朱瀟雨，李杰

0 引言

1 細胞焦亡機制

細胞焦亡目前較為確定的有兩條途徑，即經(jīng)典細胞焦亡途徑和非經(jīng)典焦亡途徑。經(jīng)典細胞焦亡途徑主要為：炎性小體→（激活）Caspase-1→（切斷）Gasdermin D蛋白（GSDMD）→（N端誘導）細胞焦亡。其中炎性小體包含有Caspase-1前體（Pro-Caspase-1）、模式識別受體（NLR家族（NOD-like receptors,NLRs）、黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2,AIM2）與Pyrin等及凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）。Caspase-1是經(jīng)典細胞焦亡中最具特點的部分，在非經(jīng)典途徑探索出來之前一直被認為是細胞焦亡所必需的。Caspase家族成員較多，熟知的Caspase-3可以誘導細胞凋亡，Caspase-1可以參與炎性反應誘導細胞焦亡[2]。GSDMD是2015年發(fā)現(xiàn)的與炎性Caspase相關的底物蛋白[3]，其被Caspase-1切斷后形成N端和C端，N端可以引起細胞焦亡，C端可以與N端結合抑制焦亡。非經(jīng)典細胞焦亡途徑主要為：細菌脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）→（結合）Cspase-4、Caspase-5和Caspase-11→（切斷）GSDMD→（N端誘導）細胞焦亡。2014年研究人員確認LPS可以直接通過結合Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11來誘導細胞焦亡，無需Caspase-1，因而被稱為非經(jīng)典細胞焦亡途徑[4]，見圖1。目前有研究也探索出細胞膜半通道蛋白Pannexin-1可開放自身通道參與到非經(jīng)典途徑中[5]。

2 腫瘤與細胞焦亡的關系

腫瘤發(fā)病原因較為復雜，但炎性反應可能是其相關因素，如長期慢性炎性反應可以導致局部組織異型增生從而發(fā)生癌變。目前研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中也可以存在炎性小體，并且這些小體有促進和抑制腫瘤生長的雙重作用[6-7]。由于炎性小體是引導Caspase-1進行細胞焦亡的關鍵分子，這可能是腫瘤細胞與焦亡關聯(lián)的重要節(jié)點。不同的腫瘤涉及的炎性小體不盡相同，如NLRP3在腫瘤細胞中廣泛存在[8]，與之相關的腫瘤有鼻咽癌[6]、結直腸癌[9]、肺腺癌[10]等。此外肝癌也與AIM2炎性小體相關[11]。雖然可以推定細胞焦亡與腫瘤相關，但其之間的關系卻比較復雜，研究顯示焦亡可以抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，但另一方面焦亡是促炎性死亡，也可以形成適合腫瘤細胞生長的微環(huán)境，從而促進腫瘤的生長。目前認為誘導腫瘤焦亡可以是一種潛在的癌癥治療新策略[12]。

圖1 細胞焦亡通路Figure 1 Pyroptosis pathway

3 腫瘤細胞焦亡相關誘發(fā)分子

可以誘導腫瘤細胞焦亡的分子較多，且在不同的腫瘤中作用并不一致。根據(jù)其臨床應用可大致分為化療藥物、其他藥物以及其他分子，見表1。

3.1 化療藥物

化療藥物對腫瘤尤其是廣泛期惡性腫瘤的治療一直占有重要地位，不同類型化療藥物發(fā)揮的作用靶點不同，隨著對細胞焦亡認識的深入，部分化療藥物可以誘導細胞焦亡得以證明。2017年發(fā)表于Nature上的一項研究證明，拓撲替康、伊立替康、依托泊苷、順鉑均可以引起Jurkat細胞、MeWo細胞的焦亡，而阿霉素及氟尿嘧啶可以引起HeLa細胞的焦亡，阿霉素、放線菌素d或拓撲替康可誘導NCI-H522細胞的焦亡，并指出這些途徑均通過Caspase-3、GSDMD誘發(fā)，且GSDMD的廣泛存在可導致化療時正常細胞的焦亡[34]。另有研究稱紫杉醇和順鉑可以引起肺癌A549細胞的焦亡，且順鉑引起肺癌細胞焦亡的能力比紫杉醇更強[13]。此外紫杉醇也可以誘導鼻咽癌細胞焦亡[33]。在結腸癌的治療上，洛鉑也被證實可以誘導HT-29和HCT116細胞的焦亡[24]。

