王潔　吳子建　蔡榮林　何璐　余情　劉磊　許靜　胡玲

〔摘要〕 目的 觀察電針“心俞-神門”配穴對急性心肌缺血（acute myocardial ischemia， AMI）模型大鼠心肌和海馬組織谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）和N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate， NMDA）受體亞基 NMDAR1（NR1）的影響，探討俞原配穴的協(xié)同效應(yīng)，及其對AMI致腦損傷保護的作用機制。方法 將60只健康雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、電針“神門”組（神門組）、電針“心俞”組（心俞組）和電針“心俞+神門”組（心神組），每組12只。除假手術(shù)組外，其他4組大鼠選用冠狀動脈左前降支結(jié)扎法建立AMI模型。干預(yù)組每天電針治療1次，20 min/次，共治療1周，假手術(shù)組和模型組不作干預(yù)治療。觀察分析心電圖ST段變化;ELISA法檢測各組大鼠心肌和海馬組織中Glu、Asp濃度;實時熒光定量PCR檢測各組大鼠心肌和海馬組織中NR1 mRNA表達。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心電圖ST段明顯抬高（P<0.01），心肌、海馬Glu、Asp濃度和NR1 mRNA表達均顯著上升（P<0.01）;與模型組比較，3組電針組治療后ST段明顯降低（P<0.01），心神組心肌和海馬Glu、Asp濃度、NR1 mRNA表達均明顯下降（P<0.01），神門組、心俞組心肌和海馬NR1 mRNA表達及心肌Asp、海馬Glu濃度均顯著下降（P<0.01）;與神門組比較，心神組心肌Asp濃度和海馬Glu、Asp濃度及心肌和海馬的NR1 mRNA表達均明顯下降（P<0.05或P<0.01）;與心俞組比較，心神組心肌和海馬Asp濃度、NR1 mRNA表達明顯下降（P<0.05或P<0.01）。Pearson相關(guān)分析顯示，電針治療后心肌、海馬組織中Glu濃度與NR1 mRNA表達呈正相關(guān)。結(jié)論 電針俞原配穴“心俞-神門”能夠改善AMI模型大鼠心肌缺血狀態(tài)，降低心肌組織和海馬組織的興奮性氨基酸Glu、Asp和NR1水平，可能是其發(fā)揮保護心肌缺血致腦損傷的作用機制之一。

〔關(guān)鍵詞〕 心肌缺血;腦損傷;興奮性氨基酸;電針;心俞;神門

〔中圖分類號〕R245.9? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.01.014

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of electroacupuncture at “Xinshu （BL15）-Shenmen （HT7）” acupoint matching on the glutamic acid （Glu）， aspartic acid（Asp） and the N-methyl-D-aspartate （NMDA） receptor subunit NMDAR1 （NR1） in myocardial and hippocampal tissues of acute myocardial ischemia （AMI） model rats， in order to explore the synergistic effect of acupoint matching of shu-point and source-point and their mechanism in protecting brain injury caused by AMI. Methods 60 healthy male SD rats were randomly divided into the sham operation group， the model group， the electroacupuncture at “Shenmen （HT7）” group （HT7 group）， the electroacupuncture at “Xinshu （BL15）” group （BL15 group）， and the electroacupuncture at "Xinshu （BL15）-Shenmen （HT7）" group （BL15-HT7 group）， with 12 in each group. The AMI model was established by ligation of left anterior descending coronary artery in four groups except the sham operation group. Each intervention group received electroacupuncture treatment once a day for 20 minutes each time for 1 week. The sham operation group and the model group did not receive intervention treatment. The electrocardiogram of rats were recorded， and the changes of ST segment were observed and analyzed; the concentration of Glu and Asp in rat myocardial and hippocampal tissues were determined by ELISA; quantitative realtime PCR was used to detect the expression of NR1 mRNA in the myocardial and hippocamal tissues of rats in each group. Results Compared with the sham operation group， the ST segment of the model group was significantly elevated （P<0.01）， the concentration of Glu and Asp， and the expression of NR1 mRNA in myocardial and hippocamal tissues were significantly increased （P<0.01）; compared with the model group， the ST segment of three groups of electroacupunture were obviously decreased after treatment （P<0.01）， the concentration of Glu， Asp and the expression of NR1 mRNA in myocardial and hippocamal tissues were decreased significantly in the BL15-HT7 group （P<0.01）， the expression of NR1 mRNA in myocardial and hippocamal tissues， the myocardial Asp and the hippocampal Glu concentration were significantly decreased in the HT7 group and the BL15 group （P<0.01）; compared with the HT7 group， the concentration of myocardial Asp and hippocampal Glu， Asp， and the expression of NR1 mRNA in myocardial and hippocamal tissues were decreased significantly in BL15-HT7 group （P<0.05 or P<0.01）; compared with BL15 group， the concentration of myocardial and hippocampal Asp and the expression of NR1 mRNA were significantly decreased in BL15-HT7 group （P<0.05 or P<0.01）. Pearson correlation analysis showed that the concentration of Glu myocardial and hippocamal tissues were positively correlated with the expression of NR1 mRNA after electroacupuncture. Conclusion Electroacupuncture acupoint matching of shu-point and source-point of "Xinshu （BL15）-Shenmen （HT7）" can improve

