李岳，張憲

（北京市藥品檢驗(yàn)所中藥成分分析與生物評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

桔貝合劑是臨床上常用于治療呼吸道感染引起的小兒支氣管炎、小兒病毒性肺炎的中成藥［1–4］，具有較好的潤(rùn)肺止咳功效，且效果明顯。桔貝合劑是由桔梗、浙貝母、苦杏仁、麥冬、黃芩、枇杷葉和甘草組成［5–6］，在生產(chǎn)過程中通常加入苯甲酸鈉作為防腐劑。苯甲酸鈉［7］是藥品和食品中一種常用的防腐劑，當(dāng)pH 值范圍為2.5～4.0 時(shí)，其防腐效果最佳；當(dāng)pH 值大于5.0 時(shí)，即使?jié)舛仍黾?，其防腐效果也不理想。?biāo)準(zhǔn)方法［5］中規(guī)定桔貝合劑pH 值范圍為4.5～5.5，因此其防腐能力不佳，部分生產(chǎn)企業(yè)為了延長(zhǎng)藥品的保質(zhì)期、防止霉變，可能還會(huì)使用其它防腐能力較好的防腐劑，如山梨酸鉀、對(duì)羥基苯甲酸酯類（對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯）。

苯甲酸鈉添加過量會(huì)影響人體對(duì)鈣的吸收以及損害神經(jīng)系統(tǒng)。部分國(guó)家禁止使用苯甲酸鈉，我國(guó)允許在醬菜類、果菜類和罐頭類等食品中使用［9］，規(guī)定其限度不得超過0.2%（以苯甲酸計(jì)）。對(duì)羥基苯甲酸酯類［8］又稱為尼泊金酯，是一類高效的殺菌防腐劑，具有抗菌能力強(qiáng)、pH 適用范圍廣、用量少等優(yōu)點(diǎn)，但過量使用會(huì)導(dǎo)致接觸性皮炎；對(duì)羥基苯甲酸酯類在化妝品領(lǐng)域的使用較多，經(jīng)過美國(guó)FDA 批準(zhǔn)，其限量為不超過0.4%。我國(guó)在標(biāo)準(zhǔn)GB 2760–2011 中規(guī)定，其在醬及醬制品中最大使用量為0.25 g／kg（以對(duì)羥基苯甲酸計(jì)）。國(guó)家藥典中規(guī)定藥品中山梨酸鉀、苯甲酸均不得超過0.3%，羥苯酯類不得超過0.05%［10］。盡管對(duì)羥基苯甲酸酯類在化妝品、食品中可以使用，但由于桔貝合劑是兒科用藥，兒童身體各種器官免疫相對(duì)較弱，為了提高臨床療效和藥品安全性，建議不使用對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑，同時(shí)應(yīng)加大對(duì)防腐劑的檢查。因此準(zhǔn)確測(cè)定桔貝合劑中防腐劑十分必要。

目前上述防腐劑的測(cè)定方法主要有紫外法［11］、紅外法［12］、液相色譜法［13］和氣相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用法［14–15］。中成藥顏色較深會(huì)干擾紫外法測(cè)定；紅外法定量差；液相色譜法的分析速度慢，檢驗(yàn)周期長(zhǎng)；氣相色譜–質(zhì)譜法儀器成本高，不易普及。超高效液相色譜是目前分離速度較快的液相色譜，可節(jié)省溶劑且縮短篩查時(shí)間，目前尚無該方法對(duì)桔貝合劑中防腐劑的篩查報(bào)道。筆者建立超高效液相色譜法快速篩查桔貝合劑中苯甲酸鈉等6 種防腐劑，以期為該用藥安全性提供必要保證。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜儀：Waters UPLC H–Class 型，配有DAD 檢測(cè)器，二元高壓洗脫泵，全自動(dòng)進(jìn)樣器，美國(guó)waters 儀器公司。

電子天平：XPE204 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒托利多公司。

桔貝合劑：10 mL／支，批號(hào)分別為180909、181009，181021、1805052、1805035、1806042、1806043、190104、191205、191214，江西誠(chéng)志永豐藥業(yè)有限責(zé)任公司。

