李瀟南，柳迦鵬，胡 蝶，石玉佩，高 雅，周雙海

(北京農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCV)是一種很小的DNA病毒，豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)則是新近發(fā)現(xiàn)的又一種PCV，能夠引起豬皮炎與腎病綜合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)，并可能引起母豬繁殖障礙[1-2]，對養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展造成了一定經(jīng)濟(jì)損失。目前PCV3在多個(gè)國家均有報(bào)道流行[3-4]，中國也在廣東、廣西、河北、北京等地發(fā)現(xiàn)PCV3的存在[5-7]，表明PCV3已在全球比較廣泛存在，是一種需要注意防控的新發(fā)傳染病病原。

PCV3全基因組大小為2 000 nt，其基因組構(gòu)成與豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)相似，都被推測存在11個(gè)開放閱讀框(open reading frame，ORF)，都是由ORF2編碼病毒衣殼蛋白(Cap)[1, 8]，這是病毒唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，但2種PCV的Cap氨基酸同源性不足50%。目前，檢測PCV3主要是通過PCR方法，尚缺乏商品化的免疫學(xué)檢測試劑。因此，本研究旨在利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)與鑒定PCV3-Cap融合蛋白，為PCV3的免疫學(xué)檢測方法建立打下前期基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和主要試劑

PCV3全基因組質(zhì)粒pUC-PCV3、小鼠抗PCV3-Cap血清與原核表達(dá)載體pET-32a由北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物疫病研究室制備或保存；Premix TaqTM為TaKaRa公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Rosetta(DE3)和His標(biāo)簽包涵體蛋白純化試劑盒為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ和T4連接酶為Thermo公司產(chǎn)品。

1.2 PCV3-Cap基因片段擴(kuò)增

用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)1對引物，上游引物為5′-CCGGAATTCAACGTCATATCCGTTGGA-3′，下游引物為5′-ATTGCGGCCGCTTAGAGAACGGACTTGTA-5′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為507 bp。以pUC-PCV3質(zhì)粒為DNA模板，上、下游引物各25 pmol來建立50 μL的PCR體系。PCR程序?yàn)?4 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 cycles；72 ℃ 9 min。用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產(chǎn)物并回收預(yù)期片段。

1.3 原核表達(dá)重組菌的構(gòu)建

對回收純化后的PCR產(chǎn)物和pET-32a分別用EcoRⅠ 和NotⅠ 進(jìn)行酶切，回收二者產(chǎn)物，用T4連接酶進(jìn)行定向連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Rosetta(DE3)進(jìn)行增殖培養(yǎng)，菌液PCR鑒定后進(jìn)行測序鑒定，以篩選出陽性原核表達(dá)重組菌。

1.4 表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析

取100 μL陽性原核表達(dá)重組菌接種到5 mL的LB培養(yǎng)基(含有10 g/L氨芐青霉素)，37 ℃下 160 r/min培養(yǎng)12 h。取3 mL菌液轉(zhuǎn)移到300 mL的LB培養(yǎng)基(含有10 g/L氨芐青霉素)中，37 ℃下160 r/min培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600值為0.6～0.8時(shí)，加入終濃度0～0.8 mol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h。收集菌體，取一部分進(jìn)行SDS-PAGE分析；另取一部分進(jìn)行超聲波裂解后，分別收集上清與沉淀，再次進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.5 Western blot檢測

純化后的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5% BSA在室溫下封閉1 h，取出膜用TBST洗液洗滌3次，每次5 min。用1∶200倍稀釋的小鼠抗PCV3-Cap血清作一抗，4 ℃孵育過夜，用TBST洗液洗滌3次，每次5 min。用1∶2 000倍稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG作二抗，室溫下孵育1 h，用TBST洗液洗滌3次，每次5 min。洗滌后用HRP-DAB顯色液浸泡約1 min，出現(xiàn)棕色條帶后用蒸餾水洗滌以終止顯色。另設(shè)置pET-32a誘導(dǎo)蛋白作為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)質(zhì)粒pET-PCV3-Cap的鑒定

以pUC-PCV3全基因組質(zhì)粒為模版進(jìn)行PCV3-Cap基因片段的PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳后顯示有1條略大于500 bp的片段(見圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符。回收純化PCR產(chǎn)物后進(jìn)行重組質(zhì)粒pET-PCV3-Cap的克隆與測序鑒定。對序列測定結(jié)果的BLAST比對顯示，克隆的基因片段序列與相應(yīng)的PCV3-Cap基因片段序列完全一致，表明含有PCV3-Cap基因片段的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-PCV3-Cap構(gòu)建成功。

