范夢(mèng)璐，田苗，趙永振，平繼輝

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

H9N2亞型禽流感病毒(H9N2 subtype AIV)自1966年從北美的火雞體內(nèi)首次被分離以來(lái)，已在全世界范圍內(nèi)廣泛傳播。1994年，在我國(guó)廣東省分離到第1株H9N2亞型AIV[1-2]。隨著該亞型病毒的不斷傳播和進(jìn)化，H9N2 AIV已在我國(guó)家禽中成為流行最為廣泛的流感病毒亞型。雖然H9N2亞型AIV感染家禽后僅表現(xiàn)出較低的致病性，但與其他病原體混合感染時(shí)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重發(fā)病，給家禽業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。疫苗接種是我國(guó)防控H9N2 AIV采取的最普遍的手段，研究表明，AIV在疫苗選擇壓力下正在不斷發(fā)生重組和變異[4-5]。HA和NA是流感病毒表面的2種糖蛋白，是決定病毒抗原性的重要基因，HA基因上某些氨基酸位點(diǎn)的改變與流感病毒變異和致病性密切相關(guān)[6-7]。

病毒的反向遺傳技術(shù)，又被稱(chēng)為病毒拯救，是通過(guò)構(gòu)建RNA病毒的感染性分子克隆，在DNA分子水平上對(duì)其進(jìn)行體外操作并拯救出具有活性的病毒粒子，從而研究病毒基因結(jié)構(gòu)與功能的方法[8]。Neumann等[9]在1999年建立了流感病毒的12質(zhì)粒反向遺傳系統(tǒng)，將病毒8種vRNA片段的cDNA克隆到人RNA聚合酶Ⅰ啟動(dòng)子和鼠RNA聚合酶終止子之間，在轉(zhuǎn)染8個(gè)vRNA片段的質(zhì)粒DNA同時(shí)，共轉(zhuǎn)染聚合酶(PB2，PB1和PA)以及核蛋白NP的蛋白表達(dá)質(zhì)粒，在4個(gè)蛋白表達(dá)質(zhì)粒所形成的聚合酶驅(qū)動(dòng)下，轉(zhuǎn)錄出8個(gè)病毒RNA片段，進(jìn)而形成病毒的最小復(fù)制單位核糖核蛋白復(fù)合體(vRNPs)，隨后包裝出病毒粒子，因此流感病毒的“12質(zhì)粒系統(tǒng)”具有很高的病毒拯救效率。

本研究從江蘇省某養(yǎng)雞場(chǎng)發(fā)病雞體內(nèi)分離到1株H9N2亞型AIV，命名為A/chicken/Jiangsu/76/2018 (H9N2, JS/76)，該雞場(chǎng)具有比較完善的禽流感疫苗免疫程序，定期進(jìn)行疫苗接種，提示該分離株可能為變異毒株。針對(duì)該病毒HA基因進(jìn)行序列測(cè)定和遺傳演化分析發(fā)現(xiàn)，JS/76仍屬于A/duck/Hong Kong/Y280/97分支。本研究成功建立了低致病性H9N2亞型AIV的反向遺傳系統(tǒng)，通過(guò)測(cè)定病毒TCID50、EID50、生長(zhǎng)曲線和受體親和性證明拯救病毒的生物學(xué)特性與野生毒株完全一致，為進(jìn)一步研究JS/76 AIV的生物學(xué)特性以及致病機(jī)制提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 載體、細(xì)胞和病毒

流感病毒RNA轉(zhuǎn)錄載體pHH21及大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存； MDCK和293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；9～11日齡SPF雞胚購(gòu)自天邦生物技術(shù)股份有限公司。

本研究使用AIV毒株A/chicken/Jiangsu/76/2018從江蘇省某養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病雞體內(nèi)分離，經(jīng)SPF雞胚連續(xù)3次有限稀釋進(jìn)行純化，并在SPF雞胚上增殖一代，保存于-80 ℃冰箱備用。對(duì)照毒株A/California/04/2009 (H1N1, Cal/04) 和A/chicken/Shandong/6/1996 (H9N2, SD/6/96) 由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

