劉麗梅, 李志明, 劉新, 陳萍, 徐龍

1銀川市中醫(yī)醫(yī)院(寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院)心病科(寧夏銀川 750001)； 寧夏醫(yī)科大學(xué) 2生育力保持重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 3病理生理實(shí)驗(yàn)室(寧夏銀川 750004)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病即冠心病，是臨床常見心血管疾病，被全球公認(rèn)為是致病與死亡的主要原因，并隨全球老齡化加劇，其發(fā)病率和死亡率呈持續(xù)上升趨勢[1]。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病主要病理變化，嚴(yán)重影響患者病情及預(yù)后，因此，對冠心病患者疾病嚴(yán)重程度進(jìn)行判定及進(jìn)行針對性治療，對降低患者致殘率與死亡率極為重要[2]。近年來，有大量研究證實(shí)微小RNA(microRNA，miRNA)參與多種疾病發(fā)生、發(fā)展，有研究發(fā)現(xiàn)，miR-135b-5p參與動(dòng)脈粥樣硬化中內(nèi)皮細(xì)胞與血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移[3]。血脂代謝紊亂是導(dǎo)致冠心病的重要因素，在動(dòng)脈粥樣硬化中扮演重要角色，有研究發(fā)現(xiàn)，血管生成素樣蛋白3(angiopoientin-like protein 3，ANGPTL3)與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝功能密切相關(guān)[4]。而Gensini積分是反映冠狀動(dòng)脈狹窄程度的重要指標(biāo)。因此，本研究旨在探討血清miR-135b、ANGPTL3與冠心病患者Gensini積分的相關(guān)性，為其臨床治療及機(jī)制研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年3月至2019年3月本院收治的110例冠心病患者進(jìn)行研究(研究組)，選取同期100例體檢健康者作為對照組。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；(2)經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)；(3)患者知情，簽署知情同意書；(4)經(jīng)本院倫理委員會審查批準(zhǔn)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴先天性心臟病者、心肌病等心血管疾病者；(2)合并甲狀腺疾病者；(3)伴活動(dòng)性肝、腎疾病者；(4)合并嚴(yán)重感染者；(5)近期有影響血脂藥物服用史者；(6)伴嚴(yán)重凝血功能障礙者；(7)合并惡性腫瘤者。

研究組男58例，女52例；年齡51～82歲，平均(64.28±6.72)歲；體質(zhì)指數(shù)21.08～24.83 kg/m2，平均(23.14±0.84)kg/m2；美國紐約心臟協(xié)會心功能分級：Ⅰ級45例，Ⅱ級35例，Ⅲ級30例；對照組男54例，女46例；年齡53～85歲，平均(65.51±6.32)歲；體質(zhì)指數(shù)21.15～24.95 kg/m2，平均(23.19±0.87)kg/m2，兩組受試者性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 試劑與儀器 Trizol(美國，Invitrogen)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本、TAKARA)、熒光定量PCR試劑盒(日本、TAKARA)、ANGPTL3試劑盒(美國，UCL)、普通PCR儀(德國，Biometra)、Roche 480型Real-time PCR儀(瑞士，Roche)、ELx800全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國，BioTek)、7020全自動(dòng)生化儀(日本，日立)。

