成鏡 李季 戴雪梅 徐正偉 周權(quán)男 黃天帶 黃關(guān)青

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地?海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/熱帶林木種子種苗工程中心海南海口571101)

巴西橡膠樹（Hevea brailiensis）是大戟科（Euphorbiaceae）橡膠樹屬（Hevea）多年生異花授粉喬木，廣泛種植于熱帶地區(qū)。其所產(chǎn)生的膠乳是重要的工業(yè)原料和戰(zhàn)略物資，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有舉足輕重的地位［1］。橡膠樹種苗從傳統(tǒng)的種子苗發(fā)展到芽接苗，再到目前的橡膠樹組培苗（橡膠樹自根幼態(tài)無性系）。橡膠樹組培苗是通過花藥和內(nèi)珠被等外植體進(jìn)行胚性愈傷組織誘導(dǎo)和體細(xì)胞胚發(fā)生獲得初生體胚，再以初生體胚為外植體，通過胚到胚的循環(huán)次生體胚發(fā)生繁殖體細(xì)胞胚，最后誘導(dǎo)次生胚植株再生來獲得［2］。

在橡膠樹組織培養(yǎng)過程中，污染問題一直伴隨著組織培養(yǎng)過程，污染率的高低不僅影響植株組織培養(yǎng)的效率，更影響組培苗生產(chǎn)成本的高低。PTC3（Plant Tissue Culture Contamination Control）和植物組培抗菌劑（Plant Preservative Mixture， PPM）是一種廣譜抗微生物劑，可以殺死細(xì)菌和真菌細(xì)胞，防止真菌孢子的萌發(fā)，并在較高濃度下能消除內(nèi)源性污染的外植體。PPM 應(yīng)用于甘薯試管苗的移栽煉苗過程，對(duì)甘薯試管苗煉苗期的培養(yǎng)基防污染有一定抑制效果［3］。

針對(duì)橡膠樹組織培養(yǎng)過程中存在的污染問題，很多學(xué)者進(jìn)行過相關(guān)研究。秦云霞等［4］發(fā)現(xiàn)苯甲酸鈉和山梨酸鉀以及益生菌哈茨木霉菌株13-3-2可以用于降低污染率。添加3%的苯甲酸鈉或山梨酸鉀的培養(yǎng)基可有效防止細(xì)菌及部分真菌（包括黑曲霉）污染；在后期馴化練苗過程中，接種的哈茨木霉菌13-3-2 可有效殺死多種污染真菌，使污染苗的成活率提高43%以上。另外使用40%福星乳油對(duì)粗糙脈孢霉菌的抑制效果最好，其EC50最?。黄浯螢?0%甲基托布津可濕性粉劑；50%撲海因可濕性粉劑，99%惡霉靈可濕性粉劑，50%敵磺鈉可濕性粉劑對(duì)其的殺菌效果均一般，50%多菌靈可濕性粉劑無效［5］。黃天帶等［6］為了降低橡膠樹帶芽莖段的污染率，使用1 g/L 多菌靈和800 mg/L羧芐青霉素鈉、500 mg/L噻孢霉素混合后處理外植體，真菌污染率下降了55.29%，細(xì)菌污染率下降了4.58%。

姜澤海等［7］為了降低大田中橡膠樹新生樹根的污染率，在常規(guī)消毒前先采用1 g/L 多菌靈對(duì)外植體處理2.5 h，再用75%乙醇消毒30 s 及0.1%HgCl2消毒6 min，然后接種到添加0.1%益培隆的固體愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30 d 后外植體污染率下降至44.59%，存活率達(dá)25.60%。

以上研究的對(duì)象分別為完整的橡膠樹組培苗、帶芽莖段、橡膠樹新生跟，研究階段為植株再生階段、啟動(dòng)培養(yǎng)階段、愈傷誘導(dǎo)階段，而沒有對(duì)橡膠樹次生體胚發(fā)生過程中存在的污染及其對(duì)次生體胚發(fā)生效率的影響進(jìn)行研究。本研究旨在通過使用2種新型的抑菌劑研究其對(duì)橡膠樹次生體胚發(fā)生過程中存在的污染的防治效果及其對(duì)次生體胚發(fā)生效率的影響，以便為后期橡膠樹組培苗生產(chǎn)提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物組培抗菌劑PTC3（品牌：PhytoTechnology，北京西美杰科技有限公司）和植物組培抗菌劑（Plant Preservative Mixture， PPM）PPM（上海翊圣生物）。