表1 已知腫瘤細胞焦亡相關誘發(fā)分子Table 1 Known molecules that induce tumor cell pyroptosis

既往認為化療藥物誘導腫瘤細胞凋亡較多，但隨著對細胞焦亡認識的深入，部分原來被認為是凋亡的過程證實為焦亡。如有研究使用5-Fu處理胃癌細胞后，其細胞膜表現(xiàn)為腫脹破裂的焦亡特征，并揭示了GSDME將化療藥物誘導的Caspase-3依賴性細胞凋亡轉換為胃癌細胞的焦亡[23]，這對化療藥物作用的重新認識有提示作用。但組合治療誘導焦亡是否有利于改善患者的預后情況尚有爭議[35]。

細胞焦亡在一些認為可以給化療藥物增效的分子研究中也有所進展。如Polo樣激酶1（Pololike kinase 1,PLK1）抑制劑BI2536通過在食管鱗狀細胞癌中誘導細胞焦亡而增強順鉑的化學敏感度，順鉑配合BI2536在低劑量時即可誘導食管鱗狀細胞癌細胞發(fā)生焦亡[27]。真核生物延伸因子2激酶（eukaryotic elongation factor 2 kinase,eEF-2K）在阿霉素治療黑色素瘤細胞時也發(fā)揮了協(xié)同作用，并且觀察到抑制eEF-2K會抑制腫瘤細胞焦亡，eEF-2K間接增強阿霉素的抗腫瘤功效[36]。

另外關于化療藥物對正常機體損傷的研究也有一定進展。以往研究顯示阿霉素在臨床使用中受到心臟毒性的限制，而最新研究指出其誘導了心肌細胞焦亡，幸運的是該研究也指出了終末分化誘導非蛋白編碼RNA（terminal differentiation inducing non-protein coding RNA,TINCR）可以作為有希望的治療靶點，以克服化學療法對癌癥治療的心臟毒性[37]。

3.2 性質較確定的誘導物質

隨著細胞焦亡研究的深入，部分臨床與生活中的常見物質也被確定了具有誘導細胞焦亡尤其是腫瘤細胞焦亡的作用。

小腸：將胃處理后的樣品置于37℃，100 r/min繼續(xù)攪拌，用NaOH溶液將pH調為7.0.而后加入4 mL膽鹽提取物(46.87 mg/mL)，1 mL 110 mg/mL CaCl2溶液和1 mL 150 mM NaCl溶液.并用NaOH溶液將pH調至7.0.消化開始前，將1.5 mL新鮮制備的胰酶懸浮液(40 mg/mL)加入至上述混合液中.消化實驗過程中，將0.1 mol/L NaOH加入到消化體系中使得pH始終維持在7.0左右.消化試驗進行2 h，記錄消耗的NaOH體積.由于一分子的甘油三酯完全消化可產(chǎn)生兩分子的脂肪酸(FFA)，因此可以用如下公式計算:

細胞焦亡的發(fā)生與炎性小體關系密切，而炎性小體最早發(fā)現(xiàn)于感染性疾病中，較常見的為細菌感染。如食管細菌誘導產(chǎn)生NLRP3，從而導致Barrett食管上皮細胞焦亡，其中包括早期癌變的細胞[38]。有研究深入探究了細菌發(fā)揮促細胞焦亡作用的靶點，并提出鞭毛蛋白AN/C（FlaAN/C）抑制了活性氧的產(chǎn)生，降低了NLRP3的活性，并減少了Caspase-1依賴性細胞焦亡的發(fā)生[39]。一些細菌的內(nèi)容物同樣可以引起腫瘤細胞的焦亡，如嗜鹽假單胞菌TAC125的粗提物在抑制細胞增殖中最活躍，其主要成分為4-羥基苯甲酸（4-HBA），已被證實可以抑制A549肺癌細胞的增殖，而正常的肺上皮細胞（WI-38）不會影響細胞活力[19]。

