劉素貞，李瑞萍，劉長國，盧立志,,李國勤,田勇，柴一秋，姚火春

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.溫州科技職業(yè)學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325000；3. 浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院，浙江 杭州 311300；4. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021；5. 浙江省亞熱帶作物研究所/溫州市蟲生真菌資源研究與開發(fā)重點實驗室，浙江 溫州 325005)

目前，細(xì)菌抗藥性問題給人類帶來了嚴(yán)重的威脅，為了維護(hù)動物源性食品安全和公共衛(wèi)生安全，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出加強藥物的監(jiān)督管理工作，逐步停止除中草藥外的促生長類藥物飼料添加劑的使用，倡導(dǎo)開發(fā)新型飼料添加劑替代抗菌促生長類飼料添加劑[1-3]。

我國中藥材資源豐厚，開發(fā)新型中草藥具有廣泛的發(fā)展空間。研究表明，植物多糖具有提高機體免疫力、抗菌、抗病毒等多種作用[4-5]，因此多糖對動物機體免疫調(diào)節(jié)活性的研究成為熱點[6]。蟬花富產(chǎn)于浙江、四川等地，含有多種糖原、生物堿、蛋白質(zhì)等成分，其中以多糖類和蛋白質(zhì)為主。

蟬花具有抵抗腫瘤、抗氧化等藥理作用[7]，但對雞的藥理作用尚未見報道。野生蟬花資源稀少，人工培養(yǎng)蟬花與野生蟬花成分相似，多糖、蟲草酸、必需氨基酸等高于野生蟬花[8]。浙江亞熱帶作物研究所通過人工培養(yǎng)技術(shù)獲得蟬花不同產(chǎn)品，其中有：蟬花菌絲體和蟬花多糖(從蟬花菌絲體中提取所得的蟬花粗多糖，蟬花菌絲體中蟬花多糖的提取得率為14.2%)，蟬花多糖的生產(chǎn)成本大約是蟬花菌絲體的7倍多。與野生蟬花相比，這2種產(chǎn)品具有價格低、更容易產(chǎn)業(yè)化等特點。本試驗在前期試驗基礎(chǔ)上，選取人工培養(yǎng)的蟬花中富含多糖成分的2種產(chǎn)品作為飼料添加劑[9]，通過研究其對生態(tài)放養(yǎng)三黃雞體液免疫水平、細(xì)胞因子水平及與免疫相關(guān)因子干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素4(IL-4)等mRNA表達(dá)變化，分析蟬花多糖、蟬花菌絲體對禽流感免疫的作用，進(jìn)而為養(yǎng)雞業(yè)綠色生態(tài)發(fā)展、推廣應(yīng)用性價比高的蟬花產(chǎn)品提供試驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

蟬花多糖(多糖含量44.6%)、蟬花菌絲體干燥物(多糖提取得率為14.2%)， 均由浙江省亞熱帶作物研究所提供；禽流感疫苗(H5-Re8+H7N9)購自哈藥集團有限公司。

1.2 主要試劑

IL-2、IL-4、IFN-γ、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等試劑盒(北京瑞格博科技發(fā)展有限公司)，禽流感標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、陰性血清及禽流感病毒血凝抑制抗原(杭州杰萌動物疫病防控科技有限公司)，總RNA提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Aidlab，北京)。

1.3 試驗設(shè)計

1日齡雛雞1 500只，隨機分為3組，每組500只，其中：對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，蟬花多糖組在基礎(chǔ)飼糧中按0.5 g/kg添加蟬花多糖(相當(dāng)于添加蟬花粗多糖1.12 g/kg)，蟬花菌絲體組在基礎(chǔ)飼糧中按20 g/kg添加蟬花菌絲體(相當(dāng)于添加蟬花粗多糖2.84 g/kg)。試驗期為51 d。

1.4 飼養(yǎng)管理

雞群自由攝食飲水，每天早晚添加相應(yīng)的飼料2次。地面散養(yǎng)，自然光照，每天觀察雞采食及精神狀態(tài)。飼料由溫州正泰農(nóng)牧有限公司提供，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。5日齡法氏囊疫苗飲水免疫，13日齡新城疫活疫苗點眼免疫，19日齡禽流感疫苗肌肉注射，29日齡新城疫活疫苗點眼免疫，45日齡新城疫活疫苗點眼免疫。

