陳 旭 ，左 濤 ，周勝杰 ，楊 蕊 ，于 剛 ，秦傳新 ，馬振華

（1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心/三亞熱帶水產(chǎn)研究院，海南 三亞 572018；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300）

魚類是一種低等水生脊椎動(dòng)物，很容易受外界環(huán)境影響。在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)管理過程中換水、吸污、拉網(wǎng)、捕捉、離水、運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)，常會(huì)對(duì)魚體造成一定脅迫[1-3]。尤其在運(yùn)輸過程中由于運(yùn)輸水體污染、機(jī)械振動(dòng)、包裝密度過高、溫度變化、運(yùn)輸時(shí)間過長(zhǎng)以及搬運(yùn)造成的顛簸會(huì)引起魚苗的應(yīng)激反應(yīng)[4-6]。這種反應(yīng)會(huì)擾亂魚苗的一些正常生理反應(yīng)，導(dǎo)致魚苗氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、免疫力下降，甚至死亡。

魚苗運(yùn)輸在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)用十分廣泛，如何提高魚苗運(yùn)輸成活率是目前研究的重點(diǎn)之一。密閉充氧運(yùn)輸方式具有用水量少、成活率高等優(yōu)點(diǎn)受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。關(guān)于魚苗密閉充氧運(yùn)輸相關(guān)方面的研究，主要集中在運(yùn)輸過程中和運(yùn)輸后對(duì)水質(zhì)和魚苗生理生化的影響，以求獲得最適宜的運(yùn)輸密度和運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)。如研究雜交海鯉 (Pagrus major♀×Acanthopagrus schlegelii♂)[7]幼魚和卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)[8]魚苗不同運(yùn)輸密度對(duì)運(yùn)輸水質(zhì)和生理生化的影響；黑鯛 (Sparus inacrocephalus)[9]魚苗最適宜運(yùn)輸密度及運(yùn)輸后生理生化變化情況；翹嘴鲌 (Culter alburnus)[10]稚魚運(yùn)輸時(shí)間和MS-222濃度對(duì)翹嘴鲌全魚皮質(zhì)醇、乳酸含量及氧氣袋內(nèi)水質(zhì)的影響等。尖吻鱸 (Lates calcarifer)，俗稱盲，隸屬于鱸形目、鱸亞目、尖吻鱸科、尖吻鱸屬[11-12]。由于魚肉品質(zhì)好、生長(zhǎng)速度快、抗逆強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，廣受消費(fèi)者喜愛。目前，隨著尖吻鱸養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，對(duì)其魚苗的需求量越來越大，魚苗運(yùn)輸也日漸頻繁，因此探明尖吻鱸幼魚運(yùn)輸密度和時(shí)長(zhǎng)對(duì)運(yùn)輸水質(zhì)及其復(fù)蘇率和抗氧化能力的影響，保證運(yùn)輸過程中魚苗的質(zhì)量顯得非常重要。目前有關(guān)尖吻鱸魚苗脅迫應(yīng)激方面的研究較少。本試驗(yàn)采用塑料袋密閉充氧?；钸\(yùn)輸?shù)姆椒?，探究在不同密度和不同時(shí)長(zhǎng)運(yùn)輸脅迫下，對(duì)尖吻鱸幼魚運(yùn)輸水質(zhì)、復(fù)蘇率以及全魚組織中抗氧化能力的影響。了解尖吻鱸幼魚應(yīng)激程度的大小，設(shè)定最優(yōu)的尖吻鱸幼魚運(yùn)輸密度和時(shí)長(zhǎng)，以便提供更科學(xué)的運(yùn)輸方法，減少運(yùn)輸過程中對(duì)尖吻鱸幼魚的傷害。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

尖吻鱸幼魚由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心自行培養(yǎng)，選取體質(zhì)健康、體表無傷、活力強(qiáng)且規(guī)格相近的尖吻鱸幼魚作為試驗(yàn)用魚。試驗(yàn)用幼魚平均體長(zhǎng)為 (1.42±0.19) cm，平均體質(zhì)量為 (0.06±0.02) g，運(yùn)輸試驗(yàn)開始前24 h禁食?？偝趸锲缁?(TSOD)、過氧化物酶 (POD)、丙二醛 (MDA) 試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。試驗(yàn)用水為經(jīng)過沙濾后的自然海水。

