張艷慧，鄭寶強(qiáng)，繆 崑，侯芳梅，王 雁*

(1.國(guó)家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091； 2. 北京農(nóng)學(xué)院 園林學(xué)院，北京102206)

石斛蘭(Dendrobium)是蘭科石斛屬植物的總稱，為蘭科(Orchidaceae)的第二大屬[1]。石斛屬植物有著極高的觀賞價(jià)值，與卡特蘭(Cattleya)、蝴蝶蘭(Phalaenopsis)、文心蘭(Oncidium)同為世界上四大觀賞洋蘭[2]。隨著人們對(duì)觀賞石斛消費(fèi)需求的擴(kuò)大，觀賞石斛的育種已成為越來(lái)越關(guān)注的熱點(diǎn)[3]。有研究表明石斛屬內(nèi)有很多種有自交不親和現(xiàn)象，部分種也有異交不親和現(xiàn)象[4]，所以研究石斛屬植物胚發(fā)育是解決雜交敗育及進(jìn)行胚搶救育種的第一步。

蘭科植物中授粉后花粉管的長(zhǎng)出會(huì)刺激大孢子的發(fā)育和雌配子體的形成，持續(xù)50～90 d。從授粉到果實(shí)成熟需要6～8個(gè)月。授粉后6周左右，大花杓蘭(Cypripediummacranthum)的種胚發(fā)育為球形胚[5]。無(wú)距蝦脊蘭(Calanthetsoongiana)授粉后60 d，合子形成完成受精，合子第一次橫向分裂為基細(xì)胞和頂細(xì)胞，頂細(xì)胞發(fā)生縱裂，之后經(jīng)過(guò)數(shù)次胚細(xì)胞的分裂形成成熟的胚胎[6]。扇脈杓蘭(Cypripediumjaponicum)授粉前，子房的胎座有稍許分化，在胎座形成一些突起。在授粉10 d后，胎座分化出隆起的胚珠原基，胚原基頂端的孢原細(xì)胞，分化為具有明顯細(xì)胞核的大孢子母細(xì)胞，之后胚原基基部的細(xì)胞突起形成內(nèi)珠被，然后外珠被開(kāi)始發(fā)育。授粉后35 d，發(fā)育成熟的雌配子體準(zhǔn)備好受精。受精后經(jīng)95 d胚胎發(fā)育成熟，其胚胎發(fā)育過(guò)程和無(wú)距蝦脊蘭類似，也為石竹型[7]。

本研究旨在通過(guò)對(duì)金釵石斛(Den.nobile)大孢子發(fā)生、雌配子體發(fā)育以及胚發(fā)育等進(jìn)行研究，為石斛屬植物生殖生物學(xué)研究提供相關(guān)資料，為研究石斛屬雜交育種敗育現(xiàn)象奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)材料為中國(guó)林科院科研溫室內(nèi)的金釵石斛。于2017年2、3月份對(duì)金釵石斛開(kāi)花植株進(jìn)行人工授粉、標(biāo)記。金釵石斛授粉后每隔10 d取1次果莢，每次3個(gè)，以授粉前子房為對(duì)照，將樣品切塊放在2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的混合溶液中，經(jīng)1%的鋨酸室溫固定，然后將樣品依次經(jīng)過(guò)50%、70%、80%、90%、100%的丙酮溶液脫水。逐步完成丙酮和Spurr樹(shù)脂的置換和浸透，樣品放入新配制的Spurr樹(shù)脂中靜置1 h后放入60 ℃烘箱中24 h完成包埋與聚合，將包埋好的樣品用超薄切片機(jī)切片，切片厚度3 μm，在切片上滴加數(shù)滴濃度為0.5%的甲苯胺藍(lán)溶液，染色3～4 min后，用蒸餾水沖洗干凈，在光學(xué)顯微鏡下觀察然后拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育

