李稱奇，土志涵，吳榮宇，趙楓燊，賈晶晶，沈和定

（上海海洋大學(xué)水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心/海洋動(dòng)物系統(tǒng)分類與進(jìn)化上海高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306）

神經(jīng)肽是從神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生和釋放，參與調(diào)節(jié)生物個(gè)體的生理活動(dòng)，維持生物體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一類重要信號因子，是NEI系統(tǒng)中最重要的調(diào)節(jié)因子之一，在脊椎和無脊椎動(dòng)物中均有免疫調(diào)節(jié)功能。其中FMRFamide (Phe-Met-Arg-Pheamide) 是一種酰胺化四肽，是類 FMRF酰胺肽(FMRFarmide-related peptides, Farps或FMRFamide-like peptide, FLPs) 家族的成員。其在神經(jīng)系統(tǒng)中合成并釋放，能通過神經(jīng)元直接傳遞信號，并作為神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)和神經(jīng)激素發(fā)揮作用[1]，是無脊椎動(dòng)物中含量最豐富的一類神經(jīng)肽[2]。此外，該神經(jīng)肽也能通過內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)攝食和運(yùn)動(dòng)行為[3]。近年來，F(xiàn)MRFamide的生理功能受到普遍關(guān)注，如Marciniak等[4]研究發(fā)現(xiàn)其具有特異性的心臟活性，能有效調(diào)節(jié)甲蟲內(nèi)臟肌肉的內(nèi)源性收縮活性。Kim等[5]研究皺紋盤鮑 (Haliotis discus hannai) 發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MRFamide神經(jīng)肽對海洋腹足類動(dòng)物生殖調(diào)節(jié)有重要促進(jìn)作用。FMRFamide也被發(fā)現(xiàn)能夠通過抑制有絲分裂來保護(hù)細(xì)胞免受凋亡[6]。而作為無脊椎動(dòng)物中特有的神經(jīng)肽，一些研究也表明其可能參與了海洋無脊椎動(dòng)物的免疫應(yīng)答。如Li等[7]通過對太平洋牡蠣 (Crassostrea gigas) 炎癥刺激后的FMRFanide多肽治療，發(fā)現(xiàn)FMRFamide多肽不僅由神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)合成，而且還在血細(xì)胞中合成加工，首次證實(shí)了該多肽存在于血細(xì)胞中。Guan等[8]對加利福尼亞海兔 (Aplysia california) 的研究發(fā)現(xiàn)FMRFamide可以通過激活P38絲裂原激活蛋白 (MAP) 激酶來調(diào)節(jié)突觸的可塑性和調(diào)節(jié)免疫效應(yīng)物。

