阿里木江·阿不都熱依木 林 峰 王皓潔 李 鑫 趙一霖 劉更新 詹江華 賈金富

膽道閉鎖(biliary atresia,BA)是一種由肝外膽管梗阻引起的嚴(yán)重肝膽疾病，以進(jìn)行性肝纖維化為特征，最終可導(dǎo)致肝硬化，其病因復(fù)雜，至今仍未明確[1]。肝門(mén)空腸吻合術(shù)(Kasai術(shù))是有效的治療方式，如果不治療，患者很快進(jìn)展為終末期肝硬化，可危及生命[2]。然而，術(shù)后仍有部分患者因進(jìn)行性肝纖維化導(dǎo)致肝硬化而需肝移植[3,4]。因此，BA患者不可抑制的肝纖維化是治療的重中之重，迄今為止，其纖維化的病理機(jī)制仍處探索之中。前期研究表明Notch信號(hào)通路與BA肝纖維化有一定關(guān)系，但具體機(jī)制尚不完全清楚[5]。鑒于BA患者肝臟發(fā)生持續(xù)性的炎性纖維化，Notch信號(hào)通路的Delta樣配體4可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的活化[6,7]，本文將探究Notch信號(hào)通路活化及相關(guān)炎性反應(yīng)分子機(jī)制在膽道閉鎖肝纖維化進(jìn)展中的作用。

材料與方法

一、臨床資料

選取2019年1月至2020年11月于天津市兒童醫(yī)院經(jīng)膽道造影及肝活檢確診為Ⅲ型BA、并行Kasai術(shù)及肝活檢術(shù)的15例BA患者的肝臟活檢組織(BA組)進(jìn)行研究，15例中男8例，女7例，年齡1～4個(gè)月。因先天性膽總管擴(kuò)張(congenital biliary dilatation,CBD)和BA患者都需手術(shù)引流膽汁，但臨床預(yù)后截然不同。故選擇同時(shí)期于本院行膽管空腸吻合術(shù)及肝活檢術(shù)的1歲以內(nèi)CBD患者肝活檢組織作為對(duì)照組(CBD組)，其中男2例，女3例，年齡為2～6個(gè)月。兩組患者年齡和性別分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。根據(jù)Ohkuma’s分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將纖維化Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)分為輕度肝纖維化組，纖維化Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)視為重度肝纖維化組，其中輕度肝纖維化5例，重度纖維化10例。

所有活檢樣本均進(jìn)行福爾馬林固定后用石蠟包埋保存?zhèn)溆?。本臨床研究通過(guò)天津市兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)：L202011)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 主要試劑：Anti-HES-1、Anti-IL-6及二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidin,DAB)顯色液，均購(gòu)自北京博奧森試劑有限公司；Anti-CD163及枸櫞酸鈉緩沖液均定購(gòu)于北京中杉金橋試劑有限公司；Anti-PDGF-AA購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Celplor公司。

2. Masson染色：將收集的患者肝組織進(jìn)行石蠟包埋后連續(xù)切成4 μm的薄片，二甲苯脫蠟后經(jīng)梯度酒精至蒸餾水，切片至蘇木精水溶液中染色5 min，酸水及氨水中分色，流水沖洗后，Masson 麗春紅染色5 min，以2%冰醋酸水溶液浸洗1 s，1%磷鉬酸水溶液分化3 min，苯胺藍(lán)染5 min。以0.2%冰醋酸水溶液浸洗1 s，脫水透明后封片。

請(qǐng)兩位專業(yè)病理科醫(yī)師在光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果，膠原纖維呈藍(lán)色，胞漿、肌肉呈紅色，胞核黑藍(lán)色。根據(jù)Ohkuma’s分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行纖維化分級(jí)。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)為無(wú)纖維化；Ⅰ級(jí)為肝匯管區(qū)輕度纖維化；Ⅱ級(jí)為伸向鄰近門(mén)管區(qū)的輕度橋接纖維化；Ⅲ級(jí)為伸向鄰近門(mén)管區(qū)的重度橋接纖維化；Ⅳ級(jí)為有假小葉形成。