Phonta Max Super-Fidelity DNA酶、T4 DNA 連接酶、ClonExpress II One Step Cloning Kit和RNA isolater Total RNA Extraction Reagent等試劑(盒)購(gòu)自南京諾唯贊公司；質(zhì)粒DNA中提試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；膠回收試劑盒以及DNA清潔回收試劑盒購(gòu)自AxyPrep公司；限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自NEB公司；DNA Marker DL2000和DNA Marker DL5000均購(gòu)自TaKaRa；胎牛血清、Opti-MEM減血清培養(yǎng)基、LipofectamineTM2000和DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自Invitrogen公司；TPCK胰酶以及FITC鏈霉親和素均購(gòu)自Sigma-Aldrich；Alexa Fluor?647 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (H+L) 購(gòu)自福麥斯生物；M2 E10單克隆抗體、6’SLN和6’sDi-LN2種唾液酸糖鏈由內(nèi)蒙古大學(xué)王國(guó)俊教授惠贈(zèng)。

1.3 HA基因的關(guān)鍵性位點(diǎn)分析和進(jìn)化樹(shù)繪制

用Lasergene 9.0中的MegAlign軟件對(duì)H9N2分離株的HA基因序列與流感病毒數(shù)據(jù)庫(kù)中的H9N2禽流感參考毒株的HA基因序列進(jìn)行比較和分析。參考毒株HA基因登錄號(hào)分別為：A/chicken/Anhui/LH66/2017 (H9N2):MH489443; A/chicken/Guangxi/55/2005 (H9N2):EU086245; A/chicken/Shanghai/F/1998 (H9N2):AY743216; A/chicken/Hong Kong/G9/1997 (H9N2):KF188366; A/duck/Hong Kong/Y280/1997 (H9N2):AF56376; A/chicken/Shandong/6/1996 (H9N2):DQ064376; A/chicken/Beijing/1/1994 (H9N2):AF156380。使用Mega 7.0.26軟件繪制病毒HA基因的進(jìn)化樹(shù)，根據(jù)文獻(xiàn)[10]分析分離株的關(guān)鍵性氨基酸位點(diǎn)。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

利用Oligo7.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增流感病毒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS基因全長(zhǎng)的特異性引物及流感病毒反轉(zhuǎn)錄通用引物PolI-U12：CACACACGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGG，引物由通用生物系統(tǒng)(安徽)公司合成，引物序列信息見(jiàn)表1。

表1 H9N2亞型AIV 8個(gè)基因片段的感染性克隆構(gòu)建引物

1.5 病毒RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄以及目的片段擴(kuò)增

參照RNA isolater Total RNA Extraction Reagent 試劑使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行病毒RNA抽提，采用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit試劑盒通過(guò)流感病毒反轉(zhuǎn)錄通用引物PolI-U12進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄。利用基因特異性引物以cDNA為模板對(duì)JS/76的8個(gè)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。

1.6 感染性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建

使用限制性?xún)?nèi)切酶BsmBⅠ對(duì)pHH21載體質(zhì)粒進(jìn)行酶切處理，同時(shí)利用BsmBⅠ或BsaⅠ限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)8個(gè)基因片段進(jìn)行酶切處理后，利用T4 DNA 連接酶將線性化的pHH21載體和目的基因片段進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并篩選陽(yáng)性克隆送至南京擎科生物科技有限公司測(cè)序。使用不含內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA提取試劑盒提取JS/76的8個(gè)基因片段的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，8個(gè)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒分別命名為pHH21-JS/76-PB2、pHH21-JS/76-PB1、pHH21-JS/76-PA、pHH21-JS/76-HA、pHH21-JS/76-NP、pHH21-JS/76-NA、pHH21-JS/76-M以及pHH21-JS/76-NS。