myocardial ischemia in AMI rats and reduce the concentration of excitatory amino acid Glu and Asp， and the NR1 expression in myocardial and hippocampal tissues， which may be one of the mechanisms of protecting brain damage caused by myocardial ischemia.

〔Keywords〕 myocardial ischemia; brain injury; excitatory amino acids; electroacupuncture; Xinshu （BL15）; Shenmen （HT7）

心肌缺血是指由于心臟冠狀動脈供血不足導(dǎo)致的心肌組織缺血缺氧，進而影響心臟功能的病理狀態(tài)，有研究顯示，心肌缺血會造成不同程度的腦損傷，損傷易發(fā)生在對缺血較為敏感的海馬區(qū)，且隨著時間的推移不斷加重[1]。針刺對心肌缺血的保護作用已得到證實，國內(nèi)外學(xué)者也分別從基因調(diào)控、調(diào)節(jié)心肌能量代謝、調(diào)節(jié)血管活性物質(zhì)、調(diào)控離子通道等角度對針刺抗心肌缺血的作用及機制進行探討[2-5]。興奮性氨基酸（excitatory amino acids，EAA）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性遞質(zhì)，主要是指谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）。Glu和Asp在病理情況下的濃度異常增高，使得氨基酸平衡狀態(tài)被打破，從而產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性。研究[6]發(fā)現(xiàn)，心肌缺血時會釋放大量的EAA，尤其是Glu，影響心肌的損傷，心肌缺血細胞損傷的發(fā)生與EAA的興奮性神經(jīng)毒性有關(guān)。本研究通過觀察電針俞原配穴“心俞-神門”對急性心肌缺血（acute myocardial ischemia， AMI）模型大鼠心肌組織、海馬組織興奮性氨基酸Glu和Asp及N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate， NMDA）受體亞基NR1的影響，探討針刺俞原配穴“心俞-神門”對心肌缺血致腦損傷的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物及分組

健康成年雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量（230±20） g，由安徽省實驗動物中心提供[許可證號：SCXK（皖）2011-002]，置于康為TR60獨立送風(fēng)隔離籠具中飼養(yǎng)，溫度（24±1） ℃，相對濕度為60%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。依據(jù)隨機數(shù)字表法，將大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、電針“神門”組（簡稱神門組）、電針“心俞”組（簡稱心俞組）和電針“心俞+神門”組（簡稱心神組），每組12只。

1.2? 主要儀器和試劑

Powerlab多導(dǎo)生理記錄儀（澳大利亞AD Instrments公司）;電子針療儀（SDZ-V型，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）;普通PCR儀（杭州晶格科學(xué)儀器有限公司）;臺式高速冷凍離心機（安徽嘉文儀器裝備有限公司）;熒光定量PCR儀（Thermo Scientific）;微孔板迷你離心機（杭州奧盛儀器有限公司）;針灸針（0.3 mm×13 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）;大鼠谷氨酸ELISA試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）;大鼠天冬氨酸ELISA試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）;DEPC-H2O（上海捷瑞生物工程有限公司，1910G08）;Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus（近岸蛋白質(zhì)科技有限公司，0516511）;PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，AJ51485A）。