1.2 模擬運(yùn)輸試驗(yàn)方法

設(shè)置 3 種運(yùn)輸密度 (D1=14 kg·m?3、D2=21 kg·m?3、D3=28 kg·m?3)，然后模擬運(yùn)輸24 h；同時(shí)在運(yùn)輸密度7 kg·m?3[13]下模擬 6 個(gè)不同運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng) (T1=4 h、T2=8 h、T3=12 h、T4=16 h、T5=20 h、T6=24 h)；每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行，對(duì)照組為正常養(yǎng)殖的尖吻鱸幼魚。試驗(yàn)用塑料袋尺寸為48.0 cm×37.0 cm×22.5 cm，每袋注入海水4.5 L，每袋放入相應(yīng)數(shù)量的尖吻鱸幼魚。然后把袋里的空氣排空，注入純氧，體積約為9 L。充氧完畢后快速使用橡皮筋系緊，置于事先設(shè)置好溫度 (24.0 ℃) 的空調(diào)房泡沫箱上。試驗(yàn)期間禁止打開塑料袋，每隔1 h晃動(dòng)塑料袋10次以便氧氣和海水充分混勻。按照試驗(yàn)要求取完樣后，把塑料袋內(nèi)剩余的幼魚放入循環(huán)水系統(tǒng)內(nèi) (水溫24.1 ℃，鹽度32，pH 7.92) 進(jìn)行養(yǎng)殖，期間正常曝氣、投喂，7 d后記錄剩余幼魚存活情況。

1.3 樣品采集與檢測(cè)分析

在不同運(yùn)輸密度試驗(yàn)中，試驗(yàn)開始前和試驗(yàn)結(jié)束后以及在不同運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)試驗(yàn)中，分別在第0、第4、第8、第12、第16、第20、第24小時(shí)用500 mL取樣瓶取試驗(yàn)水樣。用HACH多探頭水質(zhì)測(cè)定儀 (HQ40d, HACH) 深入塑料袋中測(cè)定其水溫 (℃)、酸堿度 (pH)、溶解氧 (DO)。根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)海洋調(diào)查規(guī)范第四部分：海水化學(xué)要素調(diào)查 (GB/T 12763.4—2007)，采用次溴酸鈉氧化法測(cè)定水體中氨氮 (-N) 含量，采用重氮-偶氮法測(cè)定水體中亞硝態(tài)氮 (-N) 含量。采集20尾全魚，分裝為兩管后立刻放置于?80 ℃凍存?zhèn)溆?。樣品分析前? ℃冰箱中解凍，用DREAMEL研磨儀研磨，后放入EXPERT 18K-R冷凍離心機(jī)，在4 ℃下，2 500 r·min?1離心10 min，取上清液用于T-SOD和POD活性以及MDA含量的測(cè)定。后續(xù)的操作詳見南京建成生物工程研究所研發(fā)的試劑盒使用說明書，在多功能酶標(biāo)儀 (美國(guó)伯騰Biotek Synergy H1) 中測(cè)定吸光值，換算成相應(yīng)濃度或酶活值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0和Excel 2016軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與作圖并進(jìn)行單因素方差分析 (One-way ANOVA)，各試驗(yàn)組間存在差異用Duncan's多重比較，當(dāng)P＜0.05時(shí)為差異顯著，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (X ±SD )”表示。

2 結(jié)果

2.1 密度運(yùn)輸后水質(zhì)、復(fù)蘇率和7 d后成活率的變化

尖吻鱸幼魚運(yùn)輸24 h后，運(yùn)輸塑料袋內(nèi)水溫約為(24.1±0.25) ℃；D2和D3組組間水體pH和DO差異不顯著，均顯著低于D1組 (P＜0.05，圖1-a、1-b)；水體中各密度組組間-N和-N差異均顯著 (P＜0.05)，均是D3組＞D2組＞D1組 (圖1-c、1-d)；運(yùn)輸24 h后D1組尖吻鱸幼魚復(fù)蘇率顯著高于D2和D3組 (P＜0.05)，D2和D3組差異不顯著 (圖1-e)。

圖1 不同運(yùn)輸密度對(duì)尖吻鱸幼魚運(yùn)輸水質(zhì)和復(fù)蘇率的影響不同字母表示數(shù)據(jù)間有顯著性差異 (P＜0.05)；后圖同此Figure 1 Effect of different transport density on transport water quality and resuscitation rate of juvenile L. calcariferValues with different superscripts are significantly different (P＜0.05); the same case in the following figures.

