張志歡，孫 雄, 2，王兆麗，王 乾，張 濤*

(1.北京農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206； 2.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司，北京 100070)

內(nèi)皮糖萼(endothelial glycocalyx)亦稱(chēng)“細(xì)胞衣”或“糖衣”，是內(nèi)皮細(xì)胞表面一層富含多糖的絨毛狀結(jié)構(gòu)[1, 2]，由蛋白聚糖和糖蛋白構(gòu)成骨架分子與細(xì)胞膜相連，骨架分子上伸出大量的寡糖鏈。內(nèi)皮糖萼覆蓋于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，具有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞[3]、調(diào)節(jié)血管壁的屏障和選擇性通透[4, 5]、感受血流作用力[6]等作用，尤其對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞(microvascular endothelial cells，MVECs)，其大部分功能的發(fā)揮均有內(nèi)皮糖萼的參與[7]。鑒于中藥多糖與內(nèi)皮糖萼在化學(xué)組成上的相似性，推測(cè)外源性中藥多糖應(yīng)能有助于改善內(nèi)皮糖萼的結(jié)構(gòu)或功能。前期研究[8, 9]表明，黃芪多糖(astragalus polysaccharide，APS)能顯著增加大鼠空腸黏膜MVECs糖萼的厚度，影響糖萼糖鏈的含量。MVECs的廣泛生物學(xué)功能主要在于其能夠產(chǎn)生多種多樣的生物活性物質(zhì)，中藥多糖能夠通過(guò)調(diào)控內(nèi)皮生物活性物質(zhì)的產(chǎn)生而影響MVECs的功能，而其對(duì)內(nèi)皮生物活性物質(zhì)的調(diào)控與對(duì)糖萼糖鏈作用的相關(guān)性尚不清楚。為了解內(nèi)皮糖萼糖鏈在中藥多糖調(diào)控MVECs分泌生物活性物質(zhì)中的作用，本試驗(yàn)體外分離培養(yǎng)大鼠空腸黏膜MVECs，以肝素酶III(heparinase III，Hep III)處理，去除部分糖萼糖鏈，然后使用APS干預(yù)，檢測(cè)一氧化氮(nitric oxide，NO)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和白介素6(interleukin 6，IL-6)分泌的變化。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設(shè)備

倒置熒光顯微鏡(Olympus，IX71型)，酶標(biāo)儀(Thermofisher，Multiskan Ascent型)，分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器有限公司，UV-2000型)，等。

1.2 主要試劑與藥品

胎牛血清(Hyclone，貨號(hào)SH30084.03E)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco，貨號(hào)H2387)，Hep III(SIGMA，貨號(hào)H8891)，IL-6 ELISA試劑盒(Abcam，貨號(hào)ab100772)，NO測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)A012)，SOD測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)A001)，APS(純度67%)由北京生泰爾生物科技有限公司惠贈(zèng)，等。

1.3 MVECs分離培養(yǎng)

本試驗(yàn)所用MVECs分離培養(yǎng)自7日齡SD大鼠空腸黏膜組織，參照相關(guān)文獻(xiàn)[9, 10]中的方法進(jìn)行。即無(wú)菌取大鼠空腸組織，剪成約5 cm小段，縱向剖開(kāi)、漂洗，刮取腸黏膜組織于0.1%膠原酶Ⅱ型溶液，剪碎，消化約60 min至無(wú)明顯組織塊，過(guò)孔徑100 μm細(xì)胞篩，濾液1 000 r/min離心5 min，沉淀用含20%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基重懸、接種，置于含5% CO2、37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱靜置孵育，2 h后洗去未貼壁細(xì)胞，更換完全培養(yǎng)基后繼續(xù)靜置培養(yǎng)至匯合狀態(tài)。胰蛋白酶消化脫壁，傳代培養(yǎng)，采用血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule，PECAM-1)免疫熒光染色法進(jìn)行鑒定。