瘤背石磺 (Onchidium reevesii) 隸屬于軟體動(dòng)物門、石磺科，又名土雞、海賴子、涂龜、土海參等[9-10]，常棲息在灘涂上的石縫中、植被的根部和陰暗潮濕的角落，主要分布于我國東部沿海地區(qū)[11-12]。瘤背石磺的中樞神經(jīng)系統(tǒng) (Central nervous system, CNS) 是一個(gè)簡單的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，體積大且易獲得[13]。瘤背石磺不僅是研究無脊椎動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)功能的模式種，而且由于其生活在潮間帶，有良好的應(yīng)激耐受機(jī)制，能適應(yīng)波動(dòng)的生存環(huán)境、各種重金屬離子和病原體[14]，對于研究無脊椎動(dòng)物應(yīng)對外界環(huán)境變化和病原入侵的免疫反應(yīng)機(jī)制也有顯著優(yōu)勢。為此，本研究在實(shí)驗(yàn)室瘤背石磺高通量轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上克隆得到了OrFMRFamide基因的全長，分析該基因的分子特征及其mRNA和多肽在組織中的分布，研究其在炎癥刺激后的反應(yīng)，從而為探究FMRFamide基因在瘤背石磺免疫機(jī)制中的作用提供了理論依據(jù)，也為進(jìn)一步理解生活在潮間帶的兩棲類動(dòng)物對惡劣環(huán)境的適應(yīng)機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2020年6月初在江蘇省鹽城市沿海灘涂采集成體鮮活瘤背石磺，帶回實(shí)驗(yàn)室后暫養(yǎng)于70 cm×120 cm×50 cm的塑料養(yǎng)殖箱內(nèi)，養(yǎng)殖箱底部覆蓋5～10 cm厚的海泥，種植灘涂采集的植被，放上瓦片，放養(yǎng)灘涂捕捉的螃蟹在泥中打洞，為石磺提供休息躲避的巢穴，盡可能地模擬自然生態(tài)環(huán)境，消除實(shí)驗(yàn)外干擾。每天早晚定時(shí)投喂玉米粉和噴灑海水保持土壤濕潤，定期檢查瘤背石磺生長狀況，以確保其較高的成活率。暫養(yǎng)1周后，取5只體態(tài)均勻、健康有活力的瘤背石磺 [ 體長 (43.55±1.32) mm，體質(zhì)量 (15.73±0.78) g]，用超純水清洗表面的泥沙，取血細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)、肝胰腺、肌肉、性腺、皮膚和腹足等組織用液氮速凍后放入–80 ℃冰箱備用，用于組織cDNA模板的制備。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA的合成 實(shí)驗(yàn)所用器皿均經(jīng)180 ℃高溫殺菌處理3 h或使用DEPC處理過后進(jìn)行高壓滅菌。實(shí)驗(yàn)開始前將所有器材預(yù)冷備用，全程在冰上操作，取–80 ℃保存的瘤背石磺各組織，按照Trizol (Invitrogen, 美國) 說明書提取各組織的總RNA。配制質(zhì)量濃度為10 mg·mL?1的瓊脂糖凝膠，135 V、電泳15 min檢測RNA提取質(zhì)量，在核酸檢測儀上標(biāo)定提取RNA的濃度和純度。將神經(jīng)節(jié)RNA按照PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa) 說明書合成cDNA第一鏈，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的RACE (Rapid-amplification of cDNA ends) 模板。將提取所得的各組織RNA按照 PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa) 試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將獲得的cDNA于–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2OrFMRFamide基因的克隆 根據(jù)筆者實(shí)驗(yàn)室測得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫 (未發(fā)表) 篩選得到目的基因的部分基因片段，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)2對引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物用10 mg·mL?1的瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用D2000 Ladder作為Maker，產(chǎn)物條帶單一且清晰，送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI上BLAST比對，確認(rèn)為FMRFamide基因片段，然后按照SMARTER? RACE5'/3'Kit及3'Full RACE Core Set With PrimerScriptTMRTase試劑盒的說明書在Primer Premier 5.0軟件上設(shè)計(jì)5'和3' RACE特異性引物，通過RACE技術(shù)得到產(chǎn)物，產(chǎn)物經(jīng)過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送往蘇州金唯智生物科技有限公司測序，將所得到的全部測序結(jié)果通過Sequebcher 5.0軟件拼接得到OrFMRFamide基因的序列全長。

1.2.3OrFMRFamide基因的序列分析 把拼接得到的基因序列全長在NCBI上用ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/) 在線工具對Or-FMRFamide基因開放閱讀框 (Open reading frame,ORF) 及編碼氨基酸進(jìn)行預(yù)測，得到預(yù)測的編碼氨基酸后在NCBI上用在線工具BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 進(jìn)行同源性比較，使用NetNGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) 在線工具確定糖基化位點(diǎn)，理化性質(zhì)用 ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/) 在線工具分析，使用NetPhos 2.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos–2.0/) 在線工具查找磷酸化位點(diǎn)，使用Signal 5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 在線工具查找信號肽。用MEGA-X軟件基于比鄰法，以1 000次Bootstraps構(gòu)建瘤背石磺與其他物種FMRFamide基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4OrFMRFamide基因在不同組織中的表達(dá) 通過在線工具Genscrip (https://www.genscript.com/tools/real–time–pcr–taqman–primer–design–tool)根據(jù)OrFMRFamide基因全長序列設(shè)計(jì)熒光定量引物 (表1)，以18S作為內(nèi)參基因，以上述驗(yàn)證過的瘤背石磺各組織cDNA為模板，使用 ChamQ Uni-versal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme，美國) 試劑盒在CFX-96 (Bio-Rad，美國) 進(jìn)行熒光定量反應(yīng)，每個(gè)樣品和內(nèi)參都設(shè)置3個(gè)平行對照，以Rnasefree雙蒸水 (ddH2O) 為陰性對照，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 數(shù)據(jù)用 2–ΔΔCT法進(jìn)行分析。