紅青霉菌是從污染的平板上分離并進(jìn)行形態(tài)和測(cè)序鑒定。污染平板來自于本單位橡膠樹組培苗生產(chǎn)工作室。

橡膠樹次生體胚發(fā)生的材料和方法參考華玉偉等［2］方法。

1.2 方法

1.2.1 真菌基因組DNA提取方法及ITS序列擴(kuò)增

除了進(jìn)行形態(tài)鑒定外，還克隆所分離污染菌的tef1 序列，系統(tǒng)進(jìn)化分析從而鑒定其類別。以CTAB 法提取病菌的基因組DNA，以真菌通用引物Ef728 （5'-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3'） 和Tefla（5'-GCCATCCTTGGGAGATACCAGC-3'） 為 引 物 進(jìn) 行PCR 擴(kuò)增。經(jīng)過PCR 產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化及菌落PCR 鑒定后送公司測(cè)序。登錄NCBI，將所得序列進(jìn)行序列相似性比對(duì)，并下載相應(yīng)基因序列，用lasergene軟件進(jìn)行對(duì)位排列，構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。

1.2.2 兩種抑菌劑不同濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

取經(jīng)28?C 培養(yǎng)4 d 的菌株，加5 mL 無菌水洗下霉菌孢子，依次10 倍稀釋為10?3，使孢子數(shù)約為103個(gè)/mL。分別取0.2 mL 孢子懸浮液與20 mL LDA培養(yǎng)基混勻到平板，28℃遮光培養(yǎng)48 h 后備用。在配制1/2 PDA+5 g 酵母粉固體培養(yǎng)基時(shí)，分別加入PTC3和PPM2 種抑菌劑，使其濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL/L 和0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95 mL/L的含藥培養(yǎng)基，對(duì)照為不加藥的培養(yǎng)基，高溫高壓滅菌備用。用打孔器（直徑10 mm）從備用平板中打取菌餅（將培養(yǎng)好的病原菌，在無菌條件下用直徑10 mm 的無菌打孔器，自菌落邊緣切取菌餅，用接種器將菌餅接種于含藥平板中央，菌絲面朝下，蓋上皿蓋，置適宜溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。），菌絲面朝下接種于含藥培養(yǎng)基中央，每個(gè)平板加一個(gè)菌餅，3 次重復(fù)，28℃遮光培養(yǎng)，每2天取出測(cè)量菌落直徑（用卡尺測(cè)量菌落直徑，單位為mm。每個(gè)菌落用十字交叉法垂直測(cè)量直徑各一次，取其平均值。）

生長(zhǎng)抑制率=［（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）-（處理菌落直徑-菌餅直徑）］/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）×100%

1.2.3 不同抑菌劑濃度對(duì)橡膠樹次生體胚發(fā)生的影響

分別設(shè)置PTC3濃度（0.2、0.4、0.6、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL/L） 和PPM 濃 度（0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95 mL/L），每個(gè)濃度為一個(gè)處理，每個(gè)處理接種10 皿，每皿接種7 個(gè)胚塊外植體，重復(fù)3 次。所用培養(yǎng)基采用華玉偉等文獻(xiàn)［2］中的培養(yǎng)基，在25℃下，暗培養(yǎng)30 d 后，統(tǒng)計(jì)污染情況、出胚愈傷數(shù)、正常胚愈傷數(shù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用Excell 2003 軟件，序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析使用Lasergene軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離及鑒定橡膠樹組培的超強(qiáng)污染源

根據(jù)污染源出現(xiàn)的頻率和污染源在培養(yǎng)基上的表型，挑取了組培中常見的污染源進(jìn)行分離接種，命名為y3。tef1 擴(kuò)增片段大小約為610 bp，利用NCBI blast 進(jìn)行序列比較，發(fā)現(xiàn)序列相似性為98%～100%。下載同源基因的fasta 序列，利用軟件Lasergene 軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，采用Neighbor-Joining 方法進(jìn)行聚類分析，進(jìn)行1 000次bootstrap 統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，y3 與Penicillium rubens紅青霉歸為一類（圖1）。