1.5 檢測指標(biāo)和方法

1.5.1 禽流感抗體水平檢測

在27、37、51日齡(即首免后1、2.5和4.5周)每組抽取20只試驗雞翅靜脈采血，3 500 r/min離心5 min，抽取上層血清放置-20℃保存?zhèn)錂z。依據(jù)《高致病性禽流感診斷技術(shù)》(GB/T 18936—2003)采用微量HI試驗方法測定禽流感抗體水平[10]。

1.5.2 細(xì)胞因子含量測定

血樣采集及處理同1.5.1。ELISA測定血清樣本TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4含量，詳細(xì)步驟參考試劑盒說明書。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.5.3 基因表達(dá)差異檢測

51日齡時，每組隨機抽取3只，采血完畢后迅速剖殺，無菌采取脾臟，放入凍存管并保存于液氮，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱待基因表達(dá)檢測。全部脾臟組織樣品總RNA參照試劑盒操作說明進(jìn)行，檢測RNAOD值，計算濃度，通過A260/A280比值檢測純度。組織樣品cDNA反轉(zhuǎn)錄參照試劑盒操作說明進(jìn)行，-80 ℃保存。

使用熒光定量PCR試劑盒，反應(yīng)體系為10 μL：2×SYBR?Green Supermix 5.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板 1.0 μL，RNase Free dH2O補足至10.0 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，根據(jù)表2中引物退火溫度58 ℃退火30 s，39個循環(huán)；融解曲線分析程序為60～95 ℃，每循環(huán)一次增加1 ℃，持續(xù)4 s。以Actin為內(nèi)參基因，對目的基因IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4的mRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測分析。各基因和內(nèi)參基因引物序列詳見表2，引物由北京百邁客生物科技有限公司合成。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間采用LDS法進(jìn)行差異性顯著性檢驗。試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

表2 引物序列

2 結(jié)果

2.1 蟬花多糖對禽流感抗體水平的影響

由表3可知，51日齡時，蟬花菌絲體組的H5-Re8抗體水平較對照組有所升高(P<0.05)，27～51日齡，對照組H5-Re8抗體水平在3組中下降最快，而蟬花菌絲體組下降最慢。27～51日齡，各組H7N9抗體水平都呈先升后降的趨勢，蟬花多糖組和蟬花菌絲體組H7N9抗體水平峰值較對照組更高；在37～51日齡，對照組H7N9抗體水平下降了7.1%，而蟬花菌絲體組的H7N9抗體水平僅僅下降了3.4%。表明在飼料中添加蟬花多糖不僅不同程度地提高了禽流感抗體水平，而且將抗體水平維持了更長的時間。

表3 27～51日齡各組雞 H5-Re8、H7N9抗體水平 log2

2.2 蟬花多糖對血清細(xì)胞因子水平的影響

由表4可知，蟬花多糖組51日齡IL-1含量顯著高于對照組；蟬花多糖組、蟬花菌絲體組IL-2含量較對照組都有不同程度上升(P>0.05)；27日齡，蟬花多糖組IL-4含量顯著高于對照組和蟬花菌絲體組(P<0.05)，51日齡，蟬花菌絲體組IL-4含量最高，且蟬花多糖組和蟬花菌絲體組均顯著高于對照組(P<0.05)；27、51日齡，蟬花多糖組、蟬花菌絲體組IL-6含量與對照組相比有所升高(P>0.05)； 27日齡，蟬花多糖組、蟬花菌絲體組IFN-γ含量比對照組顯著升高(P<0.05)；蟬花多糖組、蟬花菌絲體組27～51日齡TNF-α含量較對照組有不同程度上升，其中27、51日齡蟬花多糖組、37日齡蟬花菌絲體組均比對照組顯著升高(P<0.05)。

結(jié)果顯示，通過添加蟬花多糖，機體可誘導(dǎo)分泌IL-4、TNF-α等多種細(xì)胞因子參與細(xì)胞免疫，IL-4等細(xì)胞因子介導(dǎo)體液免疫，兩者在平衡狀態(tài)下，能有效維持和提高機體免疫功能水平[11]。

表4 蟬花多糖對血清細(xì)胞因子水平的影響 pg/mL

2.3 蟬花多糖對免疫相關(guān)基因表達(dá)量的影響

根據(jù)圖1可知，蟬花多糖組和蟬花菌絲體組脾臟細(xì)胞TNF-α、IL-2表達(dá)均有所降低，且TNF-α的表達(dá)顯著低于對照組(P<0.05)；蟬花菌絲體可促進(jìn)脾臟細(xì)胞IFN-γ、IL-4的表達(dá)，但與對照組均無顯著差異(P>0.05)。