2.2 時(shí)長(zhǎng)運(yùn)輸后運(yùn)輸水質(zhì)、復(fù)蘇率和7 d后成活率的變化

尖吻鱸幼魚運(yùn)輸過程中，運(yùn)輸塑料袋內(nèi)水溫約為(24±0.12) ℃；T1組和T2組相比，pH差異不顯著，均顯著高于 T3、T4、T5、T6 組 (P＜0.05)，T3、T4、T5、T6 組組間差異不顯著 (圖2-a)；水體中DO均超出儀器測(cè)量范圍(≥21.98 mg·L?1)；水體中-N 和-N 各組組間差異均顯著，并隨著運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)的增加均顯著升高 (圖2-b、 2-c)；各試驗(yàn)組組間尖吻鱸幼魚復(fù)蘇率差異均不顯著 (P＞0.05)，其中T1、T2、T3和T5組復(fù)蘇率均為100%，T4和T6組復(fù)蘇率分別為98.72%和99.62%；同時(shí)，運(yùn)輸密度和運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)束后剩余幼魚在循環(huán)水系統(tǒng)內(nèi)養(yǎng)殖7 d，成活率均為100%。

圖2 不同運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)對(duì)尖吻鱸幼魚運(yùn)輸水質(zhì)的影響Figure 2 Effect of different transport duration on transport water quality of juvenile L. calcarifer

2.3 密度運(yùn)輸后全魚組織T-SOD、POD活性及MDA含量的變化

不同運(yùn)輸密度試驗(yàn)中，對(duì)照組尖吻鱸幼魚T-SOD活性最高，與D3組相比差異不顯著，均顯著高于D1和D2組(P＜0.05)；D1、D2和D3組組間差異均不顯著 (P＞0.05，圖3-a)。D1、D2和對(duì)照組組間POD活性差異均不顯著，均顯著高于D3組 (P＜0.05，圖3-b)。D2與D3組組間MDA含量差異不顯著，均顯著高于D1和對(duì)照組 (P＜0.05)，D1與對(duì)照組相比差異不顯著 (圖3-c)。

2.4 時(shí)長(zhǎng)運(yùn)輸后全魚組織T-SOD、POD活性及MDA含量的變化

不同運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)試驗(yàn)中，隨著運(yùn)輸時(shí)間的增加尖吻鱸全魚組織中的T-SOD活性總體呈升高?降低?升高的變化趨勢(shì)。T3組T-SOD活性最高，與T4組相比差異不顯著，顯著高于其他各組 (P＜0.05)；T4組T-SOD活性顯著高于T1、T2、T5和對(duì)照組 (P＜0.05)；T6組T-SOD活性顯著高于T1、T2和對(duì)照組 (P＜0.05)；T1、T2、T5和對(duì)照組組間T-SOD活性差異均不顯著 (P＞0.05，圖3-d)。隨著運(yùn)輸時(shí)間的增加尖吻鱸幼魚全魚組織中的POD活性總體呈升高?降低?升高?降低的不規(guī)則變化。各試驗(yàn)組POD活性均顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05)；T3組POD活性最高，顯著高于其他各組 (P＜0.05)；T2組POD活性顯著低于T1、T4、T5組；T1、T4、T5、T6組組間POD活性差異均不顯著 (圖3-e)。隨著運(yùn)輸時(shí)間的增加尖吻鱸全魚組織中MDA含量總體呈現(xiàn)升高?降低?升高?降低的不規(guī)則變化。T2組MDA含量最高，與T4組相比差異不顯著，顯著高于T1、T3、T5、T6和對(duì)照組 (P＜0.05)；除了T2組，各組組間MDA含量差異均不顯著 (P＞0.05，圖3-f)。