病毒感染同樣可以誘導部分腫瘤細胞焦亡，但目前研究尚不深入，多處于探索狀態(tài)。如流感病毒感染可誘導正?；虬┣叭酥夤苌掀ぜ毎蛲龊徒雇?，也可誘導感染流感病毒的惡性腫瘤細胞凋亡，而且Lee等[40]發(fā)現(xiàn)Ⅰ型干擾素（IFN）介導的Janus激酶/信號轉導與轉錄激活子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT）信號通路可能通過誘導Bcl-xL抗凋亡基因的表達來抑制凋亡，從而促進了從凋亡向焦亡的轉換。但是否可以通過讓腫瘤細胞感染病毒來治療惡性腫瘤有待于進一步研究。

二甲雙胍的作用已經(jīng)不僅僅局限于調節(jié)血糖。近期研究證實了其可以誘導人食管癌細胞焦亡。Wang等[28]體內(nèi)和體外實驗均證實二甲雙胍通過靶向miR-497/脯氨酸-谷氨酸-亮氨酸富集蛋白1（PELP1）軸誘導人食管癌細胞焦亡。在食管鱗狀細胞癌（ESCC）晚期階段PELP1表達上調，這與癌癥進展和患者預后高度相關，而二甲雙胍治療可導致Gasdermin D介導的細胞焦亡。類似的研究還包括抗高血脂藥物辛伐他汀，其可在非小細胞肺癌（NSCLC）細胞系和異種移植小鼠模型中誘導細胞焦亡，辛伐他汀有可能作為NSCLC的新型治療劑[14]。

另有研究報道，人體所含的部分調節(jié)因子可能參與細胞的焦亡。如17β-雌二醇（E2）和雌激素受體（ER）信號轉導可預防肝細胞癌（HCC），E2誘導的NLRP3炎性小體的激活可以作為HCC進程的抑制劑，誘導肝癌細胞的焦亡[25]。肝X受體β（LXRβ）是核受體超家族基因的一名成員，與體內(nèi)膽固醇代謝密切相關，其與Pannexin1（新型縫隙連接蛋白Pannexin家族中的成員之一，它能夠在神經(jīng)、心血管等系統(tǒng)中廣泛表達并形成非選擇性的、大電導的半通道）結合導致NLRP3炎性小體的組裝以及ASC和Caspase-1的激活[41]，而這種激活可以特異性地誘導結腸癌細胞通過焦亡而死亡[42]。人臍帶間充質干細胞（HUCMSCs）療法是一種使用干細胞群誘導腫瘤細胞凋亡的新方法，而目前的研究證實了HUCMSCs的分泌因子可通過誘導細胞焦亡而導致乳腺癌細胞MCF7的死亡[43]。

中醫(yī)藥抗腫瘤的作用也逐步得到證實，尤其是單體分子的機制越來越清晰，通過某些中藥的抗腫瘤作用去反向推導相關抗腫瘤分子是較便捷的研究方法?；ǘ漕惖闹兴幤毡楹谢ㄇ嗨兀豁椦芯恳仓赋龌ㄇ嗨亟档土丝谇击[狀細胞癌細胞的活力并抑制了遷移和侵襲能力，在施用Caspase-1抑制劑后，花青素的作用大大減弱，而Caspase-1是細胞焦亡的關鍵分子，可以推測花青素可能通過Caspase-1誘導腫瘤細胞的焦亡而發(fā)揮抗腫瘤作用[31]。紅花等中藥含有查耳酮，Zhu等[17]實驗證實查耳酮通過調節(jié)ROS誘導腫瘤細胞焦亡，并在體內(nèi)實驗中表現(xiàn)出較好的安全性。地黃酮是從遠志（Polygala caudata）中提取的一種黃酮化合物，具有多種藥理活性，Chen等[44]研究小組探究了其與肝細胞癌的關系，并發(fā)現(xiàn)地黃酮顯著抑制肝癌細胞的增殖并誘導細胞死亡，還抑制了腫瘤細胞的遷移和侵襲，他們將其歸因于Caspase-2依賴性方式導致細胞焦亡。同樣能引起肝癌細胞焦亡的還有小檗堿[26]。陳皮中的川陳皮素可以降低線粒體膜電位，誘導活性氧生成來引起卵巢癌細胞的焦亡[33]。肺癌細胞焦亡研究也較多，現(xiàn)已證實的有中藥重樓中的成分重樓皂苷Ⅵ[15]，以及槐耳提取物[16]。中藥抗腫瘤作用已經(jīng)被廣泛證明，但其成分復雜，值得進一步挖掘。

