劉 丹，王 朕，王 婉，劉 杰，曹 碩，李秋明*，沈 紅*

(1.北京農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206; 2.北京市朝陽(yáng)區(qū)王四營(yíng)地區(qū)社會(huì)保障事務(wù)所， 北京 100023；3.北京大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)療器械檢驗(yàn)中心，北京100081)

雞球蟲(chóng)病是集約化養(yǎng)殖中常見(jiàn)的且危害性極大疾病之一，防治雞球蟲(chóng)病成為集約化養(yǎng)殖業(yè)中的棘手問(wèn)題[1]。球蟲(chóng)感染后寄生于雞消化道，不僅會(huì)降低日增重、料重比，嚴(yán)重影響生長(zhǎng)性能，而且極易產(chǎn)生免疫應(yīng)激，引起免疫器官功能障礙及免疫功能降低等[2]。目前，通常使用抗球蟲(chóng)藥及疫苗來(lái)防治雞球蟲(chóng)病，但疫苗預(yù)防存在安全性問(wèn)題，抗球蟲(chóng)藥又有耐藥性且藥物殘留給食品安全帶來(lái)影響。研究發(fā)現(xiàn)在飼料中添加中藥對(duì)雞球蟲(chóng)病防治起到良好療效，如在日糧中添加檳榔提取物減少雞糞便卵囊排出數(shù)，緩解感染球蟲(chóng)后雞盲腸結(jié)構(gòu)損傷，提高機(jī)體免疫力[3]。還有研究報(bào)道將鴉膽子醇提物添加到雞日糧中有效的控制雞血便的產(chǎn)生，降低病雞盲腸的病變程度及卵囊排出量，且感染雞的體質(zhì)量增重未受影響[4]。研究認(rèn)為中藥中一些有效成分能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能緩解球蟲(chóng)對(duì)雞的損傷，從而起到治療雞球蟲(chóng)病的效果[5]。大量研究表明，一些生物活性肽具有調(diào)節(jié)免疫的功能，如鹿茸蛋白肽可促進(jìn) RAW264.7細(xì)胞增殖，抗菌肽Api-PR19添加在飼糧中能改善雞腸道絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)和sIgA分泌，保護(hù)盲腸免受病原微生物侵害[6,7]。古醫(yī)籍記載地鱉有破血散瘀，消腫，接骨續(xù)筋，修復(fù)骨，止血等功效，現(xiàn)代藥理研究表明地鱉有效成分具有抗腫瘤、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、抗氧化抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等作用[8]。中藥大辭典中記載蠐螬可治療白血病、腫瘤、喉癌等疾病，還可破血逐疲、明目退翳。研究表明，蠐螬具有顯著的調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老和抗病毒及抗菌的功效[9]。

試驗(yàn)研究利用地鱉肽和蠐螬肽的免疫調(diào)節(jié)作用，在仔雞飼料中添加地鱉肽和蠐螬肽提取物，探討多肽提取物對(duì)肉仔雞感染柔嫩艾美耳球蟲(chóng)后的生長(zhǎng)性能、抗球蟲(chóng)效果和調(diào)節(jié)免疫功能的影響，目的為進(jìn)一步探究中藥提取物代替獸藥在緩解家禽疾病中的應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)HyClone公司，胎牛血清(FBS)購(gòu)于法國(guó)Biowest公司，噻唑藍(lán)(MTT)、伴刀豆球蛋白(ConA)、脂多糖(LPS)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，酶標(biāo)板購(gòu)自美國(guó) Corning公司，細(xì)胞培養(yǎng)板、載玻片購(gòu)于美國(guó)Costar公司，多聚甲醛、蘇木素、伊紅購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，二甲苯購(gòu)于北京博爾優(yōu)生物技術(shù)有限公司；鹽霉素(98%)購(gòu)自廈門(mén)華生堂藥業(yè)有限公司，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)由北京農(nóng)學(xué)院寄生蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)，地鱉多肽和蠐螬多肽凍干粉由北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)于日本SANYO公司，潔凈工作臺(tái)購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)，低溫離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司；XSZ-D2 倒置生物顯微鏡購(gòu)于北京索來(lái)寶科技有限公司，Infinite 200 Pro型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購(gòu)于瑞士TECAN公司，脫水機(jī)包埋機(jī)RM2135 型石蠟切片機(jī)德國(guó)LEICA 公司。1日齡仔雞購(gòu)自北京富佳種禽中心。