1.3? 模型復(fù)制方法

模型復(fù)制方法結(jié)合前期工作基礎(chǔ)并參考文獻[7]改良，大鼠術(shù)前12 h禁食禁水，用乙醚麻醉大鼠，固定于鼠臺，剃去左胸部鼠毛，用碘伏消毒皮膚。沿著大鼠胸骨左側(cè)3 mm處切開皮膚，鈍性分離左側(cè)胸肌組織，暴露第2～4肋骨，用彎頭止血鉗沿3、4肋間迅速撐開肋骨，將心包膜剪開，擠出大鼠心臟，以充分暴露表面血管，找到冠狀動脈左前降支，用6/0號醫(yī)用縫合線進行穿線結(jié)扎，然后將心臟放回胸腔中，擠出胸腔殘余空氣，縫合肌肉皮膚。手術(shù)過程中，采用標準Ⅱ?qū)?lián)心電圖監(jiān)控，密切監(jiān)測大鼠心電圖變化。參照前期實驗，造模后見心電圖ST段上抬，T波高聳，確定大鼠心肌缺血模型形成。假手術(shù)組大鼠僅將胸腔打開，在相應(yīng)部位穿刺不結(jié)扎。造模前記錄各組大鼠心電圖，剔除心電圖異常及造模失敗大鼠。

1.4? 治療方法

“神門”和“心俞”的腧穴定位參照人體腧穴和《實驗針灸學(xué)》[8]中大鼠穴位的定位方法。神門穴定位：前肢腕部內(nèi)側(cè)橫紋尺骨邊緣;心俞穴定位：第5胸椎棘突下旁開7 mm。選取雙側(cè)神門、心俞穴，并在穴位下方1 mm各刺一針作為參考電極。采用1寸一次性無菌針灸針針刺2 mm，接電子針療儀進行電針刺激，刺激電流2 mA，頻率為2 Hz，每日針刺20 min，1周為1個療程。3組電針組自模型復(fù)制后第2天開始治療，假手術(shù)組與模型組大鼠不進行電針治療。

1.5? 觀察指標及檢測方法

1.5.1? 心電圖檢測與分析? 使用Powerlab 8導(dǎo)生理記錄儀，觀察大鼠肢體標準Ⅱ?qū)?lián)心電信號，并分析ST段變化。

1.5.2? 標本采集? 7 d電針治療結(jié)束后，各組大鼠禁食禁水，第8天進行取材，每組取材6只。用濃度為10%的水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，5組大鼠斷頭處死后迅速開顱，將完整的腦組織取出，在冰盤上小心分離海馬組織，立即放置液氮內(nèi)速凍，然后存放于-80 ℃冰箱中待測;迅速取出心臟，冰盤上切取缺血區(qū)的0.5 cm×0.5 cm大小心肌組織，用0.9%氯化鈉注射液反復(fù)沖洗，濾紙吸干液體，放置液氮內(nèi)速凍后立即置于-80 ℃冰箱中凍存待測。

1.5.3? ELISA試劑盒檢測各組大鼠心肌和海馬組織中Glu、Asp濃度? 將冷凍在液氮中的心臟組織、海馬組織解凍，加入PBS溶液充分勻漿，4 ℃、3 000 rpm離心20 min，吸取上清液按照ELISA試劑盒的操作說明書進行檢測。

1.5.4? 實時熒光定量PCR檢測各組大鼠心肌和海馬組織中NR1 mRNA表達? 取各組50～100 mg組織加入Trizol裂解，提取總RNA。制作cDNA反應(yīng)液作為熒光定量的模板，取cDNA 1 μL、2×SYBR Green

mixture 5 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、RNase Free water 2 μL作為反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95 ℃ 1 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min，95 ℃和60 ℃條件反應(yīng)40個循環(huán)。β-actin的引物序列為：（1）上游引物：5-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3;（2）下游引物：5-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3，產(chǎn)物長度為150 bp。NMDA-NR1的引物序列為：（1）上游引物：5-GTAAACCAGGCCAATAAGCG-3;（2）下游引物：5-AGACAGGGGTGGGAGTGAAG-3，產(chǎn)物長度為187 bp。目的產(chǎn)物計算方法為2-△△Ct。

1.6? 統(tǒng)計學(xué)分析

對實驗數(shù)據(jù)采用Graphpad prism 7.0進行統(tǒng)計分析和圖形制作，結(jié)果以“x±s”表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩間多重比較采用圖凱多重比較測試，采用Pearson相關(guān)分析進行相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 各組大鼠心電圖ST段改變