此外，在ω-3脂肪酸可以調節(jié)炎性反應并發(fā)揮抗癌作用的基礎上，Pizato等[22]發(fā)現(xiàn)二十二碳六烯酸（DHA）處理的乳腺癌細胞觸發(fā)了Caspase-1和Gasdermin D激活的增加，并證實其誘導了乳腺癌細胞的焦亡。類似的營養(yǎng)物質還有鐵，一項關于黑色素瘤細胞焦亡的研究指出了鐵發(fā)揮了重要作用[29]。Li等[45]研究酒精性胃炎時發(fā)現(xiàn)，乙醇可能會引起細胞DNA損傷，激活Caspase-1，并促進IL-1β和IL-18的產(chǎn)生和釋放，可能會引起細胞焦亡。至于乙醇是否可以用來誘導腫瘤細胞焦亡也成為進一步探究的方向，如肝細胞癌使用無水乙醇介入治療后作用的發(fā)揮是否與乙醇誘導細胞焦亡相關。

3.3 新型誘導焦亡分子

新型藥物的研發(fā)常常需要探索功能未明的新型分子，而這些分子有部分也被證明了可以誘導腫瘤細胞焦亡的作用，但尚無商業(yè)化應用及確定的名稱。絲氨酸肽酶DPP8和DPP9（DPP8/9）的小分子抑制劑可以在單核細胞和巨噬細胞中誘導Caspase-1依賴性的焦亡[46]，而最新研究指出，DPP8/9抑制劑在大多數(shù)人類急性髓樣白血?。ˋML）細胞系和原發(fā)性AML樣品中誘導了腫瘤細胞的焦亡[30]。其有可能成為AML治療新型分子，并且可以嘗試在其他血液系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)腫瘤中應用。

有機單體成分較多也較混雜，目前可以誘導腫瘤細胞焦亡的有機單體有蓽茇酰胺類似物L50377、硫代吡喃衍生物L61H10、N-取代的EF24等，見圖2。蓽茇酰胺類似物L50377通過刺激非小細胞肺癌細胞中的活性氧（ROS）生成來促進細胞凋亡和細胞焦亡，而且ROS介導的NF-κB抑制可能為其主要作用機制[21]。硫代吡喃衍生物L61H10作用與蓽茇酰胺類似物L50377相仿，其在體內(nèi)外均表現(xiàn)出良好的抗肺癌細胞活性，也與NF-κB信號通路有關。重要的是L61H10在體外和體內(nèi)均無明顯的不良反應，擁有良好的應用前景[18]。N-取代的EF24可誘導肺癌A549細胞焦亡，有學者發(fā)現(xiàn)對N基13d取代可以助其成為高效、無害的肺癌候選藥物[20]。這些分子的研究多處于探索相關功能的層次，有待于進一步確認在臨床上應用的安全性與有效性，但可以提示細胞焦亡的新通路和新機制。

4 細胞焦亡對惡性腫瘤的治療作用

誘導細胞焦亡的物質分子不斷被發(fā)現(xiàn)，而如何利用好焦亡來消滅惡性腫瘤是研究中的難點問題，結合上述已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的誘導分子作用機制，我們提出了一些抗腫瘤作用的新策略。

