乜照燕，張亞楠，花 蕊，陳麗君，李 亮，吳海峰

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，河北石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室，河北石家莊 050010；3.河北省胸科醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，河北石家莊 050061)

環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，Cy)是一種抗腫瘤藥物，常用于治療各種惡性腫瘤及自身免疫性疾病。Cy的生殖系統(tǒng)毒性越來越受到人們重視。已有研究顯示Cy可以造成雄性生殖系統(tǒng)損害[1]。動物模型研究顯示Cy可以導(dǎo)致大鼠睪丸和附睪組織發(fā)生病理學(xué)改變[2]。白藜蘆醇(Resveratrol，RES)是一種天然多酚類物質(zhì)，主要存在于虎杖、葡萄和紅酒中[3]。RES具有多種生物學(xué)活性如抗腫瘤、抗炎、抗氧化等，成為目前體外和體內(nèi)研究的熱點[4]。有研究發(fā)現(xiàn)RES通過激活沉默調(diào)節(jié)蛋白1(Sirtuin1，Sirt1)保護造血細胞免受放療誘導(dǎo)的損傷[5]。還有研究發(fā)現(xiàn)RES可以保護放療誘導(dǎo)的腸道損傷[6]。鑒于此，RES對化療藥物誘導(dǎo)的生殖細胞損傷是否有保護作用尚待研究。此外，Cy屬于前體藥，需在體內(nèi)完成代謝才能發(fā)揮作用，其活性代謝產(chǎn)物4-過氧化氫環(huán)磷酰胺(4-Hydro-peroxy Cyclophosphamide，4-HC)可直接作用于細胞[7]。鑒于此，本研究選用4-HC作為體外毒性藥物，研究RES在改善化療導(dǎo)致精子損傷的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象收集2018年1月至2018年4月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心就診患者的正常精液標本。年齡25～34歲，健康狀態(tài)良好，以女方輸卵管因素就診，無高血壓、糖尿病等基礎(chǔ)疾病，性功能狀態(tài)正常，實驗參與者均簽署知情同意書?；颊呓?～7 d，采用手淫法取精液，獲取全部精液于干凈容器，立即送精液檢查室，在室溫下精液完全液化后，依據(jù)世界衛(wèi)生組織人類精液實驗室檢驗手冊第5版進行各項精液參數(shù)分析[8]，收集正常精液標本用于后續(xù)實驗。

1.2 方 法

1.2.14-HC誘導(dǎo)精子細胞毒性作用濃度和RES保護作用濃度的選擇 取正常精液標本進行密度梯度離心后，調(diào)整精子濃度為20×106/mL，處理后精液每份取0.1 mL，加入終濃度(0、1.0、2.5、5.0、7.5 μmol/L) 4-HC (Cayman，19527)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每組設(shè)5個標本，24 h后計數(shù)精子活力，伊紅苯胺黑染色計數(shù)精子存活率，選擇4-HC適合作用濃度。選用不同濃度(5、10、25、50、75 μmol/L)RES(VETEC，900386-5G)預(yù)處理2 h后，再加入按上述已確定的半抑制濃度(50% inhibiting concentration，IC50)4-HC，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每組設(shè)5個標本，24 h后計數(shù)精子活力，伊紅苯胺黑染色確定精子存活率，確定RES保護作用濃度。

1.2.2實驗分組確立4-HC誘導(dǎo)的精子細胞的毒性作用濃度和RES保護作用濃度后，將本實驗研究分為4組：①對照組(CON)，精子不加任何藥物在培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h；②單純RES組，精子在含50 μmol/L RES(RES濃度按1.2.1確定)培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h；③4-HC組，精子在含2.5 μmol/L 4-HC(4-HC濃度按1.2.1確定)培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h；④RES+4-HC組，50 μmol/L RES培養(yǎng)液預(yù)處理2 h后，加入2.5 μmol/L 4-HC繼續(xù)培養(yǎng)24 h。分別取上述4組標本檢測精子活力、精子活率、精子氧化應(yīng)激水平和精子凋亡水平。

1.2.3精子活力、活率測定精子活力測定采用WHO 《人類精液及精子-宮頸黏液相互作用實驗室檢驗手冊》第5版要求。精子活率采用伊紅-苯胺黑染色。使用移液器頭吸取10 μL各組處理后精液于干凈EP管內(nèi)，吸取10 μL伊紅-苯胺黑溶液在EP管內(nèi)充分攪拌混勻，靜置60 s。滴加上述混合液10 μL于載玻片上，制成涂片，室溫自然干燥后于×100油鏡下觀察。用血細胞計數(shù)器來計數(shù)染色(膜不完整，淡紅色)和不染色(膜完整，白色)細胞的數(shù)目。為了達到可接受的低樣本誤差，每張玻片評估200個精子。