1.2.5 免疫組織化學(xué)分析 免疫組織化學(xué)取養(yǎng)殖箱暫養(yǎng)未經(jīng)處理的5只瘤背石磺進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采集未經(jīng)處理的新鮮的神經(jīng)節(jié)、肝胰腺、性腺、腹足、肌肉和皮膚，用4%的多聚甲醛固定6 h，轉(zhuǎn)移至20%的蔗糖溶液固定過夜，然后轉(zhuǎn)移至40%的蔗糖溶液固定到組織沉底，使用冰凍切片機(jī) (萊卡CM1950)切片后貼在黏附載玻片上，按照一步法免疫組化試劑盒 (凱基) 說明書完成免疫組化實(shí)驗(yàn)，用顯微鏡觀察拍照。

1.2.6 LPS刺激 在養(yǎng)殖箱中暫養(yǎng)7 d后隨機(jī)選取100只瘤背石磺，平均分為2組，暫養(yǎng)在2個(gè)養(yǎng)殖箱中，分別給每只瘤背石磺注射100 μL磷酸鹽緩沖溶液 (Phosphate buffered saline, PBS) 和 100 μL脂多糖 (LPS, 0.5 mg·mL–1，溶于 PBS)，經(jīng)處理的瘤背石磺分別放回養(yǎng)殖箱暫養(yǎng)，分別在注射后第0、第6、第12、第24、第48小時(shí)取樣，每次隨機(jī)抽取9只石磺，將3只的血細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)、肝胰腺、肌肉、性腺、皮膚和腹足合并為1個(gè)樣本，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集3個(gè)平行樣本。血細(xì)胞的采集是使用1 mL注射器從瘤背石磺腹部抽取血液，在800 ×g、4 ℃條件下離心10 min，獲得血細(xì)胞后將其溶解在trizol中，用液氮速凍，于–80 ℃保存。其他組織取樣后放入液氮速凍，于–80 ℃保存。用trizol法提取各組織RNA，用HiScript Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper, Vazyme，美國) 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA于–20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 OrFMRFamide基因在炎癥刺激后的時(shí)空表達(dá) 按照上述方法，以各組織各個(gè)時(shí)期刺激前后的cDNA為模板，18S為內(nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)使用2–ΔΔCT法進(jìn)行分析。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 26.0軟件對熒光定量的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，單因素方差分析結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 ( X ±SD)”表示。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 OrFMRFamide的cDNA序列特征

根據(jù)瘤背石磺轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果獲得的OrFMRFamide基因片段，通過3'和5'-RACE擴(kuò)增得到該基因全長序列為2 618 bp，開放閱讀框 (Open reading frame, ORF)為882 bp，基因序列末端加尾信號AATAA與Poly (A) 之間有17個(gè)堿基 (圖1)。ProtParam推測編碼1個(gè)含有293個(gè)氨基酸的蛋白，分子量為33 847.88 kD，理論等電點(diǎn) (pI) 為9.25，不穩(wěn)定指數(shù)為57.00，預(yù)測為不穩(wěn)定蛋白，溶脂指數(shù)為55.67，平均疏水指數(shù)為–0.890。Server預(yù)測該蛋白不存在糖基位點(diǎn)。NetPhos 2.0 Server預(yù)測該蛋白含有12個(gè)磷酸化位點(diǎn) [ 絲氨酸(Ser)：4；蘇氨酸 (Thr)：2；酪氨酸 (Tyr)：6]。信號肽軟件預(yù)測該基因有1個(gè)N端信號肽 (1～24)。

圖1 FMRFamide基因的氨基酸序列及cDNA全長淺灰色陰影部分是該基因編碼信號肽部分，起始密碼子和終止密碼子用方框標(biāo)出，深灰色陰影是磷酸化位點(diǎn)，末端加尾信號AATAAA用下劃線標(biāo)出，poly (A) 用斜體表示Figure 1 Amino acid sequence and full length cDNA of FMRFamide geneThe light grey shaded portion is the signal peptide portion of the gene; the start and stop codons are boxed; the dark grey shaded portion is the phosphorylation site; the end plus tail signal AATAAA is underlined, and poly (A) is in italics.