1.3 方法 (1)血清miR-135b水平檢測，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測受試者血清miR-135b水平，miR-135b上游引物序列：5′-CCTGGCTTTTCATTCCTATGTGA-3′，下游引物序列：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′，U6上游引物序列：5′-GCTTCGGCAGCCACATATACTAAA-3′，下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAA-TTTGCGT-3′，Trizol提取總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板設(shè)計(jì)qRT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，采用2-ΔΔCT方法計(jì)算血清miR-135b相對表達(dá)量；(2)血清ANGPTL3水平檢測，采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清ANGPTL3水平，實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說明書操作；(3)血脂指標(biāo)檢測，采用全自動(dòng)生化儀檢測受試者血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)水平；(4)Gensini積分，應(yīng)用冠狀動(dòng)脈造影測量左主干、前降支、回旋支及右冠狀動(dòng)脈管腔內(nèi)徑，無狹窄記0分，<25%記為1分，25%～50%記為2分，51%～75%記為4分，76%～90%記為8分，91%～99%記為16分，完全狹窄記為32分，最終積分為各冠脈分支積分之和，得分越高，冠狀動(dòng)脈狹窄程度越嚴(yán)重。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者血清miR-135b、ANGPTL3水平比較 研究組患者血清miR-135b、ANGPTL3水平均明顯高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組受試者血清miR-135b、ANGPTL3水平比較

2.2 兩組受試者血脂指標(biāo)比較 研究組患者血清TC、TG、LDL-C水平均顯著高于對照組(P<0.05)，HDL-C水平低于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 兩組受試者TC、TG、LDL-C及HDL-C水平比較

2.3 不同冠狀動(dòng)脈狹窄程度血清miR-135b、ANGPTL3水平比較 根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果將患者分為低危組(Gensini積分≤20分)、中危組(21分≤Gensini積分<60分)、重危組(Gensini積分≥60分)，重危組、中危組患者血清miR-135b、ANGPTL3水平高于低危組(P<0.05)，重危組高于中危組(P<0.05)，見表3。

表3 不同冠狀動(dòng)脈狹窄程度血清miR-135b、ANGPTL3水平比較

2.4 冠心病患者血清miR-135b、ANGPTL3水平與血脂指標(biāo)相關(guān)性 冠心病患者血清miR-135b與TC、TG、LDL-C呈正相關(guān)(P<0.05)，與HDL-C呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；血清ANGPTL3水平與TG、LDL-C呈正相關(guān)(P<0.05)，與HDL-C呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與TC無相關(guān)性(P>0.05)，見表4。

表4 冠心病患者血清miR-135b、ANGPTL3水平與血脂指標(biāo)相關(guān)性

2.5 冠心病患者血清miR-135b、ANGPTL3及Gensini積分之間關(guān)系 冠心病患者血清miR-135b表達(dá)與ANGPTL3、Gensini積分[(53.81±15.48)分]呈正相關(guān)(r=0.473，P=0.000；r=0.301，P=0.001)，見圖1、2；ANGPTL3表達(dá)與Gensini積分呈正相關(guān)(r=0.483，P=0.000)，見圖3。

圖1 冠心病患者血清miR-135b與ANGPTL3表達(dá)相關(guān)性

圖2 冠心病患者血清miR-135b與Gensini積分表達(dá)相關(guān)性

圖3 冠心病患者血清ANGPTL3與Gensini積分表達(dá)相關(guān)性

3 討論

冠心病是嚴(yán)重威脅全球人類健康的重要疾病之一，其防治在全球范圍內(nèi)仍是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)，有調(diào)查報(bào)道，至2030年，冠狀動(dòng)脈疾病將成為全球四大死亡原因之一[6]。冠心病的致病因素多而復(fù)雜，與飲食、飲酒、高血壓、糖尿病、凝血功能異常及遺傳等因素相關(guān)[7]。冠狀動(dòng)脈狹窄程度對患者預(yù)后十分重要，冠狀動(dòng)脈造影是冠心病診斷金標(biāo)準(zhǔn)，能較精確的評估患者動(dòng)脈狹窄程度，但其費(fèi)用較高，具有輻射危害，且造影劑的使用也可引起一定不良反應(yīng)。因此，尋找與冠狀動(dòng)脈狹窄密切相關(guān)的檢測指標(biāo)，對提高冠心病患者預(yù)后有重要臨床意義。