金釵石斛的子房為側(cè)膜胎座三心皮(圖1-A)，在授粉前，胎座未發(fā)育(圖1-B)。授粉后，胎座之間空隙變大，胎座上細(xì)胞開(kāi)始迅速增殖分裂，在內(nèi)膜脊上形成指狀突起，授粉后10 d每個(gè)胎座上分化出一些小枝(圖1-A)。授粉后20 d，每個(gè)胎座上的小枝又繼續(xù)分化，指狀突起數(shù)量變多(圖1-C,D)。隨著胎座小枝上細(xì)胞持續(xù)分裂，子房不斷膨大。授粉后30 d，指狀突起分化為成千上萬(wàn)個(gè)胚珠原基，由一列細(xì)胞外加一層表皮細(xì)胞組成，位于胚珠原基末端的細(xì)胞體積增大變?yōu)殒咴?xì)胞(圖1-E)。

授粉后40 d，相對(duì)于其他細(xì)胞，體積明顯增大，孢原細(xì)胞變?yōu)榧?xì)胞核明顯的大孢子母細(xì)胞(圖1-F)。隨著大孢子母細(xì)胞的體積不斷增大，胚珠原基開(kāi)始彎曲，最后整個(gè)胚珠體發(fā)生180度的轉(zhuǎn)換(圖1-G)，珠柄與珠孔靠近，形成倒生型胚珠。孢原細(xì)胞發(fā)育為大孢子母細(xì)胞之后，胚珠原基基部的表皮層細(xì)胞向外突起生長(zhǎng)形成衣領(lǐng)狀結(jié)構(gòu)，為內(nèi)珠被(圖1-G)。隨后，外珠被也開(kāi)始發(fā)生，由內(nèi)珠被靠近底部的細(xì)胞分化而來(lái)(圖1-H)。在受精前，內(nèi)珠被不斷向上生長(zhǎng)，包住大孢子母細(xì)胞，在雌配子體成熟前后內(nèi)珠被生長(zhǎng)完成，包住珠心，形成珠孔。隨著內(nèi)珠被的不斷生長(zhǎng)，大孢子母細(xì)胞也不斷伸長(zhǎng)(圖1-I)。

授粉后60 d左右，大孢子母細(xì)胞體積不再繼續(xù)擴(kuò)增，準(zhǔn)備進(jìn)行減數(shù)分裂。大孢子母細(xì)胞減數(shù)第一次分裂是橫向的，產(chǎn)生2個(gè)不對(duì)稱的細(xì)胞(圖1-J)，靠近珠孔方向的細(xì)胞較小很快便壓縮退化(圖1-K)，合點(diǎn)方向的功能性二分體細(xì)胞較大，接下來(lái)發(fā)生橫軸方向上的減數(shù)第二次分裂，形成具有4孢子的直列式四分體， 4個(gè)孢子中只有1個(gè)參加雌配子體的發(fā)育(圖1-L)，其余3個(gè)在四分體形成的過(guò)程中先后退化。參加雌配子形成的大孢子進(jìn)行有絲分裂，第一次分裂形成初生珠孔核和初生合點(diǎn)核(圖1-M)；第二次分裂珠孔方向產(chǎn)生一對(duì)核，合點(diǎn)方向產(chǎn)生一對(duì)核(圖1-N)；第三次分裂珠孔方向和合點(diǎn)方向各形成4個(gè)核，這種由單孢子分裂形成的八核胚囊稱為蓼型胚囊(圖1-O)。從授粉到雌配子體成熟大約需要70 d的時(shí)間，但即使是同一子房其雌配子體發(fā)育的時(shí)間也不完全一致。