3. 免疫組化 所有患者的石蠟切片脫蠟后進(jìn)行抗原修復(fù)，室溫下羊血清封閉抗原30 min，滴加一抗后，4℃孵育過(guò)夜，取出后恢復(fù)室溫，PBS緩沖液沖洗震蕩3次，滴加二抗，室溫下孵育30 min，PBS緩沖液沖洗震蕩3次后進(jìn)行DAB顯色，鏡下控制顯色。顯色滿意后，用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

染色結(jié)束后在光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果，以黃棕色、棕褐色為陽(yáng)性。先于40倍鏡下觀察每張切片陽(yáng)性區(qū)域，后調(diào)整至200倍鏡下選擇5個(gè)不同視野拍照取圖。最后采用Image-Pro-Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，結(jié)果以陽(yáng)性面積的平均光密度值(average optical density,AOD)來(lái)表示(AOD=肝組織陽(yáng)性細(xì)胞光密度總和/陽(yáng)性面積)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、免疫組化染色結(jié)果

1. Notch信號(hào)通路效應(yīng)分子HES-1的表達(dá) ：HES-1在兩組肝活檢組織中的肝細(xì)胞胞漿及膽管細(xì)胞的胞漿、胞核均有表達(dá)，尤其以膽管細(xì)胞核為主。隨著肝纖維化程度的加重，匯管區(qū)的炎性細(xì)胞大量聚集，其周圍的肝細(xì)胞核呈現(xiàn)弱陽(yáng)性或陽(yáng)性。與CBD組相比，BA組的肝組織中HES-1的表達(dá)更強(qiáng)(圖1)。

2. CD163的表達(dá)：CD163在兩組肝組織的肝竇內(nèi)巨噬細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，匯管區(qū)部位CBD組有少量陽(yáng)性表達(dá)，BA組呈明顯強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖2)。

3. IL-6與PDGF-AA的表達(dá)：IL-6在鏡下呈分泌型蛋白特征，在肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞、炎性細(xì)胞胞漿中均有表達(dá)，且BA組的表達(dá)高于CBD組，在BA亞組中，纖維化嚴(yán)重患者肝臟的表達(dá)更強(qiáng)(圖3)。在顯微鏡下觀察可見(jiàn)，BA組的肝組織分泌PDGF-AA量相較于CBD組明顯增加，膽管細(xì)胞的胞核呈明顯強(qiáng)陽(yáng)性，小葉間動(dòng)脈呈明顯強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖4)。

圖1 HES1在兩組患者肝活檢組織中的表達(dá)情況(×200倍鏡) 注 1A：CBD組； 1B：輕度肝纖維化BA組； 1C：重度肝纖維化BA組；黃色箭頭為HES1陽(yáng)性膽管細(xì)胞 圖2 CD163在兩組患者肝活檢組織中的表達(dá)情況 (×200倍鏡) 注 2A：CBD組； 2B：輕度肝纖維化BA組； 2C：重度肝纖維化BA組；黃色箭頭為CD163陽(yáng)性細(xì)胞 圖3 IL-6在兩組患者肝活檢組織中的表達(dá)情況 注 ×100(100倍鏡下)；×200(200倍鏡下)； 3A/A’：CBD組； 3B/B’：輕度肝纖維化BA組； 3C/C’：重度肝纖維化BA組。黃色箭頭是肝細(xì)胞胞漿中IL-6陽(yáng)性顆粒 圖4 PDGF-AA在兩組患者肝活檢組織中的表達(dá)情況 注 ×40(40倍鏡下)；×100(100倍鏡下)；×200(200倍鏡下)； 4A/A’：CBD組； 4B/B’：輕度肝纖維化BA組； 4C/C’：重度肝纖維化BA組；黃色箭頭是陽(yáng)性的膽管細(xì)胞，綠色箭頭是小葉間動(dòng)靜脈