圖3 不同運(yùn)輸密度和運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)對(duì)尖吻鱸幼魚總超氧化物歧化酶、過氧化物酶活性及丙二醛質(zhì)量摩爾濃度的影響Figure 3 Effect of transportation density and duration on T-SOD, POD activity and MDA content of juvenile L. calcarifer

3 討論

3.1 不同運(yùn)輸密度和運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)對(duì)尖吻鱸幼魚運(yùn)輸水質(zhì)、復(fù)蘇率和7 d后成活率的影響

密封充氧將魚類限制在一個(gè)充氧后密封小水體中，然后進(jìn)行高密度和長(zhǎng)時(shí)間的一種運(yùn)輸方法。運(yùn)輸水質(zhì)的惡化很大程度上受到運(yùn)輸密度、魚的規(guī)格以及運(yùn)輸時(shí)間的影響，而運(yùn)輸水質(zhì)的變化對(duì)于魚苗存活、?；顣r(shí)間、魚苗體質(zhì)健康等至關(guān)重要[14-17]。研究表明，密封充氧運(yùn)輸黑尾近紅鲌 (Ancherythroculter nigrocauda)[18]仔稚魚、翹嘴鲌[19]稚魚和卵形鯧鲹[13]魚苗等過程中，隨著運(yùn)輸密度和時(shí)間的增加，-N升高而DO和pH降低，這些研究結(jié)果與本試驗(yàn)相一致。本試驗(yàn)在開始前水體清澈見底，隨著運(yùn)輸密度和時(shí)間的增加水體逐漸變混濁，水體中-N和-N升高而DO、pH和復(fù)蘇率降低。這說明在運(yùn)輸密度和時(shí)長(zhǎng)脅迫下，尖吻鱸幼魚代謝速率明顯加快，引起耗氧率、CO2和代謝廢物排泄量的增加，造成運(yùn)輸水體中-N和-N升高。幼魚復(fù)蘇率降低是由于CO2溶于水中導(dǎo)致pH降低，進(jìn)一步增加應(yīng)激反應(yīng)和-N與-N濃度過高造成幼魚鰓部損害、魚體中毒以及死亡。剩余魚體正常養(yǎng)殖7 d后成活率均為100%，表明在本試驗(yàn)條件下，運(yùn)輸密度和時(shí)長(zhǎng)脅迫對(duì)尖吻鱸幼魚機(jī)體產(chǎn)生的影響，在魚體復(fù)蘇恢復(fù)后對(duì)養(yǎng)殖成活率沒有影響。本試驗(yàn)中不同的是，運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)試驗(yàn)中各組DO均超出儀器測(cè)量范圍(≥21.98 mg·L?1)，可能原因是魚苗的呼吸、排泄物以及分泌的體液等造成的耗氧量遠(yuǎn)低于充入的純氧量。

3.2 不同運(yùn)輸密度對(duì)尖吻鱸幼魚抗氧化能力的影響

魚類受到外界環(huán)境刺激時(shí)，其非特異性免疫系統(tǒng)在應(yīng)對(duì)逆環(huán)境應(yīng)激時(shí)起主導(dǎo)作用，其中T-SOD、POD和過氧化脂質(zhì)及其產(chǎn)物MDA等物質(zhì)在免疫調(diào)節(jié)過程中扮演著重要角色。這些物質(zhì)不但可作為判斷魚類的生長(zhǎng)、健康狀況以及賴以生存的環(huán)境狀況的依據(jù)，還可用作氧化應(yīng)激水平的量化指標(biāo)[20-21]。研究表明，密封充氧運(yùn)輸卵形鯧鲹魚苗8 h后，隨著運(yùn)輸密度的增加，肝臟POD活性逐漸下降，但高于對(duì)照組[8]。團(tuán)頭魴 (Megalobrama amblyocephala) 隨著飼養(yǎng)密度的增加，其肝臟SOD活性顯著下降，而MDA含量顯著增加[22]。黑鯛 (Sparus inacrocephalus) 密封充氧運(yùn)輸后，10尾組和15尾組血清和肌肉中的MDA含量顯著低于30尾組，而SOD活性顯著高于30尾組[9]，與本試驗(yàn)結(jié)果相似。在魚類正常的生命活動(dòng)中，有機(jī)體內(nèi)的氧自由基(ROS) 處于一種不斷地產(chǎn)生，又不斷地被清除的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[23]。本試驗(yàn)中運(yùn)輸密度對(duì)尖吻鱸幼魚全魚組織TSOD活性影響不顯著。這表明機(jī)體非特異性免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的T-SOD可以清除體內(nèi)由運(yùn)輸密度脅迫產(chǎn)生的多余ROS，維持尖吻鱸幼魚體內(nèi)ROS的動(dòng)態(tài)平衡。隨著運(yùn)輸密度的增加，迫使機(jī)體通過非特異性免疫系統(tǒng)代謝調(diào)節(jié)來清除脅迫所產(chǎn)生的過多ROS，消耗了大量的POD，造成POD活性降低；而MDA含量的升高是由于尖吻鱸幼魚體內(nèi)的非特異性免疫系統(tǒng)對(duì)運(yùn)輸密度做出反應(yīng)，清除過多ROS以減輕運(yùn)輸密度脅迫對(duì)機(jī)體造成的損傷。