1.2.4氧化應(yīng)激指標測定精液微量丙二醛(Malondialdehyde，MDA)精子膜脂類過氧化反應(yīng)的程度以反應(yīng)產(chǎn)物MDA表示，MDA測定采用硫代巴比妥酸比色法，采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。取待測精液0.1 mL為測定管，并設(shè)測定空白管、標準管及標準空白管，按照說明書操作，分別加入相應(yīng)試劑，450 nm處BioTek酶標儀測定。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)按試劑盒說明進行檢測，取各組精子懸液，按照說明書操作，分別于550 nm和412 nm BioTek酶標儀測定。

1.2.5精子凋亡測定將上述處理后的精子懸液加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)離心洗滌2次，離心后取精子沉淀100 μL放入試管中，加入FITC-AnnexinV 10 μL和PI 5 μL染色，室溫下避光靜置15 min后加400 μL孵育緩沖液，1 h內(nèi)流式細胞儀測定結(jié)果。每次檢測至少5 000個精子。采用前向散射/側(cè)向散射設(shè)門來排除細胞碎片和細胞聚集的干擾。先通過散射光信號分選精子與細胞碎片，然后再在雙變量熒光信號散點圖上區(qū)分出活細胞、死亡細胞與凋亡細胞。激發(fā)波長為488 nm，綠色熒光(480～530 nm)采用FL1通道檢測，紅色熒光(580～630 nm)采用FL2通道檢測，陽性細胞比率和平均熒光強度采用CellQuest軟件進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 4-HC導(dǎo)致精子活力和存活率下降不同濃度4-HC(0、1.0、2.5、5.0、7.5 μmol/L)處理精子24 h后。結(jié)果顯示：與對照組比較，隨著4-HC濃度的增加，精子活力和活率逐漸降低，呈劑量依賴關(guān)系，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。按給藥濃度IC50標準，選擇2.5 μmol/L 4-HC為后續(xù)實驗給藥濃度。

表1 4-HC對精子活力和活率影響

2.2 RES改善了4-HC導(dǎo)致的精子活力和活率下降

為了研究RES對4-HC誘導(dǎo)精子活力和活率的改善作用，加入4-HC前使用不同濃度的RES預(yù)處理，24 h檢測精子活力和活率。結(jié)果顯示：隨著RES作用濃度的增加，精子的活力和活率逐漸增加；RES濃度達50 μmol/L時，精子的活力和活率顯著升高，與2.5 μmol/L 4-HC組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，上述結(jié)果提示RES預(yù)處理能改善4-HC誘導(dǎo)的精子損傷。在RES濃度為50 μmol/L時效果最佳，選擇50 μmol/L為后續(xù)實驗藥物濃度(P<0.05，表2)。

2.3 RES改善4-HC導(dǎo)致精子氧化應(yīng)激對各組氧化應(yīng)激水平進行分析，結(jié)果顯示，4-HC組精子MDA水平增高，SOD、GSH-Px酶活性顯著下降，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在RES+4-HC組，MDA水平降低，SOD、GSH-Px酶活性升高(P<0.05)，與4-HC組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由此可見，RES預(yù)處理降低了4-HC誘導(dǎo)的精子氧化應(yīng)激產(chǎn)物產(chǎn)生，增強了抗氧化酶活性，起到保護精子的作用。

表2 RES預(yù)處理對4-HC誘導(dǎo)精子活力和活率的影響

表3 RES預(yù)處理對4-HC誘導(dǎo)精子氧化應(yīng)激水平的影響

2.4 RES改善了4-HC誘導(dǎo)的精子凋亡對各組精子進行流式細胞儀凋亡檢測，結(jié)果顯示，4-HC組精子凋亡情況(42.6%)，與對照組(6.8%)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，RES+4-HC組精子細胞凋亡率明顯降低為14.0%，與4-HC比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，RES預(yù)處理改善了4-HC誘導(dǎo)的精子凋亡(圖1)。

A：對照組；B：4-HC組；C：RES+4-HC組；D：RES組。

3 討 論

近年來，隨著惡性腫瘤年輕化的趨勢，探尋化療前保護性腺功能、減少性腺損傷或化療后提高生育力的補救治療顯得尤為重要。精準醫(yī)療、化療方案改善、現(xiàn)代手術(shù)方式改進以及精子和睪丸組織保存、輔助生殖技術(shù)的大力發(fā)展，使更多腫瘤患者能夠生育后代。目前，上述措施各有利弊，尚需進一步探尋新的保護腫瘤患者生育力的方法。