二、免疫組化的半定量分析結(jié)果

1. 與CBD組相比，BA組的HES1、CD163、PDGF、IL-6的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組患者肝組織HES1、CD163、PDGF-AA、IL-6表達(dá)水平比較(x±s)Table 1 Comparing the expressions of HES1,CD163,PDGF-AA and IL-6 in liver tissues of two groups分組HES-1CD163PDGF-AAIL-6CBD0.044±0.0170.089±0.0200.155±0.0190.070±0.007BA0.143±0.0270.259±0.1110.220±0.0440.216±0.028t值-7.520-5.651-3.144-18.268P值<0.001<0.001 0.006<0.001

2. HES1的表達(dá)與CD163及PDGF-AA、IL-6的表達(dá)呈正相關(guān)，見(jiàn)圖5。

圖5 肝臟HES1與CD163、PDGF-AA、IL-6的表達(dá)相關(guān)性 注 AOD平均光密度值。(左)Pearson相關(guān)分析，M2巨噬細(xì)胞的聚集與HES-1呈正相關(guān)，r=0.687，P<0.01。(右)Pearson相關(guān)分析，M2巨噬細(xì)胞分泌的PDGF-AA、IL-6與HES-1呈正相關(guān)。r=0.629，P<0.0001，r=0.880，P<0.0001

3. HES1、CD163、PDGF-AA、IL-6的表達(dá)與纖維化程度呈明顯正相關(guān)，四種蛋白均隨著纖維化程度的加重而表達(dá)增加(表2)。

表2 不同肝纖維化程度下HES1、CD163、PDGF-AA、IL-6表達(dá)水平情況(x±s)Table 2 Expressions of HES1,CD163,PDGF-AA and IL-6 in different fibrotic degrees(x±s)肝纖維化程度HES-1CD163PDGF-AAIL-6無(wú)0.044±0.0170.089±0.0200.155±0.0190.070±0.007輕度0.113±0.0100.138±0.0230.174±0.0120.177±0.002重度0.157±0.0200.319±0.0830.243±0.0350.235±0.003rs值 0.920 0.912 0.887 0.920P值<0.001<0.001<0.001<0.001

討 論

膽道閉鎖是一種嚴(yán)重的炎癥性纖維化性肝膽疾病，其病理特征為肝內(nèi)膽管增生及不可逆轉(zhuǎn)的進(jìn)行性肝纖維化，以Ⅲ型閉鎖最為多見(jiàn)，且預(yù)后最差?；颊吲R床表現(xiàn)為膽汁淤積性黃疸、大便顏色變淺、尿色加深等。結(jié)合腹部超聲、肝功能指標(biāo)等輔助診斷手段，于腹腔鏡探查術(shù)中行膽管造影及肝活檢術(shù)可確診為BA[8]。肝門(mén)空腸吻合術(shù)雖可改善膽汁引流，但術(shù)后仍可能因肝纖維化進(jìn)行性加重，導(dǎo)致患者最終需行肝移植術(shù)以延續(xù)生命[9]。只有揭開(kāi)進(jìn)行性肝纖維化機(jī)制的神秘面紗，才有可能從根本上解決臨床治療難題。新近膽道閉鎖發(fā)病機(jī)制研究在炎癥細(xì)胞方面取得了重大突破，對(duì)B細(xì)胞的干預(yù)有可能抑制BA的疾病進(jìn)展[10]。本研究從Notch信號(hào)通路與肝臟炎性細(xì)胞的關(guān)系探究對(duì)BA肝纖維化的影響。