2.2 受精后胚的發(fā)育

配子結(jié)合形成受精卵后，細(xì)胞質(zhì)呈均勻狀態(tài)(圖2-A)。授粉后80 d合子進(jìn)行第一次分裂，分裂為兩個(gè)細(xì)胞，包括1個(gè)基細(xì)胞和1個(gè)頂細(xì)胞(圖2-B)，頂細(xì)胞在合點(diǎn)方向，細(xì)胞體積小，基細(xì)胞靠近珠孔方向，液泡很大，基細(xì)胞之后會(huì)分化為胚柄，胚柄起固定胚體的作用，其他組織細(xì)胞的養(yǎng)分可以通過(guò)胚柄運(yùn)輸至胚。授粉后90 d，金釵石斛的頂細(xì)胞發(fā)生橫軸方向上的分裂，基部的細(xì)胞不分裂，形成一列三細(xì)胞原始胚(圖2-C-D)，依此判斷金釵石斛的胚發(fā)生類型為石竹型。但偶有切片觀察發(fā)現(xiàn)頂細(xì)胞首次分裂為縱軸方向上的分裂(圖2-E)。一列三細(xì)胞原胚接下來(lái)的分裂也分為兩種情況：原胚頂端細(xì)胞發(fā)生縱軸方向上的分裂形成4細(xì)胞T型胚體(圖2-F-G)；兩個(gè)頂細(xì)胞同時(shí)在縱軸方向上分裂(圖2-H)。繼續(xù)分裂形成6細(xì)胞、8細(xì)胞原胚，同時(shí)胚柄體積增大。在胚發(fā)育的整個(gè)過(guò)程，內(nèi)珠被沒(méi)有發(fā)育，和外珠被細(xì)胞相比，內(nèi)側(cè)的珠被細(xì)胞較小，由一層緊密排列的細(xì)胞組成，受精之后并逐漸退化濃縮成為一層緊密包裹胚體的超薄細(xì)胞。

授粉后110 d，多次分裂后頂細(xì)胞形成早期球形胚(圖2-I-K)。授粉后120 d，胚細(xì)胞繼續(xù)分裂，數(shù)量變多，囊腔被填充滿，此時(shí)胚柄細(xì)胞已開(kāi)始裂解(圖2-L-M)。授粉后150 d，早期原胚發(fā)育為球形胚，胚柄只留下痕跡，基本完全消失(圖2-N-O)。之后，胚體積穩(wěn)定，有絲分裂停止，胚細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)非常濃厚(圖2-P)。

直至授粉后180 d，金釵石斛種子成熟，胚體大有8～12細(xì)胞長(zhǎng)，6個(gè)細(xì)胞的寬度。成熟的種子分為三部分：內(nèi)種皮、外種皮、胚。隨著胚的發(fā)育，由于珠被細(xì)胞脫水皺縮，內(nèi)外珠被之間形成空氣腔，一直到種子成熟，空氣腔仍沒(méi)有消失(圖2-P)。

3 結(jié)論與討論

一般有花植物的胚珠是伴隨著花的發(fā)育過(guò)程逐漸成熟的，但蘭科植物胚珠發(fā)育具有獨(dú)特的模式，即在授粉前胚珠沒(méi)有發(fā)育或僅有部分不完全發(fā)育，只有在授粉后才能啟動(dòng)進(jìn)一步的發(fā)育。金釵石斛雌配子發(fā)育的特點(diǎn)與樹(shù)蘭(Epidendrumibaguense)[5]、卡特蘭(Cattleya)[7]、無(wú)距蝦脊蘭(Calanthetsoongiana)[7]和舌唇蘭(Platantherasusannaeil)[8]相同，在授粉前胚珠并沒(méi)有開(kāi)始發(fā)育，只有在授粉后才開(kāi)始發(fā)育；杓蘭類(Cypripedium)[9.10]、玉鳳蘭(Habenriagrandifloriformis)[8]、火燒蘭屬(Epipactis)[11]授粉前胚珠已經(jīng)開(kāi)始發(fā)育，只是不能分裂形成大孢子細(xì)胞，授粉后大孢子才能進(jìn)一步發(fā)育。在植物進(jìn)化史上，蘭科植物被認(rèn)為是進(jìn)化程度最高的，這可能是在長(zhǎng)期的自然選擇中進(jìn)化出最節(jié)省能量的方式—只有授粉后胚珠才能真正開(kāi)始發(fā)育。