1.4 細(xì)胞分組與處理

將大鼠空腸黏膜MVECs傳代于96孔板，分為對(duì)照組、APS組、Hep III組和Hep III + APS組，每組5孔。待細(xì)胞生長(zhǎng)至亞匯合狀態(tài)后，各組更換為含2%胎牛血清的維持培養(yǎng)基。其中，對(duì)照組維持培養(yǎng)基不作處理，APS組維持培養(yǎng)基另含50 μg/mL APS；Hep III組在更換維持培養(yǎng)基前2 h，先加入終濃度為20 mU/mL Hep III預(yù)處理；Hep III + APS組在更換維持培養(yǎng)基前2 h先加入終濃度為20 mU/mL Hep III預(yù)處理，維持培養(yǎng)基中另含50 μg/mL APS。各組細(xì)胞在更換維持培養(yǎng)基24 h后，采取培養(yǎng)基上清，離心后檢測(cè)NO、IL-6的含量和SOD的活力。

1.5 細(xì)胞因子的檢測(cè)

細(xì)胞培養(yǎng)基上清中NO含量和SOD活力采用生化試劑盒檢測(cè)，IL-6的含量采用ELISA試劑盒檢測(cè)，操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)中進(jìn)行，計(jì)算NO、IL-6的濃度和SOD的活力。

各組數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，在F檢驗(yàn)(雙樣本方差檢驗(yàn))的基礎(chǔ)上，對(duì)各指標(biāo)采用Excel軟件中“等方差t-檢驗(yàn)”進(jìn)行組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異比較。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠空腸黏膜MVECs的形態(tài)與鑒定

分離培養(yǎng)的大鼠空腸黏膜MVECs呈紡錘形或多邊形，大多數(shù)細(xì)胞有2個(gè)長(zhǎng)凸起，生長(zhǎng)至匯合狀態(tài)后呈單層，出現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)抑制，經(jīng)PECAM-1免疫熒光染色鑒定顯示(圖1)，95%以上細(xì)胞呈陽(yáng)性著色。細(xì)胞的傳代培養(yǎng)特性良好，連續(xù)傳至20余代時(shí)未見(jiàn)明顯形態(tài)變化。

2.2 NO分泌量的變化

對(duì)各組細(xì)胞培養(yǎng)基上清中NO含量的檢測(cè)結(jié)果顯示(圖2)，大鼠空腸黏膜MVECs正常情況下分泌一定量的NO；培養(yǎng)基中添加APS孵育后NO的含量略有增加(P>0.05)；Hep III組消化除去部分糖鏈后，培養(yǎng)基中NO含量與對(duì)照組比較顯著降低(P<0.05)；APS與Hep III共同處理時(shí)，MVECs的NO分泌量高于Hep III單獨(dú)處理時(shí)，而顯著性低于APS組(P<0.05)，與對(duì)照組比較，二者統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2.3 SOD活力的變化

APS和Hep III處理對(duì)大鼠空腸黏膜MVECs產(chǎn)生SOD的影響與NO類(lèi)似。結(jié)果顯示(圖3)，對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)基中有一定的SOD活力；培養(yǎng)基中加入APS孵育后，其SOD的活力比對(duì)照組有一定程度的升高(P>0.05)；Hep III處理部分去除內(nèi)皮糖萼糖鏈后，SOD的活力顯著性下降(P<0.05)；而APS和Hep III共同孵育處理MVECs時(shí)，SOD活力顯著性低于APS組(P<0.05)，而與對(duì)照組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明二者無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2.4 IL-6分泌量的變化

檢測(cè)結(jié)果顯示(圖4)，大鼠空腸黏膜MVECs正常情況下分泌一定量的IL-6；細(xì)胞培養(yǎng)基中加入APS處理后，IL-6的分泌量顯著下降(P<0.05)，而Hep III處理后其分泌量顯著上升(P<0.05)；采用APS和Hep III共同孵育處理時(shí)，IL-6的分泌量較Hep III組下降，而極顯著性高于APS組(P<0.01)，與正常對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

3 討 論

盡管早在1966年內(nèi)皮糖萼已通過(guò)電子顯微鏡被首次觀察到[11]，但直至過(guò)去十?dāng)?shù)年中才對(duì)其組成和功能逐漸了解。在以蛋白聚糖和糖蛋白等為主構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)基體中，大量的內(nèi)皮源性或血源性可溶性分子嵌入其中。內(nèi)皮糖萼的破壞或脫落不僅影響白細(xì)胞與MVECs的黏附，也會(huì)使細(xì)胞因子等可溶性分子的合成和降解失去動(dòng)態(tài)平衡，其完整性對(duì)MVECs功能的正常發(fā)揮具有重要意義。APS因其在抗氧化、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等方面的生物學(xué)作用而被熟知和廣泛應(yīng)用[12, 13]，在前期研究表明APS顯著改善內(nèi)皮糖萼厚度和糖鏈含量的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)進(jìn)一步深入探索了APS調(diào)控內(nèi)皮糖萼與內(nèi)皮細(xì)胞因子分泌的相關(guān)性。結(jié)果表明，Hep III部分去除內(nèi)皮糖萼，能顯著降低APS對(duì)大鼠空腸黏膜MVECs分泌NO、SOD和IL-6的作用。