1.7 293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染與病毒的拯救

使用LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)外源質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，利用“12質(zhì)粒系統(tǒng)”進(jìn)行病毒拯救。12個(gè)質(zhì)粒分別為：上述8個(gè)病毒RNA轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒以及4個(gè)蛋白表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-WSN-PB2、pCAGGS-WSN-PB1、pCAGGS-WSN-PA和pCAGGS-WSN-NP。

病毒拯救的具體步驟如下：將8個(gè)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒(200 ng/質(zhì)粒)和4個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒(1 000 ng/質(zhì)粒)混勻后，與12 μL LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑混合，在室溫孵育30 min后，加入到密度為70%的單層293T細(xì)胞中，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染6 h后棄去轉(zhuǎn)染上清，并加入2 mL新鮮的Opti-MEM(含有1 μg/mL的TPCK-Trypsin)，37 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后將轉(zhuǎn)染上清接種至9～11日齡SPF雞胚的尿囊腔，0.2 mL/胚，置于37 ℃ 增殖48 h，收集尿囊液，用1%的雞紅細(xì)胞測(cè)定病毒的血凝價(jià)，將有血凝活性的尿囊液收集并分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 獲救病毒的鑒定

對(duì)獲救病毒RNA進(jìn)行提取、片段擴(kuò)增以及測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用Lasergene 9.0軟件套裝中的SeqMan軟件進(jìn)行序列拼接并通過(guò)與親本病毒基因組的比較來(lái)判定拯救的病毒的正確性。

1.9 EID50和TCID50滴度的測(cè)定

按照Reed-Muench 方法，測(cè)定拯救毒株與親本毒株的雞胚半數(shù)感染量(EID50)和半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)。數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8.0.1.2軟件進(jìn)行處理并用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，利用t檢驗(yàn)方法進(jìn)行差異顯著性分析。

1.10 病毒在SPF雞胚和MDCK細(xì)胞上的復(fù)制

拯救病毒和野生型病毒分別以2×103EID50的感染量接種18枚9日齡SPF雞胚，在接種后12 、24、36、48、60和72 h分別取3枚雞胚，測(cè)定其HA滴度并取平均值代表病毒在該時(shí)間點(diǎn)的復(fù)制情況，利用GraphPad Prism 8.0.1.2軟件處理數(shù)據(jù)并繪制復(fù)制曲線。

拯救病毒和野生病毒分別以MOI=0.01的病毒量感染培養(yǎng)于6孔板中的密度為95%的MDCK細(xì)胞，每個(gè)病毒3個(gè)重復(fù)，分別在12、24、36、48、60和72 h收取細(xì)胞上清液存于-80 ℃冰箱，待所有樣品收集完畢后測(cè)定其HA滴度，利用GraphPad Prism 8.0.1.2軟件處理數(shù)據(jù)并繪制病毒的生長(zhǎng)曲線。

1.11 受體結(jié)合試驗(yàn)

使用Cal/04病毒作為人流感病毒受體結(jié)合特征的對(duì)照，SD/6/96作為禽流感病毒受體結(jié)合特征的對(duì)照。未感染病毒的細(xì)胞為MOCK組空白對(duì)照。將對(duì)照組病毒、拯救病毒和野生病毒分別以MOI=1的劑量感染6孔板中95%密度的單層MDCK細(xì)胞，感染24 h后，胰酶消化感染細(xì)胞(包括MOCK組和感染組的細(xì)胞)，用冷PBS洗滌細(xì)胞3次后，重懸于500 μL的PBS中，之后將細(xì)胞加入96孔V型板中，每孔100 μL。分別加入2種α-2,6唾液酸糖鏈(6’SLN和6’sDi-LN)以及M2 E10抗體，4 ℃孵育2 h，用PBS洗滌2次后，每孔中分別加入FITC鏈霉親和素和Alexa Fluor?647 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (H+L) 抗體，4 ℃孵育2 h，PBS洗2遍后，1 mL PBS重懸，流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定，F(xiàn)lowJo軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 HA基因遺傳演化及關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析