結(jié)果顯示，模型復(fù)制后大鼠心電圖ST段，較假手術(shù)組顯著抬高（P<0.01），表明急性心肌缺血模型復(fù)制成功。與模型組比較，治療前3組電針組大鼠ST段改變差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），治療后神門組、心俞組、心神組ST段明顯降低（P<0.01）;神門組、心俞組和心神組組間比較ST段的幅值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;各治療組電針后ST段變化與電針前相比，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表1。

2.2? 各組大鼠心肌組織Glu、Asp濃度比較

ELISA檢測可見，模型組大鼠心肌Glu、Asp濃度均明顯高于假手術(shù)組（P<0.01）;電針治療后與模型組比較，神門組和心俞組Glu濃度均有所下降，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），神門組和心俞組Asp濃度均明顯降低（P<0.01），心神組Glu和Asp濃度也均顯著降低（P<0.01）;與神門組和心俞組比較，心神組Asp濃度明顯下降（P<0.01）。見表2。

2.3? 各組大鼠海馬組織Glu、Asp濃度比較

與假手術(shù)組相比較，模型組海馬Glu和Asp的濃度均明顯上升（P<0.01）;電針治療后，與模型組相比，心神組Glu、Asp濃度均明顯下降（P<0.01），神門組、心俞組Glu濃度均顯著降低（P<0.01），神門組、心俞組Asp濃度有所下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;與神門組比較，心神組Glu、Asp濃度明顯下降（P<0.05）;與心俞組相比，心神組Asp濃度明顯下降（P<0.05）。見表3。

2.4? 各組大鼠心肌和海馬組織中NR1 mRNA相對表達量

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌、海馬組織NR1 mRNA相對表達量均明顯上升（P<0.01）;電針治療后，與模型組相比，神門組、心俞組和心神組心肌、海馬組織NR1 mRNA相對表達量均顯著下降（P<0.01）;與神門組比較，心神組、心俞組心肌和海馬組織NR1 mRNA相對表達量顯著下降（P<0.01）;與心俞組相比，心神組心肌、海馬組織NR1 mRNA相對表達量均顯著降低（P<0.01）。見表4。

2.5? 大鼠心肌、海馬組織中Glu濃度與NR1 mRNA相對表達量的相關(guān)性分析

電針治療后大鼠心肌組織中Glu濃度與NR1

mRNA相對表達量呈正相關(guān)（P<0.01，r=0.836 1），海馬組織中Glu濃度與NR1 mRNA相對表達量呈正相關(guān)（P<0.01，r=0.874 7）。見圖1。

3 討論

俞原配穴法是在中醫(yī)基礎(chǔ)理論的指導(dǎo)下，與五臟之氣輸注于原穴和背俞穴的特點相結(jié)合，以及針灸“陽中求陰”的原則，將五臟的原穴、背俞穴相配伍，以起到腧穴協(xié)同作用，增強疾病治療效果的配穴方法?！鹅`樞·背腧》強調(diào)“五臟之腧，出于背……心腧在五焦之間”;《針灸甲乙經(jīng)》中曰：“心……神門者，土也?！稚訇幟}之所注也，為俞” ;《針灸大成》曰：“神門：……主瘧心煩，……心痛”。心俞作為心之背俞穴、“神門”作為心經(jīng)原穴，二者具有反應(yīng)和治療心臟相關(guān)病證的作用。研究[9-10]發(fā)現(xiàn)針刺心俞、神門配穴可能通過降低心肌酶、減輕血管內(nèi)皮損傷、抗氧化應(yīng)激等作用途徑，明顯改善心肌缺血損傷，還可降低心肌缺血導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化損傷、減輕心肌損傷。我們通過前期研究[11-12]證實，針刺通過上調(diào)AMI大鼠海馬中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor， BDNF）及其受體酪氨酸激酶B（tropomyosin receptor kinase B， TrkB）和大腦皮質(zhì)中神經(jīng)生長因子（nerve growth factor， NGF）及其受體酪氨酸激酶A（tropomyosin receptor kinase A， TrkA）的表達水平，保護心肌缺血所致的腦損傷，這可能是其保護心肌缺血致腦損傷的作用機制之一。此外，我們也發(fā)現(xiàn)電針“心俞+神門”俞原配穴對心肌缺血模型大鼠的海馬BDNF和TrkB的表達效應(yīng)優(yōu)于單穴“神門”，針刺可以誘導(dǎo)分泌內(nèi)源性BDNF及受體TrkB，起到促進神經(jīng)元的修復(fù)以及保護神經(jīng)元的作用。