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將預(yù)測得到的OrFMRFamide基因的氨基酸序列放到NCBI上進(jìn)行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)其與其他物種的FMRFamide基因有較高的同源性，下載這些物種的氨基酸序列，使用MEGA-X軟件構(gòu)建進(jìn)化樹 (圖2)。結(jié)果顯示，瘤背石磺和靜水椎實(shí)螺(Lymnaea stagnalis) 聚為一支，再與加利福尼亞海兔、棕蝸牛 (Cornu aspersum) 等腹足綱軟體動(dòng)物聚為一大支，與雙殼綱海洋貝類聚為一大支，與環(huán)節(jié)動(dòng)物和節(jié)肢動(dòng)物各聚為一支。瘤背石磺與靜水椎實(shí)螺進(jìn)化關(guān)系最為接近。

圖2 利用MEGA-X軟件基于NJ法構(gòu)建的FMRFamide系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 2 NJ phylogenetic tree of FMRFamide by MEGA-X

2.3 OrFMRFamide在不同組織中的表達(dá)分析

熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，OrFMRFamide基因在神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)量極顯著高于在其他組織的(P＜0.01)，此外，該基因也在血細(xì)胞、肝胰腺、皮膚、性腺組織中表達(dá)，幾乎不在肌肉和腹足中表達(dá) (圖3)。以性腺的表達(dá)量為參照，血細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)、肝胰腺和皮膚的表達(dá)量分別約為性腺的2.33、1 025.47、36.96和6.86倍。

圖3 OrFMRFamide在各組織的相對表達(dá)量**. 極顯著性差異 (P＜0.01)Figure 3 mRNA relative expression of OrFMRFamide in different tissues**. Very significant at 0.01 level (P＜0.01)

2.4 FMRFamide多肽免疫組織化學(xué)分析

利用免疫組織化學(xué)的方法分析瘤背石磺FMRFamide神經(jīng)肽在神經(jīng)節(jié)、肝胰腺、肌肉、性腺、皮膚和腹足中的分布情況 (圖4)，結(jié)果顯示OrFMRFamide基因在不同組織中的表達(dá)模式和FMRF-amide神經(jīng)肽的分布水平相一致，在神經(jīng)節(jié)中大量表達(dá)，在性腺、皮膚和肝胰腺中微量表達(dá)，在腹足和肌肉中幾乎不表達(dá)。

圖4 免疫組化結(jié)果a. 神經(jīng)節(jié)；b. 腹足；c. 肝胰腺；d. 肌肉；e. 皮膚；f. 性腺；箭頭表示FMRFamide多肽Figure 4 Immunohistochemistry resultsa. Ganglia; b. Pleopod; c. Hepatopancreas; d. Muscle; e. Skin; f. Gonad; arrows represent FMRFamide polypeptides.

2.5 OrFMRFamide在LPS刺激后的時(shí)空表達(dá)分析

基于瘤背石磺OrFMRFamide基因在不同組織中的相對表達(dá)量，研究該基因在LPS刺激后48 h內(nèi)的表達(dá)變化 (圖5)。LPS組肝胰腺中OrFMRF-amide基因的表達(dá)量在注射后第12小時(shí)達(dá)最高值，與PBS組差異顯著 (P＜0.05)，皮膚中OrFMRFamide基因的表達(dá)量隨時(shí)間變化差異不大，但LPS組整體的表達(dá)量顯著高于PBS對照組 (P＜0.05)，神經(jīng)節(jié)中該基因的表達(dá)量在第12 小時(shí)達(dá)最高值，整體表達(dá)水平顯著高于PBS對照組 (P＜0.05)，血細(xì)胞中該基因的相對表達(dá)量在第12小時(shí)達(dá)最高值，性腺中的表達(dá)量隨時(shí)間變化的差異不顯著，且LPS組和PBS組差異也不顯著 (P＞0.05)。

圖5 OrFMRFamide基因在炎癥刺激后在不同組織中的相對表達(dá)量圖中不同字母表示差異顯著 (P＜0.05)Figure 5 Relative expression of OrFMRFamide gene in different tissues after inflammatory stimulationDifferent letters in the figure indicate significant difference (P＜0.05).