一、HES-1促進(jìn)膽道閉鎖肝纖維化進(jìn)展

Notch信號(hào)通路是膽道系統(tǒng)發(fā)育和肝纖維化相關(guān)的信號(hào)通路之一，膽管發(fā)育中的膽管板重塑和小管形成有賴于Notch信號(hào)通路的活化[11,12]。小兒肝膽畸形疾病中的Alagille 綜合征，大多是由于編碼Notch通路配體的Jag1基因或受體Notch 2存在致病性突變[13]。前期，本團(tuán)隊(duì)初步探究發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路元件Notch1、Jagged1等的異常活化參與了BA肝纖維化進(jìn)程，而HES-1是Notch信號(hào)通路下游主要的效應(yīng)分子，其作為核轉(zhuǎn)錄因子，在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中，輔助相應(yīng)的蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)[5]。有研究表明HES-1可直接參與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生，尤其在信號(hào)通路活化增強(qiáng)時(shí)，會(huì)增加α平滑肌動(dòng)蛋白(α-Smooth mucle actin,α-SMA)和Ⅰ型膠原α2的啟動(dòng)子活性，加劇膠原蛋白的積累，而選擇性地抑制HES-1或?qū)ES-1維持在合理水平,會(huì)降低α-SMA和Ⅰ型膠原α2的啟動(dòng)子活性[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，BA肝組織中HES-1的表達(dá)水平比對(duì)照組CBD患者明顯增高，說(shuō)明在同樣需要手術(shù)進(jìn)行膽汁引流的膽道畸形疾病中，Notch信號(hào)通路的活化程度在BA肝組織中更強(qiáng)。此外，根據(jù)Ohkuma’s分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，本研究納入的對(duì)照組CBD患者均未發(fā)生肝纖維化，而B(niǎo)A組患者均發(fā)生了不同程度的肝纖維化。相關(guān)性分析顯示Notch信號(hào)活化后的效應(yīng)分子HES-1的表達(dá)過(guò)高與肝纖維化程度呈正相關(guān)。由此可推測(cè)BA患者肝臟中Notch信號(hào)通路的異?；罨瘜?dǎo)致了HES-1的過(guò)度表達(dá)，累及細(xì)胞外基質(zhì)，從而加劇患者肝纖維化進(jìn)程。

二、M2型巨噬細(xì)胞在BA患者肝臟的累積與Notch通路活化相關(guān)

巨噬細(xì)胞是肝臟組織多種穩(wěn)態(tài)和病理反應(yīng)的關(guān)鍵組成部分，其在慢性肝損傷的發(fā)病機(jī)制中起核心作用，已被認(rèn)為是對(duì)抗纖維化的潛在靶點(diǎn)[15]。特定的環(huán)境信號(hào)決定了肝巨噬細(xì)胞的極化和功能。這些細(xì)胞可能促進(jìn)肝損傷或感染后組織完整性的恢復(fù)，也可能加快肝臟疾病的進(jìn)展[16]。本研究中免疫組化定位及半定量結(jié)果顯示，與CBD患者相比，CD163的表達(dá)在BA患者肝臟中明顯升高。CD163是M2型極化的巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物，即M2型巨噬細(xì)胞在發(fā)生肝纖維化的BA組聚集更加明顯，尤其在匯管區(qū)纖維增生部位。該結(jié)果與Yang等[17]對(duì)巨噬細(xì)胞的極化在BA肝纖維化的研究有相似之處，M1型巨噬細(xì)胞促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用更為明顯，M2型巨噬細(xì)胞抑制炎癥，促進(jìn)修復(fù)，但是M2型巨噬細(xì)胞加劇了肝纖維化的進(jìn)程。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，CD163與HES-1的表達(dá)水平呈正相關(guān)，即隨著肝纖維化程度的加重，HES-1與CD163的表達(dá)也隨之增加。有文獻(xiàn)報(bào)道，活化的巨噬細(xì)胞中Notch1和HES-1均被活化，進(jìn)而通過(guò)激活NF-kappa B調(diào)節(jié)參與炎癥反應(yīng)的基因表達(dá)模式，經(jīng)Notch1的抑制劑γ分泌酶抑制劑(gamma-secretase inhibitor,GSI)處理后，巨噬細(xì)胞分泌的腫瘤壞死因子α，IL-6及IL-10均受到影響[18]。說(shuō)明在BA患者肝臟中，Notch信號(hào)通路的活化參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能狀態(tài)。