圖1 污染真菌ITS 序列的進(jìn)化分析

2.2 兩種抑菌劑對(duì)污染菌的拮抗作用。

從表1 中可以看出，培養(yǎng)2 d，當(dāng)PTC3抑菌劑濃度為1.0 mL/L 時(shí)，對(duì)真菌的生長(zhǎng)抑制率為18.1%。隨著濃度的增加，生長(zhǎng)抑制率逐漸降低。培養(yǎng)5 d 時(shí)，PTC3抑菌劑濃度為1.6 mL/L 時(shí)，對(duì)真菌的生長(zhǎng)抑制率為22.3%。隨后，隨著抑菌劑濃度的增加呈滑坡勢(shì)下降。

表1 PTC3對(duì)菌株生長(zhǎng)抑制率的影響

從表2 可以看出，培養(yǎng)2 d 時(shí)，PPM 抑菌劑濃度為0.6、0.65、0.7、0.85、0.95 mL/L 時(shí)，對(duì)真菌的生長(zhǎng)抑制率分別為18.6%、17.4%、17.2%、19.2%、16.3%。培養(yǎng)5 d 時(shí)，所有抑菌劑濃度處理對(duì)真菌均沒有生長(zhǎng)抑制作用。

2.3 不同抑菌劑濃度對(duì)橡膠樹次生體胚發(fā)生效率的影響

從表3 可以看出，隨著PTC3抑菌劑濃度的增加污染率呈下降趨勢(shì)。出胚率隨著抑菌劑濃度的增加呈先下降，后緩慢增加的趨勢(shì)。正常胚率隨著抑菌劑濃度的增加有逐漸增加的趨勢(shì)。有效率隨著PTC3抑菌劑濃度的增加呈逐漸升高再降低的趨勢(shì)。當(dāng)PTC3抑菌劑濃度為1.6 mL/L 時(shí)，污染率為10%、出胚率為30%、正常胚率為20.0%、有效率為7.3%。與對(duì)照（CK）相比，污染率降低了36.7%、出胚率降低了14.6%、正常胚率增加了14.7%、有效率增加了6.4%。

表2 PPM對(duì)菌株生長(zhǎng)抑制率的影響

表3 PTC3對(duì)橡膠樹次生體胚發(fā)生效率的影響

從表4 可以看出，污染率隨著PPM 抑菌劑濃度的增加呈逐漸降低的趨勢(shì)，出胚率、正常胚、有效率隨著PPM抑菌劑濃度的增加呈先升高再降低的趨勢(shì)，當(dāng)PPM 抑菌劑濃度為0.65 mL/L 時(shí)，污染率為9.3%、出胚率為33.6%、正常胚率為7.4%、有效率為2.8%。與對(duì)照（CK）相比污染率降低37.4%、出胚率增加18.1%、正常胚率降低了1.9%、有效率增加了1.9%。

表4 PPM對(duì)橡膠樹次生體胚發(fā)生效率的影響

3 討論與結(jié)論

植物組織培養(yǎng)中，污染問題一直是伴隨著組織培養(yǎng)發(fā)生的，培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)室空氣質(zhì)量、起始培養(yǎng)材料、滅菌程序、無菌操作、培養(yǎng)容器的密封情況等因素都會(huì)引起組培過程中污染的發(fā)生。本研究通過單菌分離及分子鑒定結(jié)果表明：紅青霉菌是橡膠樹組織培養(yǎng)中常見的污染菌。

從PTC3和PPM 抑菌劑對(duì)紅青霉菌的生長(zhǎng)抑制率來看，PTC3的抑菌效果較PPM 稍好。但總體上2 種抑菌劑對(duì)紅青霉菌的生長(zhǎng)抑制率較低，培養(yǎng)2 d，當(dāng)PTC3抑菌劑濃度為1 mL/L時(shí)，對(duì)真菌生長(zhǎng)抑制率為18.1%。培養(yǎng)5 d，PTC3抑菌劑濃度為1.6 mL/L時(shí)，對(duì)真菌生長(zhǎng)抑制率為22.3%。培養(yǎng)2 d 時(shí)，PPM抑菌劑濃度為0.6、0.65、0.7、0.85、0.95 mL/L時(shí)，對(duì)真菌的生長(zhǎng)抑制率分別為18.6%、17.4%、17.2%、19.2%、16.3%。培養(yǎng)5 d 時(shí)，所有濃度處理均沒有抑菌效果。2 種抑菌劑對(duì)紅青霉菌的生長(zhǎng)抑制率均較低，可能是因?yàn)樗褂玫臐舛染^低。在今后的研究中應(yīng)該增加這2 種抑菌劑的使用濃度。

