孔維一，王雪涵，董 昆，葛雨萱

(北京市香山公園管理處，北京100093)

植物與土壤微生物是影響土壤碳、氮輸入輸出過程的重要因素[1]，地上植物的生長對(duì)地下土壤環(huán)境會(huì)產(chǎn)生一定程度的影響，如植物凋落物、根系分泌物質(zhì)及改良土壤通氣性等方面[2]。植被生態(tài)恢復(fù)是通過增加植被蓋度、減少水土養(yǎng)分流失，經(jīng)微生物對(duì)植物殘?bào)w、根系分泌物產(chǎn)生作用，調(diào)節(jié)土壤理化性質(zhì)、增加土壤酶活性及有機(jī)質(zhì)含量，使植被與微生物形成相互調(diào)節(jié)的復(fù)合系統(tǒng)[3-5]。

研究表明[6]古樹周邊地被植物的生長對(duì)土壤中微生物總量有明顯影響。不同的地上植物群落會(huì)影響地下土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)[7],土壤微生物又能通過自身的正向或負(fù)向反饋?zhàn)饔谜{(diào)節(jié)地上植物的種類構(gòu)成和生長發(fā)育[8]。

本研究通過對(duì)古樹油松下地被植物進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)，并對(duì)古樹油松下土壤細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究，為古樹下植被生態(tài)恢復(fù)及古樹下土壤細(xì)菌群落多樣性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 地被植物調(diào)查

在香山公園內(nèi)選取二級(jí)古樹油松30株，于2019年、2020年連續(xù)2年的春季(4月至5月)和夏季(7月至8月)進(jìn)行地被調(diào)查。以油松樹體為圓心，調(diào)查半徑2 m內(nèi)生長地被植物狀況，統(tǒng)計(jì)地被植物覆蓋情況、海拔分布、花色、株高、出現(xiàn)頻率(頻數(shù)/總數(shù))(表1)。

1.2 土壤樣品采集

在香山公園內(nèi)靜翠湖、唳霜皋、昭廟、眼鏡湖及碧云寺等區(qū)域，選取立地環(huán)境一致，不同地被狀況的二級(jí)古樹油松13株，其中無地被4株、人工地被4株及野生地被5株。在古樹根際范圍，去除土壤表層雜草、石礫，采集20 cm 深的地被根際土壤，過篩后裝入無菌離心管內(nèi)，每個(gè)樣品3次重復(fù)。

1.3 土壤細(xì)菌16s rDNA V3-V4區(qū)基因PCR擴(kuò)增引物

根據(jù)Chao Yang等的試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)上下游引物[9]。上游引物5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'，下游引物5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。

表1 樣品采集信息Tab.1 Sample acquisition information

1.4 PCR體系及程序

PCR體系：DNA模板30 ng，F(xiàn)orward Primer(5 μM) 1 μL,Reverse Primer (5 μM)1 μL，BSA 3 μL，2xTaq Plus Master Mix12.5 μL，ddH2O 7.5-X μL

PCR擴(kuò)增程序采?。?4 ℃預(yù)熱 5 min；94 ℃保持30 s，55 ℃保持30 s，72 ℃保持60 s，28個(gè)循環(huán)；72 ℃保持7 min，使產(chǎn)物充分延伸；4 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠，170 V，電泳時(shí)間30 min。MiSeq文庫構(gòu)建、上機(jī)測序等工作由北京奧維森基因科技有限公司完成。

1.5 數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)下機(jī)以Fastq格式存儲(chǔ)，將下機(jī)數(shù)據(jù)拼接，去除嵌合體以及短序列得到優(yōu)質(zhì)序列。對(duì)序列進(jìn)行歸類操作，按照序列97%相似性分為一個(gè)分類單元，使用RDP Classifier算法或blast等方法對(duì)OTU代表序列進(jìn)行比對(duì)分析，并在各個(gè)水平(界、門、綱、目、科、屬、種)注釋群落物種信息。使用qiime對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行抽平處理，計(jì)算以下alpha多樣性指數(shù)：Chao1(菌種豐富度指數(shù))、observed species(隨測序深度的增加，實(shí)際觀測到的OTU個(gè)數(shù))、PD whole tree(譜系多樣性，數(shù)值越大，群落多樣性越高)和 shannon(微生物多樣性指數(shù)，值越大，群落多樣性越高)。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 古樹油松地被植物調(diào)查結(jié)果