注：相同基因組間比較，無字母或字母相同表示差異不顯著(P>0.05)，不同表示差異顯著(P<0.05)

3 討論

3.1 蟬花多糖對三黃雞禽流感抗體水平的影響

前期試驗表明，蟬花多糖能提高雛雞新城疫疫苗免疫抗體水平和成活率[12]。禽業(yè)致命的打擊除了雞新城疫還有禽流感病毒，中草藥多糖能調(diào)節(jié)免疫功能、提高機體對外來侵入病菌的抵抗力，且具有毒副作用小等優(yōu)點[13]。本試驗結(jié)果顯示蟬花菌絲體組禽流感H5抗體水平顯著高于對照組，提示蟬花多糖可能有提高動物機體體液免疫的作用。劉娜等[14]研究發(fā)現(xiàn)，松花粉多糖對禽流感的免疫有增強作用。

3.2 蟬花多糖對三黃雞血清細(xì)胞因子水平的影響

白細(xì)胞介素參與機體內(nèi)多種生理病理過程[15]。Th1類細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫，參與機體抗毒、抗癌；Th2類細(xì)胞是參加體液免疫，促進(jìn)抗體產(chǎn)生[16]，兩類細(xì)胞的平衡在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[17]。IL-4具有多種免疫功能，包括輔助Th細(xì)胞進(jìn)行分化、先天免疫應(yīng)答的過程，且促進(jìn)活化的T細(xì)胞生長[18]。在本試驗中，試驗組與對照組相比，IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ含量都有不同程度的升高，試驗前期蟬花多糖組IL-4含量顯著升高，試驗后期蟬花菌絲體組IL-4含量呈顯著升高。表明蟬花多糖和蟬花菌絲體多糖可能通過誘導(dǎo)機體免疫細(xì)胞產(chǎn)生IL-4等細(xì)胞因子，從而增強體液免疫功能。研究發(fā)現(xiàn)，隨著IL-4細(xì)胞因子含量的升高，同期H5-Re8、H7N9抗體水平比對照組相應(yīng)提高，表明蟬花多糖能激發(fā)Th2類細(xì)胞提高體液免疫水平。Huang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖和豬苓多糖能顯著增強小鼠機體內(nèi)巨噬細(xì)胞的吞噬功能和NK細(xì)胞的活性。

早期試驗多糖用于雞生產(chǎn),有助于促進(jìn)生長、提升血清中干擾素等分泌水平等積極增強免疫的作用[20]。TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子參與細(xì)胞免疫[21-22]；滕麗花等[23]證實，多種中草藥多糖(黃芪、魚腥草等)都能刺激細(xì)胞因子產(chǎn)生，提高機體巨噬細(xì)胞的吞噬作用，從而增強機體免疫力，發(fā)揮中草藥多糖抗感染等作用。本試驗研究結(jié)果表明，蟬花多糖組和蟬花菌絲體組TNF-α含量有顯著升高。

3.3 蟬花多糖對三黃雞免疫相關(guān)基因表達(dá)量的影響

脾臟類屬外周免疫器官，是機體免疫應(yīng)答的主要場所之一,雞脾臟基因表達(dá)分子水平一定程度上反應(yīng)雞免疫調(diào)節(jié)機理。IFN-γ具有激活且促進(jìn)巨噬細(xì)胞功能、激活中性粒細(xì)胞功能等作用[24]。本試驗結(jié)果顯示，蟬花菌絲體組脾臟IFN-γ、IL-4基因含量高于對照組。這與敖艷華等[25]的試驗結(jié)果相似，提示IFN-γ的升高能增強機體的體液免疫，禽流感免疫后抗體水平維持更久。多糖能促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌IFN-α、IL-2等多種與免疫相關(guān)的因子產(chǎn)生，可能與IFN-γ發(fā)揮著較強的免疫調(diào)節(jié)功能相關(guān)，能增強H5亞型雞禽流感疫苗的免疫作用，從而保護(hù)機體的免疫系統(tǒng)[26]。

4 結(jié)論

在三黃雞雛雞階段飼喂蟬花多糖或蟬花菌絲體能提高雞禽流感疫苗抗體水平，可作為增強免疫型添加劑進(jìn)一步開發(fā)利用。雖然蟬花多糖的生產(chǎn)成本是蟬花菌絲體的7倍，但蟬花菌絲體劑量是蟬花多糖的40倍，結(jié)合藥物劑量和生產(chǎn)成本，蟬花多糖推廣應(yīng)用價值更高。