甲醇：色譜純，美國(guó)Fisher 試劑公司。

磷酸二氫鉀：優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥化學(xué)試劑公司。

實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)用水：超純水，由美國(guó)密理博超純水機(jī)制得。

6 種防腐劑對(duì)照品：苯甲酸鈉、山梨酸鉀、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、對(duì)羥基苯甲酸丁酯的含量和批號(hào)見表1，均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用。

表1 6 種防腐劑含量和批號(hào)

1.2 儀器工作條件

色 譜 柱：Waters UPLC ACQUITY BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國(guó)waters 公司）；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：A 相為甲醇，B 相為0.02 mol／L磷酸二氫鉀水溶液（pH 調(diào)至3.5），梯度洗脫程序見表2；流量：0.4 mL／min；進(jìn)樣體積：10 μL。

表2 梯度洗脫程序

1.3 溶液制備

1.3.1 對(duì)照品溶液

對(duì)照品混合溶液：精密稱取對(duì)羥基苯甲酸甲酯10.32 mg、對(duì)羥基苯甲酸乙酯10.15 mg、對(duì)羥基苯甲酸丙酯10.28 mg、對(duì)羥基苯甲酸丁酯10.07 mg 置于同一25 mL 容量瓶中，加入50%甲醇溶解并稀釋至標(biāo)線，作為羥苯酯類混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液；精密稱取苯甲酸10.26 mg、山梨酸鉀13.52 mg 置于同一20 mL 容量瓶中，再精密加入5 mL 上述羥苯酯類混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，用50%甲醇溶解并稀釋至標(biāo)線，配制成苯甲酸鈉、山梨酸鉀、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、對(duì)羥基苯甲酸丁酯質(zhì)量濃度分別為513、676、103.2、101.5、102.8、100.7 μg／mL 的對(duì)照品混合溶液。

對(duì)照品系列混合工作溶液：分別精密吸取0.1、0.2、1、3 mL 對(duì)照品混合溶液于4 只10 mL 容量瓶中，用50%甲醇溶解稀釋，與上述對(duì)照品混合溶液作為1#～5#對(duì)照品系列混合工作溶液，其中6 種防腐劑質(zhì)量濃度見表3。

表3 對(duì)照品系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 μg／mL

1.3.2 供試品溶液

精密吸取2 mL 桔貝合劑樣品溶液（批號(hào)為180909）于50 mL 容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至標(biāo)線，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.3.3 陰性樣品溶液

按照桔貝合劑處方工藝和處方量，制備未加苯甲酸鈉防腐劑的樣品，作為缺苯甲酸鈉的陰性樣品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

參考食品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)液相系統(tǒng)進(jìn)行考察，分別采乙腈–0.1%磷酸、甲醇–0.1%磷酸和甲醇–0.02 mol／L 磷酸二氫鉀作為流動(dòng)相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇–0.02 mol／L 磷酸二氫鉀作為流動(dòng)相時(shí)各色譜峰峰形較好。由于苯甲酸、山梨酸均為較強(qiáng)有機(jī)酸，流動(dòng)相的pH 值對(duì)其影響較大，酸性較低時(shí)其以酸形式存在，當(dāng)pH 為中性時(shí)，其分別以鉀鹽、鈉鹽的形式存在。將磷酸二氫鉀水溶液的pH 分別調(diào)至2.5、3.5 和4.5，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH 值為3.5 時(shí)，各色譜峰峰形良好，色譜圖基線平穩(wěn)，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)高，故選擇甲醇–0.02 mol／L 磷酸二氫鉀（pH 值調(diào)至3.5）為流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定。

2.2 波長(zhǎng)的選擇

采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)6 種防腐劑分別在190～300 nm 范圍進(jìn)行掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苯甲酸分別在197、228 nm 處有最大吸收，山梨酸鉀在260 nm處有最大吸收，對(duì)羥基苯甲酸甲酯分別在198、254 nm 處有最大吸收，對(duì)羥基苯甲酸乙酯分別在196、255 nm 處有最大吸收，對(duì)羥基苯甲酸丙酯、對(duì)羥基苯甲酸丁酯均分別在197、255 nm 處有最大吸收，羥苯酯類均在末端具有最大吸收，但選用末端吸收干擾較大，不利于測(cè)定，因此選擇其次最大吸收波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定；苯甲酸含量較高，綜合考慮選擇在228 nm波長(zhǎng)下測(cè)定苯甲酸和山梨酸鉀。