1.2 方 法

1.2.1 仔雞分組及處理 選取健康1日齡仔雞180只，隨機(jī)分為6組，每組10只，各組設(shè)3個(gè)重復(fù)。陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組(即球蟲(chóng)感染組)仔雞飼喂基礎(chǔ)飼糧，鹽霉素組在基礎(chǔ)日糧中添加鹽霉素(60 mg/kg)，地鱉肽、蠐螬肽和聯(lián)合肽組在基礎(chǔ)飼糧中分別添加地鱉肽(100 mg/kg)、蠐螬肽(100 mg/kg)、地鱉肽和蠐螬肽聯(lián)合(1∶1)。除陰性對(duì)照組外，所有14日齡仔雞感染球蟲(chóng)，每只雞攻毒5×103個(gè)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊，陰性對(duì)照組雞給等量體積生理鹽水。雞以籠養(yǎng)方式及玉米-豆粕型粉狀飼糧飼喂，基礎(chǔ)飼糧配方參照NRC(1994)和雞的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 33—2004)配制，試驗(yàn)期為21 d。

1.2.2 仔雞生長(zhǎng)性能的測(cè)定 仔雞試驗(yàn)前稱(chēng)仔雞初始體質(zhì)量，每天稱(chēng)空腹仔雞體質(zhì)量，分別計(jì)算仔雞平均日增質(zhì)量(ADG)、平均日采食量(Average daily feed intake)及料質(zhì)量比(F/G)。

1.2.3 仔雞抗球蟲(chóng)效果的測(cè)定 肉雞盲腸病變：取21 d仔雞盲腸，肉眼觀察盲腸病變，依據(jù)盲腸病變計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)[10]，記錄病變值。病變值=各組平均病變計(jì)分×10。

卵囊排出數(shù)：收集仔雞感染球蟲(chóng)后第4～7 天全糞，統(tǒng)計(jì)每克糞便卵囊數(shù)(OPG)。

抗球蟲(chóng)指數(shù)：按照文獻(xiàn)[11]計(jì)算藥物抗球蟲(chóng)指數(shù)(ACI)。

1.2.4 仔雞空腸腸道形態(tài)及腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)的測(cè)定 取21 d仔雞空腸中段，參照文獻(xiàn)[12]制作石蠟切片，測(cè)小腸絨毛高度(V)、隱窩深度(C)及二者比值(V/C)，計(jì)數(shù)每100個(gè)黏膜上皮淋巴細(xì)胞數(shù)(IEL)。

1.2.5 仔雞免疫器官指數(shù)的測(cè)定 取21 d仔雞稱(chēng)質(zhì)量，采血后處死剖腹剪取法氏囊、胸腺、脾臟稱(chēng)質(zhì)量，按公式計(jì)算：臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/活雞體質(zhì)量。

1.2.6 仔雞外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的測(cè)定 取21 d仔雞靜脈無(wú)菌采血，參照文獻(xiàn)[13]分離和制備外周血淋巴細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后取100 μL淋巴細(xì)胞懸液和100 μL RPMI1640完全培養(yǎng)基置于96孔細(xì)胞板內(nèi)培養(yǎng)，T 淋巴細(xì)胞組每孔加Con A，B 淋巴細(xì)胞組每孔加LPS，將培養(yǎng)板放置 37 ℃ 5% 二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，采用MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。

2 結(jié) 果

2.1 多肽提取物對(duì)仔雞生長(zhǎng)性能及臟器指數(shù)的影響

試驗(yàn)仔雞飼養(yǎng)至21日齡其生長(zhǎng)性能情況見(jiàn)表1，鹽霉素、地鱉肽、蠐螬肽組仔雞料重比、平均日增重和日采食量與陽(yáng)性對(duì)照組相比差異均不顯著。仔雞免疫器官指數(shù)分析，結(jié)果與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組均極顯著降低了21日齡肉仔雞臟器指數(shù)(脾臟、法氏囊及胸腺)(P<0.01)；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，鹽霉素組均極顯著升高了21日齡肉仔雞臟器指數(shù)(脾臟、法氏囊及胸腺)(P<0.01)；21日齡肉仔雞地鱉肽、蠐螬肽和聯(lián)合肽組均極顯著升高了肉仔雞臟器指數(shù)(脾臟、胸腺及法氏囊)(P<0.01)(圖1)。