2.1.1 古樹油松地被植物春季調(diào)查結(jié)果 2019年、2020年春季對(duì)香山公園內(nèi)二級(jí)油松古樹下地被植物進(jìn)行調(diào)查，如表2所示，共有15個(gè)科、18個(gè)屬、18個(gè)種地被植物，分布在110至309 m海拔之間，株高范圍在3.2至49.2 cm之間，其中胡枝子、菊花腦、薹草、沙地柏為人工種植地被植物，其余均為野生地被植物。春季古樹油松地被植物中，出現(xiàn)頻率最高的前五種為抱莖苦荬菜、短尾鐵線蓮、求米草、胡枝子、菊花腦。

2.1.2 古樹油松地被植物夏季調(diào)查結(jié)果 2019年、2020年夏季對(duì)香山公園內(nèi)二級(jí)油松古樹下地被植物進(jìn)行調(diào)查，如表3所示，共有14個(gè)科、18個(gè)屬、18個(gè)種的地被植物，分布在110～309 m海拔之間，株高范圍在2.4～92.8 cm之間，其中菊花腦、胡枝子、薹草、沙地柏為人工種植地被植物，其余均為野生地被植物。夏季古樹油松下地被植物出現(xiàn)頻率最高的五種為：狗尾草、求米草、菊花腦、胡枝子、薹草和鐵莧菜。

表2 古油松地被植物春季調(diào)查統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.2 Statistics of ground cover plants ancient P. tabuliformis in spring

表3 古油松地被植物夏季調(diào)查統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.3 Statistics of ground cover plants ancient P. tabuliformis in summer

2.2 古樹油松土壤樣品測序結(jié)果與數(shù)據(jù)質(zhì)控

油松13份土壤樣品共得到有效序列1 458 640條，優(yōu)質(zhì)序列1445316條，占有效序列條數(shù)的98%以上，如表4所示，優(yōu)質(zhì)序列長度在260～540 bp之間，多數(shù)集中在400～440 bp之間。

表4 油松土壤細(xì)菌序列拼接結(jié)果

隨測序數(shù)據(jù)量的增加，樣品稀釋曲線趨于平坦，說明土壤細(xì)菌基因測序結(jié)果基本覆蓋樣品中絕大多數(shù)細(xì)菌的生物學(xué)信息，可以用于后續(xù)結(jié)果分析。

2.3 古樹土壤細(xì)菌群落豐富度與多樣性分析

由圖1所示，SPSS分析表明，不同地被狀況的3組樣品在4項(xiàng)Alpha多樣性指數(shù)上差異不顯著。其中chao1指數(shù)顯示YY組(油松野生地被)土壤樣品的菌種豐富度最高，YW組(油松無地被)土壤樣品的菌種豐富度最低。observed species指數(shù)和PD whole tree指數(shù)呈現(xiàn)相似規(guī)律性，YR組(油松人工地被)土壤樣品的細(xì)菌群落多樣性最高，YW組(油松無地被)土壤樣品細(xì)菌群落多樣性最低。

2.4 古樹土壤細(xì)菌群落分類學(xué)組成分析

2.4.1 油松土壤細(xì)菌群落門水平的組成分析 根據(jù)測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)(圖2)，油松古樹土壤樣品中的細(xì)菌分屬于41門、108綱、136目、271科、397屬。在門水平上，相對(duì)豐度大于1%的依次為酸桿菌門、放線菌門、變形菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門、硝化螺旋菌、擬桿菌門、護(hù)微菌門、浮霉菌門、疣微菌門、厚壁菌門。3種地被狀況的土壤樣品中，優(yōu)勢菌門均為酸桿菌門、放線菌門和變形菌門，其中酸桿菌門相對(duì)豐度均最高，YW組酸桿菌門相對(duì)豐度為34%，YR組酸桿菌門相對(duì)豐度為33.75%，YY組酸桿菌門相對(duì)豐度為30.20%；其次為變形菌門，YW組變形菌門相對(duì)豐度為22.25%，YR組變形菌門相對(duì)豐度為21.50%，YY組變形菌門相對(duì)豐度為24%；第三為放線菌門，YW組放線菌門的相對(duì)豐度為19.25%，YR組放線菌門相對(duì)豐度為18.50%，YY組放線菌門相對(duì)豐度為21.40%。