2.3 專屬性考察

分別取適量1.3 中對(duì)照品溶液（A）、供試品溶液（B）、缺苯甲酸鈉的陰性樣品溶液（C），以及陽性檢出樣品溶液（D），在1.2 儀器工作條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖見圖1。由圖1 可知，陰性樣品對(duì)苯甲酸、山梨酸鉀、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯的測(cè)定無干擾，理論塔板數(shù)按苯甲酸峰計(jì)算應(yīng)不低于9 000，各色譜峰的分離度均大于1.5。

圖1 4 種溶液的色譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程及檢出限

分別精密吸取對(duì)照品系列混合工作溶液，在1.2儀器工作條件下測(cè)定，以進(jìn)樣質(zhì)量（x）為橫坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)的色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，以3 倍信噪比為檢出限。6 種防腐劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表4。由表4 可知，6 種防腐劑在各自的質(zhì)量范圍內(nèi)與色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限分別為0.002 7～0.042 0 μg／g。

表4 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.5 精密度試驗(yàn)

取適量對(duì)照品混合溶液，在1.2 色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，試驗(yàn)結(jié)果見表5。由表5 可知，6 種防腐劑測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.25%～0.82%，表明該方法的精密度良好。

表5 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取適量供試品溶液，分別在0、1、2、4、8、12、16、20、24 h 測(cè)定，進(jìn)樣體積為10 μL，連續(xù)考察24 h，記錄各成分的色譜峰面積，試驗(yàn)結(jié)果見表6。由表6可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.64%～1.33%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表6 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密吸取2 mL 桔貝合劑樣品溶液（批號(hào)為180909）于50 mL 容量瓶中，共吸取6 份，分別用50%甲醇溶解并稀釋至標(biāo)線，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，在1.2 儀器工作條件下測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果顯示，山梨酸鉀、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯均未檢出，苯甲酸的平均含量為2.512 6 mg／g，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.15%（n=6），結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.8 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密稱取49.28 mg 苯甲酸、12.65 mg 山梨酸鉀、10.86 mg 對(duì)羥基苯甲酸甲酯、11.18 mg 對(duì)羥基苯甲酸乙酯、10.55 mg 對(duì)羥基苯甲酸丙酯和11.23 mg對(duì)羥基苯甲酸丁酯，置于同一20 mL 容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至標(biāo)線，作為待加混合對(duì)照品溶液。精密量取已知含量的樣品1 mL 于50 mL 容量瓶中，制備6 份，分別加入上述待加混合對(duì)照品溶液各1 mL，用50%甲醇溶解并稀釋至標(biāo)線，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液在1.2 儀器工作條件下測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果見表7。由表7 可知，加標(biāo)樣品的平均回收率均大于96.9%（RSD ＜2.0%），表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度，滿足分析要求。

表7 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定

取10 個(gè)不同批號(hào)的桔貝合劑樣品，按照1.3.2方法將每批樣品平行制備3 份，在1.2 儀器工作條件下進(jìn)行測(cè)定，以外標(biāo)法分別計(jì)算各防腐劑的含量，測(cè)定結(jié)果見表8。由表8可知，10 個(gè)不同批號(hào)的桔貝合劑樣品中有一批樣品中添加有對(duì)羥基苯甲酸乙酯但含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于限量要求，苯甲酸的含量也在限度范圍內(nèi)，整體質(zhì)量評(píng)價(jià)較好。

表8 樣品含量測(cè)定結(jié)果 mg／mL

3 結(jié)語

建立了超高效液相色譜法測(cè)定桔貝合劑中苯甲酸、山梨酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯的方法。所建方法操作簡(jiǎn)單且分析速度快，可快速篩查桔貝合劑中防腐劑的含量，為評(píng)價(jià)桔貝合劑的安全性提供依據(jù)。