三、巨噬細(xì)胞的功能狀態(tài)對(duì)BA肝臟的影響

單核巨噬細(xì)胞可分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)和血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factors,PDGFs)，介導(dǎo)肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)展[19-21]。PDGFs共有5種生物活性PDGF蛋白， 4種同源二聚體(PDGF-a,PDGF-b,PDGF-c和PDGF-d)，1種異源二聚體PDGF-ab，其中PDGF AA主要與PDGFR-αα結(jié)合，與細(xì)胞的增殖和趨化作用相關(guān)[22]。膽道閉鎖是一種炎癥持續(xù)存在的進(jìn)行性肝纖維化的肝膽疾病，而IL-6是持續(xù)炎癥伴發(fā)纖維化進(jìn)展的依賴性細(xì)胞因子，可由巨噬細(xì)胞分泌，反映慢性肝病患者炎癥狀態(tài)[23]。此外，IL-6可作為BA繼發(fā)肝硬化時(shí)肝臟硬化程度的生物標(biāo)志物[24]。本研究檢測(cè)到IL-6及PDGF-AA在BA組中表達(dá)明顯高于CBD組，且輕度和重度肝纖維化BA患者的HES-1與CD163的表達(dá)及IL-6和PDGF-AA的分泌量差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明在BA患者肝臟中，IL-6及PDGF-AA的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程，Notch信號(hào)對(duì)巨噬細(xì)胞有調(diào)節(jié)作用，而其分泌功能對(duì)BA肝纖維化起到促進(jìn)作用。與此相似的一項(xiàng)新近研究指出原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)患者外周血巨噬細(xì)胞中的Notch1、Notch3受體表達(dá)異常，且M2型與M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量比值與Notch受體表達(dá)水平呈線性相關(guān)[25]。成人PBC與嬰幼兒BA有一定的相似之處，肝臟小葉間膽管上皮細(xì)胞發(fā)生變性、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)引起的肝內(nèi)小膽管進(jìn)行性破壞伴門(mén)脈炎癥性改變，最終導(dǎo)致膽汁淤積性肝纖維化?？梢?jiàn)，Notch信號(hào)通路與巨噬細(xì)胞的密切聯(lián)系在促進(jìn)肝纖維化方面的確具有重要作用。

綜上所述，Notch信號(hào)通路的異常激活參與了膽道閉鎖肝纖維化進(jìn)程，肝臟M2型極化巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致促進(jìn)纖維化的炎性因子進(jìn)一步積累，促進(jìn)BA肝纖維化。但是，本研究還存在一定局限性，文中相關(guān)的分子表達(dá)情況只是提示Notch信號(hào)通路的異常參與BA的肝臟病理進(jìn)展，尚不能提供強(qiáng)有力的佐證，需要進(jìn)一步深入研究。為闡明該信號(hào)通路與BA肝纖維化機(jī)制的確切關(guān)系，還需進(jìn)行細(xì)胞及個(gè)體的干預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。目前，BA的發(fā)病機(jī)制在炎癥反應(yīng)方面取得了重大突破。本研究也提出Notch信號(hào)通路與巨噬細(xì)胞的交互作用，促進(jìn)BA肝纖維化進(jìn)程，未來(lái)將進(jìn)一步探究Notch信號(hào)通路活化對(duì)膽道閉鎖肝臟纖維化的影響。因此，Notch信號(hào)通路活化一方面可以調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的功能狀態(tài)，另一方面可能參與增生膽管細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，為進(jìn)一步揭示膽道閉鎖進(jìn)行性肝纖維化的發(fā)生機(jī)制提供新的方向。