4.1 細胞焦亡協(xié)同化療

4.1.1 協(xié)同化療增效 化療多基于劑量依賴來殺傷惡性腫瘤細胞，藥物劑量越大越容易取得較好的治療效果，但限制于患者自身體質、藥物毒性等因素，化療劑量常有上限，即使多周期化療后依舊可能有惡性腫瘤細胞殘存，最終導致復發(fā)與轉移，因此如何提高化療療效是改善患者預后的重要問題?；熕幬锟赏ㄟ^多種途徑誘導惡性腫瘤細胞凋亡，而如果同時誘導細胞焦亡與凋亡能增大單次化療對惡性腫瘤細胞的殺傷率，最終獲得更好的化療療效。

圖2 誘導焦亡的有機單體分子Figure 2 Organic monomer molecules that induce pyroptosis

目前，化療誘導惡性腫瘤細胞焦亡提高了殺傷活性已經(jīng)得到證實。有研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素（0～5 μmol/L）和順鉑（0～100 μmol/L）分別處理人惡性間皮瘤細胞系Hmeso，觀察到炎性小體NLRP3蛋白水平和Caspase-1水平隨著藥物濃度的升高而升高，細胞生存率可降低20%～30%[47]。細胞焦亡的啟動需要高水平表達的GSDME，而腫瘤細胞內(nèi)GSDME水平往往不滿足此條件，因此發(fā)生焦亡的比例較低，如52%的早期胃癌中存在低水平表達的GSDME[48]，但這也為化療增效提供了有利機會，即化療同時增強焦亡相關GSDME等表達，可起到化療增敏的作用。如DNA甲基轉移酶抑制劑地西他濱可以提高GSDME水平，將其與阿霉素聯(lián)用，可使人卵巢癌細胞系OVCAR-4的細胞死亡率從14%提高到40%[49]。最新研究揭示了化療藥物引起細胞焦亡的上游機制為BAK/BAX-Caspase-3-GSDME信號通路，更加明確了焦亡與化療未來的協(xié)同方向[50]。

4.1.2 逆轉化療耐藥 細胞焦亡可由細菌LPS誘發(fā)，最早探究焦亡與耐藥的關系可見于細菌感染中的抗生素耐藥，Liu等研究提出了一種通過注射GSDMD活性N端來治療抗生素耐藥菌的新思路，但細胞焦亡也會釋放出細菌，敲響免疫警報的化學信號，免疫警報過于強大能夠觸發(fā)敗血癥，幫助耐藥菌生存[51]。在惡性腫瘤中同樣發(fā)現(xiàn)焦亡相關GSDME的低表達會使黑色素瘤MeWo細胞獲得抗依托泊苷的耐藥性，激活腫瘤細胞焦亡有可能會使其對化療更加敏感[52]。同樣還有乳腺癌MCF-7細胞中GSDME高表達，因此推測其在MCF-7細胞中表達降低會導致MCF-7細胞獲得抗Taxol的耐藥性[34]。因此提高焦亡相關蛋白表達，增強惡性腫瘤細胞的焦亡有利于逆轉化療耐藥。

此外腫瘤微環(huán)境（TME）是支持腫瘤生長、促進耐藥發(fā)生的關鍵因素[53]?；熕幬餁⑺滥[瘤細胞起正面作用的同時也間接導致TME加速形成的負面作用，隨著化療進程的持續(xù)，TME支持的癌細胞獲得性耐藥發(fā)生率也在增加，可能導致負面作用強過正面作用，出現(xiàn)耐藥腫瘤細胞增殖率大于化療的殺傷率，從而導致化療耐藥甚至治療失敗。TME中包括多種基質細胞，它們通過釋放細胞因子來協(xié)助腫瘤細胞耐藥。因此誘導TME相關細胞焦亡可以逆轉微環(huán)境導致的耐藥性，但也要注意限制炎性因子釋放防止炎性環(huán)境有利于TME的維持。