3 討論

本研究克隆了瘤背石磺FMRFamide基因，系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示其與靜水椎實(shí)螺、棕蝸牛聚為一支，說明其與軟體動(dòng)物門腹足綱貝類的親緣關(guān)系非常近，與軟體動(dòng)物雙殼綱貝類明顯區(qū)分開來。

神經(jīng)節(jié)、肝胰腺和血細(xì)胞屬于NEI (神經(jīng)節(jié)、肝胰腺、血細(xì)胞) 系統(tǒng)，有報(bào)道指出NEI系統(tǒng)在應(yīng)激和感染過程中能維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，有效清除病原體，調(diào)節(jié)機(jī)體平衡，減少對宿主的傷害[15]。FMRFamide作為軟體動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中的重要組成部分[16]，實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果顯示OrFMRFamide在神經(jīng)節(jié)、血細(xì)胞和肝胰腺組織中均有較高的表達(dá)，在神經(jīng)節(jié)中表達(dá)量最高，可能因?yàn)槠鋮⑴c神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)遞質(zhì)的合成和釋放及神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的可塑性調(diào)節(jié)。楊金龍等[17]在研究厚殼貽貝 (Mytilus coruscus) 早期幼蟲發(fā)育時(shí)也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MRFamide大量存在于神經(jīng)系統(tǒng)中。在其他軟體動(dòng)物如雙殼綱[7,18]、腹足綱[19]、頭足綱[20]中，F(xiàn)MRFamide多肽也被報(bào)道主要存在于神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和血細(xì)胞中。FMRFamide在瘤背石磺NEI系統(tǒng)中的高表達(dá)說明該基因可能對瘤背石磺的穩(wěn)態(tài)起重要作用，推測FMRFamide可能在神經(jīng)節(jié)、肝胰腺和血細(xì)胞中合成和加工，然后通過自分泌/旁分泌信號通路釋放到血細(xì)胞中來調(diào)節(jié)機(jī)體。熒光定量結(jié)果顯示瘤背石磺FMRFamide還存在于皮膚中，高鳳娟等[21]和Allan等[22]對花背蟾蜍 (Bufo raddei) 和北美木蛙(Rana sylvatica) 的研究表明，兩棲類動(dòng)物皮膚具有先天免疫功能，說明瘤背石磺作為無貝殼的兩棲型貝類，為適應(yīng)潮間帶惡劣的生存環(huán)境，F(xiàn)MRFamide多肽可能參與了其先天免疫。FMRFamide應(yīng)用免疫組化學(xué)進(jìn)一步證實(shí)了OrFMRFamide在不同組織中的分布和FMRFamide多肽的分布一致，這與Terrnina等[23]對貓肝吸蟲 (Opisthorchis felineus) 和Allan等[22]對星蟲 (Themiste lageniformis)中FMRFamide的定位結(jié)果相似。

炎癥刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，瘤背石磺神經(jīng)節(jié)、肝胰腺和血細(xì)胞中FMRFamide基因相對表達(dá)量變化趨勢為先上升后降低，在注射脂多糖12 h后的表達(dá)量達(dá)最大值，說明FMRFamide可能參與了免疫防御反應(yīng)。在無脊椎動(dòng)物中，血細(xì)胞被認(rèn)為是宿主在免疫防御反應(yīng)中起重要作用的免疫相關(guān)細(xì)胞[24]，更有研究表明免疫細(xì)胞可以通過自分泌信號途徑重新合成神經(jīng)肽來調(diào)節(jié)肌體免疫反應(yīng)[25-27]。Wang等[28]用寄生蟲感染光滑雙臍螺 (Biomphalaria glabrata)，發(fā)現(xiàn)FMRFamide相對表達(dá)量高于對照組，F(xiàn)MRFamide表達(dá)量上升以抵抗寄生蟲感染，這和本研究結(jié)果一致，可以推測FMRFamide多肽能保護(hù)機(jī)體免受侵害，響應(yīng)免疫刺激，在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。炎癥刺激后瘤背石磺性腺中FMRFamide相對表達(dá)量變化不顯著，Hada等[29]研究發(fā)現(xiàn)FMRFamide還能影響根結(jié)線蟲 (Meloidogyne graminicola) 的繁殖因子，Kerbl等[30]的研究也證實(shí)FMRFamide能作用于生殖腺，影響動(dòng)物的交配行為，推測瘤背石磺性腺中的FMRFamide可能對瘤背石磺的繁殖有影響，但不參與維持自身穩(wěn)態(tài)。