從2種抑菌劑對(duì)橡膠樹次生體胚發(fā)生效率的影響研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PTC3抑菌劑濃度為1.6 mL/L時(shí)，污染率為10%、出胚率為30%、正常胚率為20.0%、有效率為7.3%。與對(duì)照（CK）相比，污染率降低了36.7%、出胚率降低了14.6%、正常胚率增加了14.7%、有效率增加了6.4%。當(dāng)PPM 抑菌劑濃度為0.65 mL/L 時(shí)，污染率為9.3%、出胚率為33.6%、正常胚率為7.4%、有效率為2.8%。與對(duì)照（CK）相比，污染率降低37.4%、出胚率增加18.1%、正常胚率降低了1.9%、有效率增加了1.9%。

在組織培養(yǎng)中，控制污染是要亟待解決的問題，但是，不能因?yàn)槭褂靡志鷦?duì)植物材料的生長(zhǎng)產(chǎn)生不良影響。從2種抑菌劑對(duì)橡膠樹次生體胚發(fā)生效率的影響來看，PTC3和PPM 均有降低污染率和促進(jìn)體胚有效率增加的作用，PTC3相對(duì)于PPM 的效 果 稍 好 一 些。為 探 究 煙 草［8］、白 菜［9］、藍(lán)莓［10］、馬鈴薯［11-12］鐵皮石斛［13］開放式組織培養(yǎng)中抑菌劑對(duì)組織培養(yǎng)的影響，使用了卡那霉素、頭孢霉素、多菌靈和次氯酸鈉、生物農(nóng)藥大蒜素與化學(xué)農(nóng)藥代森錳鋅、50%多菌靈可濕性粉劑、70%代森猛鋅可濕性粉劑、YI-1、57.6%冠菌清干粒劑、50%撲海因懸浮劑、75%百菌清可濕性粉劑、組菌清、植培靈、菌殺光、甲基托布津等抑菌劑，效果因物種和抑菌劑組合和使用濃度而異。除了在商業(yè)化組織培養(yǎng)中使用抑菌劑，在茶樹［14］轉(zhuǎn)化體系中使用2種抑菌劑表明，頭孢噻肟鈉和羧芐青霉素明顯降低茶樹外植體的成活率和增殖率，且呈濃度依賴效應(yīng)；低濃度特美汀（對(duì)茶樹外植體的生長(zhǎng)和增殖都沒有明顯影響，并能完全抑制發(fā)根農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，故特美汀在茶樹遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用有望提高茶樹的遺傳轉(zhuǎn)化效率。所以在使用抑菌劑的同時(shí)應(yīng)該考慮對(duì)外植體生長(zhǎng)的影響，否則就會(huì)本末倒置，得不到理想的結(jié)果。在組織培養(yǎng)過程中，污染菌并不是單一的菌種，可能是由一種或多種菌組成，所以，在今后的研究中應(yīng)該將抑菌劑進(jìn)行組合應(yīng)用，這樣防治污染的效果可能會(huì)更好。另外，為了不對(duì)植物組織培養(yǎng)過程產(chǎn)生不良影響，應(yīng)使用安全、專一、植物源的抑菌劑。

植物組織培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域，在組培中存在經(jīng)費(fèi)投入多、能源消耗量大、無菌操作需要大量技術(shù)人員等現(xiàn)狀。為了進(jìn)一步降低組培成本、簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，在組培環(huán)節(jié)中應(yīng)考慮在外植體消毒、培養(yǎng)基支撐物替代與循環(huán)利用、應(yīng)用抗菌劑和抑菌劑抑制培養(yǎng)基及培養(yǎng)物污染、采用自然光照和大棚溫度來代替組培日光燈光照等方面進(jìn)行探索和研究，為降低植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)成本、節(jié)能降耗提供理論支撐［15］。