總而言之，誘導惡性腫瘤細胞焦亡有利于化療的療效提升，但需注意焦亡后炎性因子的控制。首先，本文綜述的誘導焦亡的化療藥物可以通過配合提升焦亡蛋白表達在臨床中發(fā)揮更大的作用效能；其次是聯(lián)合抗TME形成的藥物。腫瘤微環(huán)境組成包括腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）、腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）以及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、白細胞介素-6（IL-6）等，在化療時加入抗CAFs生長、抗VEGF制劑可能會有更好療效。

4.2 機體代謝狀態(tài)影響惡性腫瘤細胞增殖

機體內(nèi)多種代謝相關激素均與細胞焦亡相關，而細胞焦亡是抑制惡性腫瘤細胞形成的一種保護機制，因此機體代謝狀態(tài)可能與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展有關。石漢平教授提出惡性腫瘤可視為一種代謝性疾病，在其代謝中產(chǎn)生大量氨基酸、核苷酸、脂肪酸以及細胞快速生長與增殖需要的其他中間產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物反過來服務于上述代謝通路，從而促進腫瘤生長、抑制腫瘤凋亡[54]。同理這些代謝產(chǎn)物也會抑制焦亡，如高血糖可激活還原型輔酶Ⅱ（NADPH）-氧化酶系統(tǒng)，導致ROS生成和NLRP3炎性反應小體活性上調激活炎性反應小體，導致細胞焦亡[55]。游離脂肪酸（free fatty acids,FFAs）水平升高被認為是肥胖的重要指標，已經(jīng)被證實作為損傷相關的分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）激活NLRP3炎性反應小體引起焦亡，也提示了高FFA水平可能更容易引起細胞焦亡[56]。而惡性腫瘤通過對微環(huán)境中糖類、脂肪等能量物質的消耗降低了自身的焦亡，從而加快增殖。因此在治療惡性腫瘤時改善微環(huán)境中的代謝狀態(tài)有利于消滅癌細胞，調節(jié)機體的代謝狀態(tài)也可能阻止癌細胞轉移。

另一大類促進腫瘤細胞焦亡的成分為代謝調節(jié)藥物如二甲雙胍、辛伐他汀等，它們發(fā)揮誘導腫瘤細胞焦亡及抗腫瘤機制很可能與調節(jié)代謝相關分子的促腫瘤作用相關。因此誘導腫瘤細胞焦亡可能是調節(jié)人體代謝藥物發(fā)揮抗癌作用的關鍵途徑，發(fā)掘此途徑是探索新型抗腫瘤藥物機制的重要方向。

治療惡性腫瘤中代謝的研究是目前的熱點之一，尤其是TME中代謝改變影響了免疫治療等療效[57]。細胞焦亡較容易隨著機體或局部代謝的改變而激活或抑制，因此通過調節(jié)代謝提高惡性腫瘤細胞的焦亡敏感度可能是未來的突破口之一。在惡性腫瘤治療中，首先應對腫瘤患者飲食等活動進行管理，通過調節(jié)其代謝活動從而協(xié)助其他抗腫瘤手段發(fā)揮。其次是抗腫瘤治療合理搭配二甲雙胍等藥物，提升腫瘤治療效果，改善預后。此外可以從此方向探索更多的調節(jié)代謝藥物的抗腫瘤效果，有助于新藥研發(fā)。

5 總結

細胞焦亡屬于細胞程序性死亡中較新的研究方向，其在腫瘤中發(fā)揮的作用也是目前研究的熱點。細胞焦亡的途徑已經(jīng)可以確定為經(jīng)典途徑與非經(jīng)典途徑，以及部分凋亡轉化，因此近年來的研究重點在于如何應用細胞焦亡解決疾病與發(fā)現(xiàn)新的誘導焦亡的分子。通過國內(nèi)外的最新進展，我們提出了基于誘導細胞焦亡探討抑制惡性腫瘤的兩項新策略，即協(xié)同化療與調節(jié)代謝提高腫瘤治療的療效，期望對臨床有所助益。