李岳，張憲

（北京市藥品檢驗所中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室，北京 102206）

桔貝合劑是臨床上常用于治療呼吸道感染引起的小兒支氣管炎、小兒病毒性肺炎的中成藥［1–4］，具有較好的潤肺止咳功效，且效果明顯。桔貝合劑是由桔梗、浙貝母、苦杏仁、麥冬、黃芩、枇杷葉和甘草組成［5–6］，在生產(chǎn)過程中通常加入苯甲酸鈉作為防腐劑。苯甲酸鈉［7］是藥品和食品中一種常用的防腐劑，當pH 值范圍為2.5～4.0 時，其防腐效果最佳；當pH 值大于5.0 時，即使?jié)舛仍黾?，其防腐效果也不理想。標準方法?］中規(guī)定桔貝合劑pH 值范圍為4.5～5.5，因此其防腐能力不佳，部分生產(chǎn)企業(yè)為了延長藥品的保質(zhì)期、防止霉變，可能還會使用其它防腐能力較好的防腐劑，如山梨酸鉀、對羥基苯甲酸酯類（對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯）。

苯甲酸鈉添加過量會影響人體對鈣的吸收以及損害神經(jīng)系統(tǒng)。部分國家禁止使用苯甲酸鈉，我國允許在醬菜類、果菜類和罐頭類等食品中使用［9］，規(guī)定其限度不得超過0.2%（以苯甲酸計）。對羥基苯甲酸酯類［8］又稱為尼泊金酯，是一類高效的殺菌防腐劑，具有抗菌能力強、pH 適用范圍廣、用量少等優(yōu)點，但過量使用會導致接觸性皮炎；對羥基苯甲酸酯類在化妝品領(lǐng)域的使用較多，經(jīng)過美國FDA 批準，其限量為不超過0.4%。我國在標準GB 2760–2011 中規(guī)定，其在醬及醬制品中最大使用量為0.25 g／kg（以對羥基苯甲酸計）。國家藥典中規(guī)定藥品中山梨酸鉀、苯甲酸均不得超過0.3%，羥苯酯類不得超過0.05%［10］。盡管對羥基苯甲酸酯類在化妝品、食品中可以使用，但由于桔貝合劑是兒科用藥，兒童身體各種器官免疫相對較弱，為了提高臨床療效和藥品安全性，建議不使用對羥基苯甲酸酯類防腐劑，同時應(yīng)加大對防腐劑的檢查。因此準確測定桔貝合劑中防腐劑十分必要。

目前上述防腐劑的測定方法主要有紫外法［11］、紅外法［12］、液相色譜法［13］和氣相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用法［14–15］。中成藥顏色較深會干擾紫外法測定；紅外法定量差；液相色譜法的分析速度慢，檢驗周期長；氣相色譜–質(zhì)譜法儀器成本高，不易普及。超高效液相色譜是目前分離速度較快的液相色譜，可節(jié)省溶劑且縮短篩查時間，目前尚無該方法對桔貝合劑中防腐劑的篩查報道。筆者建立超高效液相色譜法快速篩查桔貝合劑中苯甲酸鈉等6 種防腐劑，以期為該用藥安全性提供必要保證。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜儀：Waters UPLC H–Class 型，配有DAD 檢測器，二元高壓洗脫泵，全自動進樣器，美國waters 儀器公司。

電子天平：XPE204 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒托利多公司。

桔貝合劑：10 mL／支，批號分別為180909、181009，181021、1805052、1805035、1806042、1806043、190104、191205、191214，江西誠志永豐藥業(yè)有限責任公司。

甲醇：色譜純，美國Fisher 試劑公司。

磷酸二氫鉀：優(yōu)級純，國藥化學試劑公司。

實驗所用其它試劑均為分析純。

實驗用水：超純水，由美國密理博超純水機制得。

6 種防腐劑對照品：苯甲酸鈉、山梨酸鉀、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯的含量和批號見表1，均購于中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用。

表1 6 種防腐劑含量和批號

1.2 儀器工作條件

色 譜 柱：Waters UPLC ACQUITY BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國waters 公司）；柱溫：35 ℃；流動相：A 相為甲醇，B 相為0.02 mol／L磷酸二氫鉀水溶液（pH 調(diào)至3.5），梯度洗脫程序見表2；流量：0.4 mL／min；進樣體積：10 μL。

表2 梯度洗脫程序

1.3 溶液制備

1.3.1 對照品溶液

對照品混合溶液：精密稱取對羥基苯甲酸甲酯10.32 mg、對羥基苯甲酸乙酯10.15 mg、對羥基苯甲酸丙酯10.28 mg、對羥基苯甲酸丁酯10.07 mg 置于同一25 mL 容量瓶中，加入50%甲醇溶解并稀釋至標線，作為羥苯酯類混合對照品儲備溶液；精密稱取苯甲酸10.26 mg、山梨酸鉀13.52 mg 置于同一20 mL 容量瓶中，再精密加入5 mL 上述羥苯酯類混合對照品儲備溶液，用50%甲醇溶解并稀釋至標線，配制成苯甲酸鈉、山梨酸鉀、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯質(zhì)量濃度分別為513、676、103.2、101.5、102.8、100.7 μg／mL 的對照品混合溶液。

對照品系列混合工作溶液：分別精密吸取0.1、0.2、1、3 mL 對照品混合溶液于4 只10 mL 容量瓶中，用50%甲醇溶解稀釋，與上述對照品混合溶液作為1#～5#對照品系列混合工作溶液，其中6 種防腐劑質(zhì)量濃度見表3。

表3 對照品系列混合標準工作溶液 μg／mL

1.3.2 供試品溶液

精密吸取2 mL 桔貝合劑樣品溶液（批號為180909）于50 mL 容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至標線，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.3.3 陰性樣品溶液