JS/76分離株在SPF雞胚上進(jìn)行3次有限稀釋純化后，提取病毒的RNA，RT-PCR擴(kuò)增其HA基因之后進(jìn)行序列測(cè)定，與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)所獲得的參考毒株核苷酸序列進(jìn)行對(duì)比，繪制病毒HA基因的進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果如圖1所示，JS/76分離株位于Y280分支，與湖南、山東、江蘇、江西等地的H9N2分離株相距較近，其變異程度主要與時(shí)間相關(guān)，與宿主和地理位置關(guān)系較小。對(duì)JS/76的HA氨基酸序列的關(guān)鍵性位點(diǎn)進(jìn)行分析(表2)，JS/76毒株在315～323位的裂解位點(diǎn)為PSRSSR↓GLF，無(wú)多個(gè)連續(xù)堿性氨基酸，表明其具有LPAIV的分子特征。對(duì)其受體結(jié)合位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，JS/76的受體結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生了E180T和Q216L的突變，表明可能已具備人源病毒的受體結(jié)合特征。在91、143、145、173、184和185位氨基酸與參考毒株一致，分別為Y、W、T、N、L和Y。潛在糖基化位點(diǎn)分析顯示，JS/76毒株在11、123、127、280、287、295、474和533位有8個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，其中127位氨基酸與參考毒株相比多了一個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)NGT，在200位少了一個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)NRT。

2.2 感染性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建

提取病毒的RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用帶有酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，酶切后克隆到pHH21載體，挑選單菌落37℃搖床培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，結(jié)果如圖2A所示，8個(gè)基因片段的感染性克隆的大小均符合預(yù)期，進(jìn)行PCR鑒定發(fā)現(xiàn)，8個(gè)質(zhì)粒均能擴(kuò)增出位置正確、條帶單一的條帶(如圖2B所示)。經(jīng)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，所構(gòu)建的重組質(zhì)粒所攜帶的目的基因序列與JS/76基因序列完全一致，表明成功獲得了JS/76病毒8個(gè)基因的感染性克隆。

2.3 病毒的拯救與鑒定

利用流感病毒的“12質(zhì)粒系統(tǒng)”進(jìn)行JS/76的拯救，將LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑與構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入已準(zhǔn)備好的生長(zhǎng)密度為70%～80%的單層293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞上清接種9～11日齡SPF雞胚，48 h后收獲尿囊液，測(cè)定血凝活性為陽(yáng)性，拯救的病毒命名為r-JS/76。提取病毒RNA、反轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增8個(gè)基因片段并進(jìn)行序列測(cè)定，與JS/76基因組序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，r-JS/76基因序列與野生病毒JS/76序列完全一致，證明病毒拯救成功。

表2 JS/76 毒株HA序列關(guān)鍵性氨基酸位點(diǎn)分析

注：以A/turkey/Wisconsin/1966 (H9N2) 為進(jìn)化樹(shù)的樹(shù)根?！癖硎颈狙芯恐蟹蛛x株JS/76，■表示經(jīng)典代表毒株，▲表示疫苗毒株

M. DL5000 DNA Marker; 1～8.依次為PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的陽(yáng)性質(zhì)粒和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.4 拯救病毒r-JS/76和野生病毒JS/76的病毒滴度測(cè)定

分別測(cè)定r-JS/76和JS/76的病毒滴度，將r-JS/76病毒接種MDCK細(xì)胞，測(cè)得其滴度為(7.34±0.10)lgTCID50/mL，親本病毒JS/76的滴度為(7.12±0.23)lgTCID50/mL。將r-JS/76和JS/76分別接種9日齡SPF雞胚，測(cè)定其在雞胚上的滴度分別為(9.56±0.11)lgEID50/mL和(9.31±0.15)lgEID50/mL，結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析無(wú)顯著性差異，表明拯救病毒的增殖特性未發(fā)生改變。

