質(zhì)系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以待測化合物的色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。以3 倍信噪比對應(yīng)的濃度作為方法檢出限。4 種鎮(zhèn)靜催眠類藥物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表5。

表5 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

由表5 可知，4 種鎮(zhèn)靜催眠類藥物在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均均大于0.995，氯氮平、氟哌啶醇、丙咪嗪的檢出限為0.03 μg／L，氟奮乃靜的檢出限為0.06 μg／L。

2.6 加標(biāo)回收和精密度試驗

準(zhǔn)確吸取18 份混合均勻的空白血清樣品90 μL 作為本底，每6 份為1 組共3 組，分別進行低、中、高3 個濃度水平的加標(biāo)回收試驗，試驗數(shù)據(jù)見表6 所示。

表6 加標(biāo)回收和精密度試驗結(jié)果

由表6 可知，4 種化合物測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～8.9%，加標(biāo)樣品的平均回收率為90.7%～111.9%，說明該法精密度和準(zhǔn)確度良好。

3 結(jié)語

建立了一種HPLC–MS／MS 法測定人血清中4種鎮(zhèn)靜催眠類藥物濃度。采用乙腈蛋白沉淀處理樣品，簡單易行。該法的靈敏度、回收率滿足生物樣本的分析要求，本法可實現(xiàn)急性中毒樣本的快速檢測。