3.3 不同運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)對(duì)尖吻鱸魚幼魚抗氧化能力的影響

機(jī)體受到外界環(huán)境刺激時(shí)，通過氧化還原反應(yīng)進(jìn)行多層次應(yīng)激性調(diào)節(jié)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以消除體內(nèi)過多ROS[24-26]。應(yīng)激條件下，SOD將機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的ROS分解成過氧化氫(H2O2)，而CAT又可以將H2O2還原成氧分子 (O2) 和水(H2O)，從而消除ROS對(duì)機(jī)體的影響[27-28]。POD具有消除H2O2和酚類、胺類、醛類、苯類毒性的雙重作用[29]。MDA是生物體脂質(zhì)氧化的天然產(chǎn)物，可以間接反映機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱[30-31]。研究表明，操作脅迫 (驚擾) 下云紋石斑魚 (Epinephelus moara) 肝臟SOD活性隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后降低[32]。急性擁擠脅迫后，半滑舌鰨 (Cynoglossus semilaevis) MDA含量呈升高?降低?升高的變化[25]。運(yùn)輸后黃顙魚 (Pelteobagrus fulvidraco) 血清 SOD活性顯著升高，隨著恢復(fù)時(shí)間的推移逐漸回降到正常水平；但POD活性未出現(xiàn)顯著差異[33]，這與本試驗(yàn)相似。本試驗(yàn)中在不同運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)脅迫下，尖吻鱸幼魚全魚組織中的TSOD和POD活性隨著運(yùn)輸時(shí)間的增加總體呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，表明其受運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)脅迫產(chǎn)生了大量ROS，機(jī)體抗氧化防御體系作出反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體T-SOD和POD活性升高，以清除過量ROS使機(jī)體免遭氧化損傷。隨著運(yùn)輸時(shí)間的繼續(xù)增加，T-SOD和POD活性降低，說明長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)輸脅迫產(chǎn)生的ROS，超過了抗氧化體系處理ROS的閾值，機(jī)體組織受到了嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致抗氧化物質(zhì)合成能力下降，抗氧化水平下降，機(jī)體正常的ROS“穩(wěn)態(tài)性動(dòng)態(tài)平衡”被破壞。MDA含量升高實(shí)際上反映了運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)脅迫應(yīng)激誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了大量的ROS，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)變強(qiáng)，因而脂質(zhì)的過氧化物也隨之增多。機(jī)體抗氧化防御體系反應(yīng)導(dǎo)致MDA含量升高以應(yīng)對(duì)抗氧化應(yīng)激。MDA含量降低，表明清除過量的ROS消耗了大量的MDA或ROS，超過抗氧化體系處理的閾值，機(jī)體組織受到了嚴(yán)重?fù)p傷。

綜上所述，為減少運(yùn)輸損失和運(yùn)輸脅迫對(duì)魚苗生長(zhǎng)與健康的影響。建議在水溫24 ℃、鹽度32、pH 7.92的條件下用塑料袋密封充氧運(yùn)輸1.42 cm左右的尖吻鱸幼魚24 h時(shí)，密度不超過21 kg·m?3為宜。