2.5 r-JS/76和JS/76病毒在雞胚和細(xì)胞上復(fù)制特性分析

將拯救病毒r-JS/76和親本病毒JS/76分別以2×103EID50的感染量接種SPF雞胚，然后在不同的時(shí)間點(diǎn)收獲尿囊液，測(cè)定病毒血凝價(jià)，比較2個(gè)病毒在雞胚中的復(fù)制能力。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，野生型毒株JS/76與其拯救株r-JS/76在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的復(fù)制滴度基本一致，r-JS/76病毒復(fù)制滴度略高于親本毒株，但無(wú)顯著性差異(圖3A)。

JS/76和r-JS/76以MOI=0.01的劑量感染MDCK細(xì)胞，不同的時(shí)間點(diǎn)收獲細(xì)胞上清測(cè)定其血凝價(jià)，比較2個(gè)病毒在MDCK細(xì)胞中的復(fù)制能力。通過(guò)差異顯著性分析，拯救株r-JS/76比野生型毒株JS/76在細(xì)胞上的復(fù)制水平略高，但無(wú)顯著性差異(圖3B)。因此，拯救病毒r-JS/76在SPF雞胚和MDCK細(xì)胞上保留了與JS/76相似的復(fù)制特性。

圖3 拯救毒株r-JS/76和親本毒株JS/76在SPF雞胚(A)和MDCK細(xì)胞(B)的復(fù)制動(dòng)力學(xué)分析

2.6 r-JS/76和JS/76病毒的受體結(jié)合特性分析

JS/76和r-JS/76以MOI=1的劑量感染MDCK細(xì)胞，在24 h后收集感染細(xì)胞，利用相應(yīng)糖鏈和抗體處理后，流式技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的陽(yáng)性率，結(jié)果如圖4 A所示，與MOCK組相比，對(duì)照組的2個(gè)病毒Cal/04和SD/6/96能夠檢測(cè)到的細(xì)胞陽(yáng)性率分別為72.2%和85.7%，試驗(yàn)組r-JS/76和JS/76檢測(cè)到的細(xì)胞陽(yáng)性率分別為89.6%和90.1%，說(shuō)明MDCK已經(jīng)被病毒有效感染并能夠通過(guò)相應(yīng)抗體檢測(cè)到。通過(guò)檢測(cè)與2種α-2,6唾液酸糖鏈的結(jié)合效率發(fā)現(xiàn)(圖4 B)，Cal/04具有α-2,6唾液酸受體親和性，而SD/6/96無(wú)α-2,6唾液酸受體親和性，與這2株病毒本身分別具備人源受體結(jié)合特性及禽源受體結(jié)合特性完全一致。與對(duì)照組相比，r-JS/76和JS/76兩個(gè)病毒也能夠檢測(cè)與6’sDi-LN糖鏈結(jié)合，說(shuō)明這2株病毒已經(jīng)獲得人源受體親和特征。

圖4 拯救毒株r-JS/76和親本毒株JS/76流式細(xì)胞陽(yáng)性結(jié)果(A)及人源受體親和性分析(B)

3 討論

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，H9N2亞型AIV能夠?yàn)槎喾N新型流感病毒提供內(nèi)部基因或與高致病性流感病毒重組，從而增強(qiáng)流感病毒的毒力和感染范圍[11-12]。文獻(xiàn)報(bào)道，近期分離到2株廈門(mén)分離株的內(nèi)部基因與H10及H7亞型親緣關(guān)系最近，分離株為四重重組體，進(jìn)化程度與時(shí)間相關(guān)性較大，進(jìn)化方向已突破地域和宿主的特點(diǎn)[13]，因此H9N2亞型AIV已經(jīng)成為公共安全的潛在威脅。H9N2亞型AIV能夠逃避宿主機(jī)體的免疫能力，對(duì)宿主構(gòu)成持續(xù)的威脅，主要原因就是病毒的表面蛋白血凝素HA和神經(jīng)氨酸酶NA在不斷發(fā)生變異，使病毒容易發(fā)生抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變[10, 14-15]。表面蛋白HA是宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別的主要靶蛋白之一，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)生中和抗體。HA的特異性抗體主要針對(duì)頭部球狀結(jié)構(gòu)域。抗原表位、受體結(jié)合區(qū)以及其他頭部氨基酸替換都會(huì)對(duì)流感病毒的抗原性、受體親和性以及病毒毒力產(chǎn)生影響[16-17]。本研究通過(guò)對(duì)JS/76分離株的HA基因進(jìn)行遺傳演化分析以及關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)JS/76毒株屬于Y280-like分支。研究發(fā)現(xiàn)同一時(shí)期不同區(qū)域H9N2毒株之間進(jìn)化距離相近，HA基因的變異情況和地域無(wú)相關(guān)性，可能與時(shí)間推移具有相關(guān)性[18]。另外，從進(jìn)化樹(shù)中可以看出，JS/76 AIV HA基因序列與參考毒株和常用疫苗株的距離較遠(yuǎn)，可能是在疫苗免疫壓力和自然選擇下，加速了H9N2亞型AIV的變異速度。