對(duì)不同植物而言，從花粉落到母本柱頭到受精的時(shí)間差別很大，短則幾分鐘，長(zhǎng)則幾天數(shù)月，蘭科植物相對(duì)于其他植物從授粉到受精間隔時(shí)間較長(zhǎng)，本研究發(fā)現(xiàn)，金釵石斛授粉后70 d完成受精。金釵石斛授粉前胎座未發(fā)育，授粉后胎座上有隆起發(fā)生，子房有少許膨大。說(shuō)明授粉后產(chǎn)生了某種刺激而促使胎座發(fā)育，這種刺激有可能是人工授粉導(dǎo)致的，也有可能是花粉管生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)子房的刺激從而產(chǎn)生了某些激素或某些物質(zhì)，這些激素能夠調(diào)節(jié)其他營(yíng)養(yǎng)器官的養(yǎng)分運(yùn)輸?shù)阶臃浚瑥亩龠M(jìn)胚珠的發(fā)育。蝴蝶蘭授粉后刺激體內(nèi)產(chǎn)生了乙烯從而促進(jìn)了胎座的發(fā)育[12]，金釵石斛的胎座發(fā)育是由上述哪種情況引起，刺激體內(nèi)產(chǎn)生了何種物質(zhì)還有待研究。

從本研究結(jié)果可見(jiàn)，金釵石斛雌配子和胚的發(fā)育有以下特點(diǎn)：子房為側(cè)膜三心皮胎座，倒生型胚珠，蓼型胚囊，授粉后70 d，受精完成，受精卵分裂形成原胚，胚的發(fā)育為石竹型。授粉后150 d，種胚發(fā)育為圓球形胚，授粉后180 d，種子成熟。金釵石斛種子內(nèi)外種皮分別由胚珠時(shí)期的內(nèi)外珠被發(fā)育形成，由于珠被細(xì)胞的脫水皺縮，在內(nèi)珠被和外珠被之間形成空氣腔。

蘭科植物種類繁多，不同種類之間內(nèi)珠被的發(fā)育存在較大差異。五唇蘭(Doritispulcherrima)[13]、古德兜蘭(Paphiopedilumgodefroyae)[14]、墨蘭(Cymbidiumsinense)[15]等在胚發(fā)育過(guò)程中內(nèi)珠被退化消失，成熟時(shí)僅有外珠被發(fā)育而成的單層外種皮；在大花杓蘭(Cypripediummacranthos)[16]、臺(tái)灣杓蘭(C.formosanum)[17]、扇脈杓蘭(C.japonicum)[18]、無(wú)距蝦脊蘭[7]的研究中發(fā)現(xiàn)成熟種子具有內(nèi)外雙層(珠被)種皮，內(nèi)珠被在種子發(fā)育成熟時(shí)形成一層致密的干膜質(zhì)結(jié)構(gòu)緊貼于胚，并認(rèn)為這是導(dǎo)致成熟種子萌發(fā)困難的原因，這是種子對(duì)惡劣自然環(huán)境的一種保護(hù)性適應(yīng)，可以避免種子過(guò)早萌發(fā)而受到嚴(yán)酷外界條件的傷害而死亡，但在無(wú)菌播種時(shí)會(huì)成為一種障礙。在本研究中發(fā)現(xiàn)，成熟的金釵石斛種子也有一層由內(nèi)珠被發(fā)育而成的致密干膜質(zhì)結(jié)構(gòu)，但金釵石斛成熟種子不存在萌發(fā)困難的現(xiàn)象，而且種子成熟度越高，萌發(fā)率也越高[19]，所以內(nèi)珠被的存在，不應(yīng)該成為判斷成熟種子是否容易萌發(fā)的依據(jù)。