2.4.2 油松土壤細(xì)菌群落科水平的組成分析 根據(jù)測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)(圖3)，相對(duì)豐度大于1%的依次為Blastocatellaceae Subgroup 4科、Gemmatimonadaceae科、0319-6A21科、Nitrosomonadaceae科、Desulfurellaceae科、Xanthomonadales Incertae Sedis科、Hyphomicrobiaceae科、Xanthobacteraceae科、Rhodospirillaceae科、Gaiellaceae科、Pseudonocardia ceae科、Micrococcaceae科、Sphingomonadaceae科、Planctomycetaceae科、Micromonosporaceae科。三種地被狀況的土壤樣品中，優(yōu)勢菌科為Blastocatellaceae Subgroup4科，其相對(duì)豐度占比最高，YW組Blastocatellaceae Subgroup4科相對(duì)豐度為8.85%，YR組Blastocatellaceae Subgroup4科相對(duì)豐度為8.91%，YY組Blastocatellaceae Subgroup4科相對(duì)豐度為8.07%；其次為Gemmatimonadaceae科，YW組Gemmatimonadaceae科相對(duì)豐度為2.8%，YR組Gemmatimonadaceae科相對(duì)豐度為2.79%，YY組Gemmatimonadaceae科相對(duì)豐度為3.15%；第三為0319-6A21科，YW組0319-6A21科的相對(duì)豐度為1.60%，YR組0319-6A21科相對(duì)豐度為2.55%，YY組0319-6A21科相對(duì)豐度為2.19%。

2.4.3 油松土壤細(xì)菌群落屬水平的組成分析 根據(jù)測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)(圖4)，在屬水平上，相對(duì)豐度大于1%的依次為RB41屬、H16屬、Gaiella屬、Pseudarthrobacter屬、Sphingomonas屬。3種地被狀況的土壤樣品中，優(yōu)勢菌屬為RB41屬，其RB41屬相對(duì)豐度占比最高，YW組RB41屬相對(duì)豐度為7.07%，YR組RB41屬相對(duì)豐度為7.01%，YY組RB41屬相對(duì)豐度為6.74%；其次為H16屬，YW組H16屬相對(duì)豐度為0.94%，YR組H16屬相對(duì)豐度為1.54%，YY組H16屬相對(duì)豐度為1.32%；第三為Gaiella屬，YW組Gaiella屬的相對(duì)豐度為1.19%，YR組Gaiella屬相對(duì)豐度為1.33%，YY組Gaiella屬相對(duì)豐度為1.22%。

3 結(jié)論與討論

整體來說，古樹油松下地被常呈斑塊狀分布，地被豐富度不高，且長勢一般，這與古樹凋落物腐爛分解緩慢有關(guān)。根據(jù)調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，春季古樹油松地被植物中，出現(xiàn)頻率最高的為抱莖苦荬菜、短尾鐵線蓮、求米草、胡枝子、菊花腦。夏季古樹油松下地被植物出現(xiàn)頻率最高的為：狗尾草、求米草、菊花腦、胡枝子、鐵莧菜和薹草。這其中胡枝子、菊花腦和薹草為人工種植地被，抱莖苦荬菜、狗尾草和鐵莧菜三種野生地被綠期較短，短尾鐵線蓮為藤本，不便于養(yǎng)護(hù)管理，求米草為香山公園優(yōu)勢野生地被植物，植株矮小，根系發(fā)達(dá)，自身繁殖及覆地能力較強(qiáng)，能有效改善古樹下地面斑禿狀況，較適合推廣應(yīng)用。

利用高通量測序技術(shù)對(duì)香山公園內(nèi)古樹油松下地被根際土壤進(jìn)行了細(xì)菌多樣性分析及分類學(xué)組成分析。研究結(jié)果表明，無地被古樹油松土壤樣品細(xì)菌多樣性低于人工地被組和野生地被組，說明地被植物對(duì)古樹油松下土壤中的細(xì)菌有一定影響，可以提高土壤中細(xì)菌群落的豐富度，與高秀宏[10]的結(jié)果相似；人工地被組與野生地被組也存在一定程度差異，由分類學(xué)組成可以看出，野生地被組放線菌門相對(duì)豐度大于人工地被組，酸桿菌門相對(duì)豐度小于人工地被組，說明人為干擾會(huì)影響油松土壤細(xì)菌的構(gòu)成，這一結(jié)果與薛亞芳[11]相似，人為干擾會(huì)使土壤中酸桿菌門的相對(duì)豐度增加，酸桿菌門常以貧營養(yǎng)方式生長[12],說明無地被狀況的古樹土壤生境營養(yǎng)物質(zhì)較缺乏。

土壤微生物情況受多種因素影響，今后可開展土壤pH、EC值、含水量等理化性質(zhì)與土壤微生物相關(guān)指標(biāo)的研究，監(jiān)測地被植物對(duì)古樹生長環(huán)境變化的影響。