按照桔貝合劑處方工藝和處方量，制備未加苯甲酸鈉防腐劑的樣品，作為缺苯甲酸鈉的陰性樣品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

參考食品國家標準和相關(guān)文獻對液相系統(tǒng)進行考察，分別采乙腈–0.1%磷酸、甲醇–0.1%磷酸和甲醇–0.02 mol／L 磷酸二氫鉀作為流動相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇–0.02 mol／L 磷酸二氫鉀作為流動相時各色譜峰峰形較好。由于苯甲酸、山梨酸均為較強有機酸，流動相的pH 值對其影響較大，酸性較低時其以酸形式存在，當pH 為中性時，其分別以鉀鹽、鈉鹽的形式存在。將磷酸二氫鉀水溶液的pH 分別調(diào)至2.5、3.5 和4.5，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當pH 值為3.5 時，各色譜峰峰形良好，色譜圖基線平穩(wěn)，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)高，故選擇甲醇–0.02 mol／L 磷酸二氫鉀（pH 值調(diào)至3.5）為流動相進行測定。

2.2 波長的選擇

采用二極管陣列檢測器對6 種防腐劑分別在190～300 nm 范圍進行掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苯甲酸分別在197、228 nm 處有最大吸收，山梨酸鉀在260 nm處有最大吸收，對羥基苯甲酸甲酯分別在198、254 nm 處有最大吸收，對羥基苯甲酸乙酯分別在196、255 nm 處有最大吸收，對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯均分別在197、255 nm 處有最大吸收，羥苯酯類均在末端具有最大吸收，但選用末端吸收干擾較大，不利于測定，因此選擇其次最大吸收波長進行測定；苯甲酸含量較高，綜合考慮選擇在228 nm波長下測定苯甲酸和山梨酸鉀。

2.3 專屬性考察

分別取適量1.3 中對照品溶液（A）、供試品溶液（B）、缺苯甲酸鈉的陰性樣品溶液（C），以及陽性檢出樣品溶液（D），在1.2 儀器工作條件下分別進樣測定，記錄色譜圖見圖1。由圖1 可知，陰性樣品對苯甲酸、山梨酸鉀、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯的測定無干擾，理論塔板數(shù)按苯甲酸峰計算應(yīng)不低于9 000，各色譜峰的分離度均大于1.5。

圖1 4 種溶液的色譜圖

2.4 標準工作曲線方程及檢出限

分別精密吸取對照品系列混合工作溶液，在1.2儀器工作條件下測定，以進樣質(zhì)量（x）為橫坐標，相對應(yīng)的色譜峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，以3 倍信噪比為檢出限。6 種防腐劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表4。由表4 可知，6 種防腐劑在各自的質(zhì)量范圍內(nèi)與色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限分別為0.002 7～0.042 0 μg／g。

表4 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.5 精密度試驗

取適量對照品混合溶液，在1.2 色譜條件下連續(xù)進樣6 次，試驗結(jié)果見表5。由表5 可知，6 種防腐劑測定結(jié)果的相對標準偏差為0.25%～0.82%，表明該方法的精密度良好。

表5 精密度試驗結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性試驗

取適量供試品溶液，分別在0、1、2、4、8、12、16、20、24 h 測定，進樣體積為10 μL，連續(xù)考察24 h，記錄各成分的色譜峰面積，試驗結(jié)果見表6。由表6可知，測定結(jié)果的相對標準偏差為0.64%～1.33%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表6 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.7 重復性試驗

精密吸取2 mL 桔貝合劑樣品溶液（批號為180909）于50 mL 容量瓶中，共吸取6 份，分別用50%甲醇溶解并稀釋至標線，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，在1.2 儀器工作條件下測定。試驗結(jié)果顯示，山梨酸鉀、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯均未檢出，苯甲酸的平均含量為2.512 6 mg／g，測定結(jié)果的相對標準偏差為0.15%（n=6），結(jié)果表明該方法的重復性良好。

2.8 加標回收試驗

精密稱取49.28 mg 苯甲酸、12.65 mg 山梨酸鉀、10.86 mg 對羥基苯甲酸甲酯、11.18 mg 對羥基苯甲酸乙酯、10.55 mg 對羥基苯甲酸丙酯和11.23 mg對羥基苯甲酸丁酯，置于同一20 mL 容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至標線，作為待加混合對照品溶液。精密量取已知含量的樣品1 mL 于50 mL 容量瓶中，制備6 份，分別加入上述待加混合對照品溶液各1 mL，用50%甲醇溶解并稀釋至標線，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液在1.2 儀器工作條件下測定，試驗結(jié)果見表7。由表7 可知，加標樣品的平均回收率均大于96.9%（RSD ＜2.0%），表明該方法具有較高的準確度，滿足分析要求。

表7 加標回收試驗結(jié)果

2.9 樣品測定

取10 個不同批號的桔貝合劑樣品，按照1.3.2方法將每批樣品平行制備3 份，在1.2 儀器工作條件下進行測定，以外標法分別計算各防腐劑的含量，測定結(jié)果見表8。由表8可知，10 個不同批號的桔貝合劑樣品中有一批樣品中添加有對羥基苯甲酸乙酯但含量遠遠低于限量要求，苯甲酸的含量也在限度范圍內(nèi)，整體質(zhì)量評價較好。

表8 樣品含量測定結(jié)果 mg／mL

3 結(jié)語

建立了超高效液相色譜法測定桔貝合劑中苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯的方法。所建方法操作簡單且分析速度快，可快速篩查桔貝合劑中防腐劑的含量，為評價桔貝合劑的安全性提供依據(jù)。