miRNA是近年來研究的熱點(diǎn)，在個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡及疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在脂質(zhì)代謝及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展過程中起著重要作用。Ren等[8]研究發(fā)現(xiàn)，mir-330能通過調(diào)控WNT信號通路靶向作用于絲裂原激活蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，其過表達(dá)可抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。王玲等[9]研究，mir-24在冠心病血漿中低表達(dá)，并與Gensini積分呈負(fù)相關(guān)，其高表達(dá)對冠狀動(dòng)脈起到一定保護(hù)作用。miR-135b為新發(fā)現(xiàn)的miRNA，在糖尿病、結(jié)腸腺癌、骨肉瘤等疾病中異常表達(dá)[10]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，研究組患者血清miR-135b水平明顯升高，提示miR-135b在冠心病患者血清中過表達(dá)。ANGPTL3是一種分泌型蛋白質(zhì)，在人體內(nèi)主要表達(dá)于肝臟，其蛋白分子中的氨基端的螺旋樣結(jié)構(gòu)域可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，而羧基端的纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域參與血管生成[11]。Olkkonen等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在心血管疾病中以ANGPTL3為治療靶點(diǎn)，對動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病有良好治療效果。本研究結(jié)果顯示，研究組患者血清ANGPTL3水平明顯高于對照組，與Stitziel等[13]研究結(jié)果相似，提示冠心病患者血清ANGPTL3水平升高。冠心病患者通常表現(xiàn)為血脂異常，TC、TG、LDL-C、HDL-C是重要的血脂指標(biāo)，TC、TG易受飲食影響，對冠心病預(yù)測價(jià)值較小，而LDL-C可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生，其水平降低可降低冠心病發(fā)病率，HDL-C是抗動(dòng)脈粥樣硬化的脂蛋白，為冠心病保護(hù)因子[14-15]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，研究組患者TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，提示冠心病患者存在血脂異常現(xiàn)象。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，重危組、中危組患者血清miR-135b、ANGPTL3水平高于低危組，重危組高于中危組，提示血清miR-135b、ANGPTL3水平隨著冠心病患者冠狀動(dòng)脈狹窄程度升高而升高。Su等[16]研究報(bào)道，在心血管疾病小鼠模型中，ANGPTL3失活可明顯降低TG、LDL-C水平，減輕動(dòng)脈粥樣硬化病變大小，改善血脂異常，降低心血管疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果顯示，冠心病患者血清miR-135b與TC、TG、LDL-C呈正相關(guān)，與HDL-C呈負(fù)相關(guān)，血清ANGPTL3水平與TC、LDL-C呈正相關(guān)，與HDL-C呈負(fù)相關(guān)，與Xu等[17]研究結(jié)果相似，提示miR-135b、ANGPTL3可能通過調(diào)控血脂水平參與冠心病發(fā)生、發(fā)展。最后研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-135b表達(dá)與ANGPTL3、Gensini積分呈正相關(guān)，ANGPTL3表達(dá)與Gensini積分呈正相關(guān)，提示miR-135b、ANGPTL3與冠狀動(dòng)脈狹窄程度相關(guān)，兩者可能通過協(xié)同作用參與冠心病進(jìn)展過程。TC、TG、LDL-C水平升高可促進(jìn)冠心病患者動(dòng)脈斑塊形成，加重患者冠狀動(dòng)脈狹窄程度，miR-135b、ANGPTL3可能通過協(xié)同作用調(diào)控表達(dá)TC、TG、LDL-C、HDL-C表達(dá)參與冠心病發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者血清miR-135b、ANGPTL3均高表達(dá)，兩者表達(dá)呈正相關(guān)，并與血脂指標(biāo)、Gensini積分相關(guān)，可能成為冠狀動(dòng)脈狹窄程度判定的輔助檢測指標(biāo)。但本研究尚存不足之處，如樣本量納入較少，為單中心研究，有待擴(kuò)大樣本量、開展多中心研究進(jìn)一步探討miR-135b、ANGPTL3在冠心病中作用機(jī)制，為其臨床治療帶來新突破。