在心肌缺血腦損傷保護作用中除了神經(jīng)營養(yǎng)因子外，腦內(nèi)重要的氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)也發(fā)揮著重要的作用。興奮性氨基酸主要包括Glu和Asp參與神經(jīng)元的信號傳遞、學(xué)習(xí)認知等過程[13]，在心肌能量代謝和心血管保護中具有重要作用[14]。生理狀態(tài)下具有興奮性突觸傳遞等作用，而病理條件下，Glu會通過興奮Glu受體產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性[15]。Glu濃度過高會產(chǎn)生神經(jīng)毒性，其興奮毒性的機制，與神經(jīng)元去極化、神經(jīng)元腫脹、Ca2+內(nèi)流和NMDA受體和AMPA受體興奮激活等過程有關(guān)[16]。生理情況下，Glu、Asp為心臟的活動提供能量。Glu在病理狀態(tài)下的過度升高，可通過受體作用于心肌細胞，導(dǎo)致心電功能紊亂和心臟自律性異常[17]。心肌缺血后大鼠心肌組織中Glu含量大量增高，激活NMDAR，從而引起心肌細胞凋亡，作用途徑為GLu-NMDAR-Ca2+[18]。NMDA受體包含3個亞單位：NR1、NR2和NR3，NR1是功能亞基，調(diào)節(jié)Ca2+通道，與NR2和NR3組成異聚體，形成NMDA受體通道[15]。NMDA 受體過度興奮會引起一系列的神經(jīng)損傷。本研究旨在前期工作的基礎(chǔ)上，進一步探討針刺“心俞-神門”配穴對針刺抗心肌缺血腦損傷保護效應(yīng)的作用機制。

既往研究[19]發(fā)現(xiàn)，電針治療能夠上調(diào)腦缺血再灌注損傷大鼠大腦皮層區(qū)TrkA的表達，同時通過PI3K通路逆轉(zhuǎn)缺血誘導(dǎo)的NR1 mRNA表達的異常增高，使神經(jīng)興奮性毒性得到減輕。而NGF及受體TrkA相結(jié)合可以促進受損神經(jīng)元的修復(fù)和神經(jīng)元生長。我們的前期研究也證實了，電針可以提高心肌缺血大鼠皮質(zhì)區(qū)NGF及TrkA的表達，起到抗心肌缺血腦損傷的作用。本研究表明，AMI大鼠模型組心肌組織、海馬組織的Glu、Asp含量明顯高于假手術(shù)組，AMI發(fā)生后，心肌缺血缺氧損傷導(dǎo)致Glu、Asp濃度過度升高，NR1 mRNA表達增高，產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性。EAA的興奮性神經(jīng)毒性參與了AMI致腦損傷的發(fā)生過程。電針治療后AMI大鼠心肌組織、海馬組織中Glu、Asp濃度、NR1 mRNA表達降低，減輕EAA的神經(jīng)興奮性毒性，保護神經(jīng)元。電針俞原配穴“心俞-神門”效果優(yōu)于單獨電針“心俞”“神門”，可見俞原配穴具有協(xié)同效應(yīng)。針刺抗心肌缺血所致腦損傷的作用機制可能與抑制心肌缺血興奮性氨基酸Glu、Asp及受體NR1過度升高密切相關(guān)。本研究結(jié)果經(jīng)Pearson相關(guān)分析顯示，電針后心肌、海馬組織Glu濃度與NR1 mRNA相對表達量呈正相關(guān)，表明NR1可能在針刺調(diào)節(jié)心肌缺血腦損傷大鼠心肌、海馬組織Glu濃度中起到重要作用，針刺可能是通過抑制NR1 mRNA表達進而抑制Glu濃度增加，發(fā)揮保護心肌缺血致腦損傷的作用。

有研究[20]發(fā)現(xiàn)，興奮性氨基酸Glu與BDNF有密切關(guān)系，BDNF可影響Glu的釋放和信號傳導(dǎo)，還可以增加AMPA受體活性。本課題組后期將從腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)作用通路等角度，更進一步探討針刺抗心肌缺血致腦損傷的效應(yīng)機制。

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