HA蛋白受體結(jié)合區(qū)氨基酸的改變，會(huì)影響流感病毒與禽源/人源宿主細(xì)胞受體的結(jié)合能力。在先前的報(bào)道中，Q216L位點(diǎn)氨基酸發(fā)生變異，是H9N2亞型AIV由禽源受體親和性向人源受體親和性改變的一個(gè)先決條件[19-20]。本研究中，JS/76毒株的HA基因216位氨基酸為亮氨酸，與參考毒株相比，已經(jīng)具備了與人源α-2,6唾液酸受體結(jié)合的特征。病毒表面蛋白HA糖基化缺失或增加會(huì)影響流感病毒的毒力或者抗原性。Gao等[21]和Herfst等[22]研究發(fā)現(xiàn)H5N1 AIV HA蛋白158N糖基化位點(diǎn)的缺失有助于病毒在雪貂上呼吸道的復(fù)制，促進(jìn)H5N1病毒在豚鼠中的直接接觸傳播以及在雪貂中的水平傳播。有研究表明國(guó)內(nèi)多數(shù)H9N2亞型 AIV HA蛋白有7個(gè)毒力相關(guān)的糖基化位點(diǎn)(含N-X-S/T，X為除P以外的氨基酸)[2]。本研究中JS/76毒株HA基因的127～129位氨基酸獲得一個(gè)額外的潛在糖基化位點(diǎn)，該突變是否形成糖基化以及對(duì)病毒的生物學(xué)特性影響還有待進(jìn)一步研究。

目前，反向遺傳技術(shù)已經(jīng)非常成熟，該技術(shù)已應(yīng)用于多種負(fù)鏈RNA病毒的研究，在病毒基因組的表達(dá)調(diào)控機(jī)制、分子致病機(jī)理研究以及新型疫苗研制上發(fā)揮著重要作用[23-24]。本研究利用流感病毒反向遺傳的“12質(zhì)粒系統(tǒng)”，將野生毒株的8個(gè)基因片段分別克隆到流感病毒vRNA表達(dá)載體pHH21上，與4個(gè)蛋白表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，組裝出具有感染性的病毒粒子，然后在雞胚中大量增殖，從而成功拯救r-JS/76病毒。通過(guò)基因測(cè)序、病毒滴度測(cè)定以及病毒在SPF雞胚和MDCK細(xì)胞上的復(fù)制等方面的比較，拯救病毒r-JS/76與野生病毒JS/76具有相同的生物學(xué)特性；通過(guò)受體結(jié)合試驗(yàn)證明，拯救病毒和親本病毒受體特性保持一致，2個(gè)病毒都已具有人源受體親和特征。本研究中r-JS/76病毒反向遺傳系統(tǒng)的建立，為后續(xù)在分子基礎(chǔ)上進(jìn)行基因替換或基因定點(diǎn)突變、深入研究JS/76 AIV 的變異機(jī)制以及對(duì)跨宿主感染能力搭建了平臺(tái)，同時(shí)也為JS/76 AIV 的宿主適應(yīng)性和新型疫苗研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。