2.2 目的蛋白的原核表達(dá)與可溶性分析

截短的PCV3-Cap蛋白編碼168個(gè)氨基酸，融合蛋白的分子量約為37.5 kDa。陽性重組菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后的結(jié)果(圖2)顯示，表達(dá)的融合蛋白略大于35 kDa，符合目的蛋白的預(yù)期大小，其中以0.5 mol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后表達(dá)量最多。對目的蛋白的可溶性分析結(jié)果(圖2)顯示，重組蛋白在包涵體與上清中都存在，但以包涵體形式為主。

2.3 目的蛋白的純化分析

對純化前與純化后的包涵體蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果(圖3)顯示，純化后無可見的雜蛋白，表明純化后融合蛋白的純度高。

2.4 目的蛋白的Western blot分析

Western blot檢測結(jié)果(圖4)顯示，pET-PCV3-Cap蛋白有明顯可見的特異性條帶，而pET-32a蛋白未見特異性條帶，顯示pET-PCV3-Cap能夠與小鼠抗PCV3-Cap血清出現(xiàn)免疫學(xué)反應(yīng)，表明目的蛋白能夠與其特異性抗體產(chǎn)生免疫學(xué)反應(yīng)，表現(xiàn)出良好的免疫反應(yīng)性。

3 討論

PCV3是2016年報(bào)道發(fā)現(xiàn)的又一種致病性豬圓環(huán)病毒，其單獨(dú)感染能夠人工復(fù)制出PDNS，且還可能引起母豬繁殖障礙等疾病[1, 9]。PCV3已在美洲、歐洲、亞洲包括中國等地逐漸散播流行[3-7]。目前對PCV3感染的檢測主要是采用PCR技術(shù)檢測病毒核酸，但用免疫學(xué)方法檢測病毒抗體也是重要方法之一，病毒抗原則是建立PCV3免疫學(xué)檢測方法的重要材料基礎(chǔ)。因此，本研究進(jìn)行了PCV3衣殼蛋白的原核表達(dá)及鑒定。

已有關(guān)于PCV2衣殼蛋白的原核表達(dá)，多采取截短表達(dá)的策略[10]，這是由于PCV2衣殼蛋白基因的N端含有大量稀有密碼子而影響目標(biāo)蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)所致。由于PCV3與PCV2在基因組組成與結(jié)構(gòu)方面非常相似，一些研究者在進(jìn)行PCV3衣殼蛋白的原核表達(dá)時(shí)也是采取了截短后表達(dá)的策略。Palinski等[1]去除PCV3 衣殼蛋白基因N端105個(gè)堿基來進(jìn)行原核表達(dá)，并基于表達(dá)獲得的截短蛋白建立了檢測PCV3抗體的間接ELISA方法。連凱琪等[11]去除PCV3衣殼蛋白基因N端135個(gè)堿基，通過原核表達(dá)獲得了截短的衣殼蛋白。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)PCV3衣殼蛋白基因的N端同樣存在許多稀有密碼子，并且是高度堿性，非常不利于目標(biāo)蛋白的原核表達(dá)，故去除其N端包含核定位序列在內(nèi)的138個(gè)堿基而截短至507 nt，該段基因可編碼169 aa，相對分子量大小約為37.5 kDa?？梢钥闯?，不同研究者的表達(dá)策略大體相似，不同之處主要有兩個(gè)方面：一是截掉的堿基數(shù)量不一樣，Palinski等[1]和連凱琪等[11]分別截掉了105 nt和135 nt，而截掉了138 nt，截掉的是最多的，但只比連凱琪等[11]多截掉了3個(gè)堿基，這個(gè)影響可以忽略不計(jì)；另一個(gè)是采用的原核表達(dá)載體不同，Palinski等[1]和連凱琪等[11]使用的是pET-28a或pET-30a，而我們使用的是pET-32a。一般而言，載體分子量越大，則表達(dá)量越高。事實(shí)證明，本試驗(yàn)表達(dá)獲得的蛋白含量是比較高的，這很可能與選擇使用了分子量更大的表達(dá)載體pET-32a有關(guān)。

原核表達(dá)結(jié)果顯示，比較高效地表達(dá)出了截短的PCV3衣殼蛋白，該蛋白主要以包涵體形式存在，但也有少量的可溶性蛋白。隨后的Western blot結(jié)果顯示該截短的衣殼蛋白能與小鼠抗PCV3-Cap血清進(jìn)行特異性結(jié)合，說明表達(dá)獲得的目標(biāo)蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性，能夠作為PCV3抗體檢測方法如ELISA中的抗原材料，為下一步進(jìn)行PCV3抗體的制備及其免疫學(xué)檢測方法建立提供了材料基礎(chǔ)。