研究認為多數(shù)化療藥物會影響生育，約50%男性患者在化療結(jié)束后會出現(xiàn)少弱精子癥，其中烷化劑和鉑類化療藥物對生育力影響最大[9]。氧化應(yīng)激損傷是化療藥物導(dǎo)致性腺損傷的原因之一?？寡趸瘎?yīng)用可以減弱氧化應(yīng)激對精子的損傷。劉波等[10]研究發(fā)現(xiàn)通過提高抗氧化能力可以改善Cy致精子濃度減少和活力降低的情況。李杜娟等[11]在灌注Cy小鼠的實驗中，抗氧化劑維生素E組通過提高抗氧化酶水平改善了Cy誘導(dǎo)的睪丸組織損傷。RES由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在酚羥基，能有效清除羥基和過氧化物，防止細胞膜脂質(zhì)過氧化和活性氧對DNA的損傷[12]。RES能夠激活體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)SOD、CAT等酶活性，具有細胞內(nèi)抗氧化活性的功能[13]。目前有一些研究證實RES在體外氧化應(yīng)激環(huán)境中對精子有一定的保護作用。王莉莉等[14]在精子優(yōu)選過程中加入RES，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RES顯著降低了精子優(yōu)選過程中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量。此外，RES通過降低精子氧化應(yīng)激水平，改善了氧化劑導(dǎo)致的精子膜完整性破壞并且增加了精子活力和受精能力[15]。但RES對化療藥物導(dǎo)致的精子損傷是否有保護作用尚未見報道。本研究首先采用Cy構(gòu)建精子損傷模型，結(jié)果顯示，隨著4-HC濃度增加，精子活力和存活率下降，在2.5 μmo1/L時精子活力下降至52.2%，根據(jù)藥物濃度選擇的IC50原則，將2.5 μmo1/L 4-HC作為后續(xù)研究濃度。RES+4-HC組，隨著RES濃度升高，精子活力得到提升，50 μmol/L RES對精子改善效果最佳，選擇50 μmol/L為后續(xù)實驗藥物濃度。

氧化應(yīng)激可以造成精子結(jié)構(gòu)和功能損害，是導(dǎo)致男性不育的主要原因[16]。本研究進一步評估了氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA和抗氧化酶GSH-Px、SOD酶活性的變化，MDA是氧化應(yīng)激損傷過程中產(chǎn)生的主要氧化應(yīng)激產(chǎn)物之一，對精子細胞有明顯損傷作用，是引起不育的常見代謝產(chǎn)物[17]。

本研究結(jié)果顯示，4-HC組MDA水平顯著上升，GSH-Px、SOD酶活性顯著下降。ROS破壞線粒體呼吸功能，降低線粒體膜電位，導(dǎo)致能量生成障礙使得精子活力進一步下降[18]。高水平的ROS可損害線粒體膜，引起細胞色素C釋放觸發(fā)細胞凋亡[19]。本研究顯示4-HC組精子活力、存活率下降，流式細胞儀檢測精子凋亡增加。我們推測4-HC誘導(dǎo)精子產(chǎn)生過量的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致精子發(fā)生高氧化應(yīng)激損傷，高濃度的ROS破壞精子線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致精子活力減弱，也加速生殖細胞的凋亡過程。本研究發(fā)現(xiàn)RES預(yù)處理組GSH-Px、SOD氧化酶酶活性增加，MDA水平降低，RES組精子活力和活率得到改善，精子凋亡降低。在RES組，MDA水平顯著下降，GSH-Px、SOD酶活性上升。精子活力、存活率得到提高，流式細胞儀檢測精子凋亡降低。由此可見，RES抵抗了過度氧化應(yīng)激對精子的損傷作用，從而改善了4-HC誘導(dǎo)的精子損傷。在一些其他體外研究中發(fā)現(xiàn)RES可以增強細胞的抗氧化功能，可以保護細胞免受氧化應(yīng)激損傷而延緩細胞死亡[20]。RES預(yù)處理通過抗氧化改善了4-HC誘導(dǎo)的精子損傷。

綜上所述，本研究為臨床腫瘤治療中應(yīng)用化療藥物的男性生育力保護提供了一定的依據(jù)。未來研究將進一步闡明RES改善化療藥物對精子的損害機制和RES應(yīng)用安全性的問題。