內(nèi)皮糖萼糖鏈不僅能夠保護(hù)MVECs免受致病因子損傷，維持其細(xì)胞因子合成功能，而且糖鏈形成的細(xì)胞表面網(wǎng)篩狀結(jié)構(gòu)，也為大量細(xì)胞因子的停泊提供了可能，這些生物活性分子影響著其所在局部的環(huán)境，維持著局部微環(huán)境的穩(wěn)定。本試驗(yàn)基于APS的常見(jiàn)生物學(xué)作用，選擇了機(jī)體細(xì)胞功能的重要信使和效應(yīng)分子NO，通過(guò)清除氧自由基對(duì)機(jī)體氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要作用SOD，及對(duì)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答具有多效性作用的IL-6，作為評(píng)價(jià)內(nèi)皮糖萼在APS調(diào)控細(xì)胞因子分泌中作用的指標(biāo)。Hep III能夠特異性切割硫酸乙酰肝素類(lèi)分子中GlcNS/GlcNAc(1→4)GlcA之間的鏈接鍵，常用來(lái)部分降解去除內(nèi)皮糖萼的糖鏈[14]，本試驗(yàn)亦選擇Hep III作為內(nèi)皮糖萼糖鏈的降解酶。

當(dāng)前細(xì)胞因子對(duì)內(nèi)皮糖萼糖鏈影響的文獻(xiàn)報(bào)道較多，而有關(guān)內(nèi)皮糖萼在細(xì)胞因子分泌中作用的研究文獻(xiàn)較少。Nikmanes等[15]研究認(rèn)為，采用肝素酶破壞內(nèi)皮糖萼后，內(nèi)皮性一氧化氮合酶的合成受阻；本試驗(yàn)使用Hep III處理后，大鼠空腸黏膜MVECs分泌NO下降，其機(jī)制是否與一氧化氮合酶的合成受阻有關(guān)尚需進(jìn)一步研究。而Dekker等[16]以透明質(zhì)酸酶處理內(nèi)皮糖萼后發(fā)現(xiàn)，能夠刺激流體依賴(lài)性?xún)?nèi)皮源NO的釋放，這與本試驗(yàn)使用Hep III的靜態(tài)處理結(jié)果不同，這表明內(nèi)皮糖萼的降解對(duì)內(nèi)皮源性NO產(chǎn)生的影響是多方面的，其生物學(xué)效應(yīng)需要綜合分析。Ramnath等[17]研究發(fā)現(xiàn)，促炎細(xì)胞因子IL-6在炎癥引起游離糖萼組分升高時(shí)會(huì)進(jìn)一步釋放；Huang等[18]研究也顯示，小檗堿通過(guò)減緩LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮糖萼降解，能夠抑制IL-6的產(chǎn)生及活性氧自由基的增加，這表明破壞內(nèi)皮糖萼是IL-6產(chǎn)生及活性氧自由基增加的原因之一。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，Hep III處理誘導(dǎo)IL-6分泌增加和SOD活性下降，SOD活性的下降可能是造成活性氧自由基的重要原因，另一方面，Hep III降解部分內(nèi)皮糖萼糖鏈，顯著抑制了APS對(duì)NO、SOD和IL-6的影響，這也表明內(nèi)皮糖萼在APS調(diào)控大鼠空腸黏膜MVECs分泌生物活性物質(zhì)中具有重要作用。

綜上所述，本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，內(nèi)皮糖萼糖鏈在APS誘導(dǎo)大鼠空腸黏膜MVECs分泌細(xì)胞因子NO、SOD和IL-6中具有重要作用，其降解能夠顯著抑制APS對(duì)NO和SOD分泌的上調(diào)作用及對(duì)IL-6分泌的下調(diào)作用。