表1 多肽提取物對(duì)仔雞生長(zhǎng)性能、盲腸損傷和卵囊排出數(shù)的影響Tab.1 Effects of polypeptide extracts on the growth performance, intestinal damage and the numbers of oocyst excretion from broilers

2.2 多肽提取物對(duì)仔雞抗球蟲(chóng)效果的影響

由表1知陽(yáng)性對(duì)照組腸道損傷評(píng)分為3.17，鹽霉素、地鱉肽、蠐螬肽和聯(lián)合肽組分別為1.33、2.17、1.83、1.83，結(jié)果表明多肽提取物顯著降低感染球蟲(chóng)的仔雞的腸道損傷。陽(yáng)性對(duì)照組卵囊排出數(shù)達(dá)到11.95×104，而鹽霉素、地鱉肽、蠐螬和聯(lián)合肽組均低于5.76×104，結(jié)果說(shuō)明多肽提取物顯著降低卵囊排出數(shù)及呈現(xiàn)一定的抗球蟲(chóng)效果。陽(yáng)性對(duì)照組抗球蟲(chóng)指數(shù)(ACI)為126.44，鹽霉素組為179，地鱉肽、蠐螬肽和聯(lián)合肽組分別為157.81、159.58和159.79，結(jié)果顯示多肽提取物抗球蟲(chóng)效果為中效。

2.3 多肽提取物對(duì)仔雞腸道結(jié)構(gòu)及腸黏膜形態(tài)的影響

仔雞腸道結(jié)構(gòu)變化見(jiàn)圖2，與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組腸絨毛明顯變寬變短且隱窩深度變高；鹽霉素組和多肽組與陽(yáng)性對(duì)照組相比，絨毛寬度有所改善，絨毛高度基本恢復(fù)正常且絨毛深度變低。通過(guò)顯微鏡觀察及計(jì)算機(jī)分析仔雞空腸絨毛高度和隱窩深度，結(jié)果陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比仔雞空腸絨毛高度極顯著降低，隱窩深度極明顯升高，絨毛高度/隱窩深度值極顯著降低；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，鹽霉素、地鱉肽、蠐螬肽、聯(lián)合肽組仔雞空腸絨毛高度均極顯著提高，隱窩深度極顯著降低，V/C比值明顯提高(表2)。

2.4 多肽提取物對(duì)仔雞空腸淋巴細(xì)胞數(shù)及外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

球蟲(chóng)感染仔雞的空腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量(IEL)如表2所示，陰性對(duì)照組雞腸道上皮淋巴細(xì)胞數(shù)量為11.45，陽(yáng)性對(duì)照組IEL數(shù)量為13.26，地鱉肽、蠐螬肽和聯(lián)合肽組雞球感染蟲(chóng)后IEL數(shù)分別達(dá)到22.74、21.79和24.39，比陽(yáng)性對(duì)照組分別提高71%、64%和83%，且聯(lián)合肽組IEL數(shù)量增加最多。與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組仔雞外周血B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率差異不顯著但有降低趨勢(shì)，T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著降低；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，鹽霉素組仔雞外周血B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率差異不顯著，但地鱉肽、蠐螬肽和聯(lián)合肽組T和B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均極顯著升高(表2)。

表2 多肽提取物對(duì)球蟲(chóng)感染仔雞空腸腸黏膜形態(tài)、空腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞及外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響Tab.2 Effect of polypeptide extracts on jejunal intestinal morphology, jejunal intraepithelial lymphocytes and theperipheral blood lymphocyte transformation of the broiler infected with chicken coccidia

3 討 論

雞球蟲(chóng)病是集約化雞養(yǎng)殖業(yè)中十分嚴(yán)重的寄生蟲(chóng)病，感染雞球蟲(chóng)病后雞的生長(zhǎng)性能、免疫功能及腸道屏障均會(huì)發(fā)生異常，但很多研究發(fā)現(xiàn)在日糧中添加生物活性肽可以提高雞體各項(xiàng)機(jī)能。有研究報(bào)道[14]在日糧中添加蚯蚓肽可以提高雞的日增重，料重比降低，這是雞生長(zhǎng)性能的重要指標(biāo)。試驗(yàn)研究在日糧中添加多肽提取物仔雞的日增重、料重比影響不明顯，究其原因可能飼養(yǎng)過(guò)程中未能保證每只仔雞能吃到足夠日糧，造成個(gè)別雞采食量少，日增重緩慢，料重比受到影響。免疫器官指數(shù)和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率可以反映免疫功能，免疫器官的指數(shù)和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率越高，機(jī)體免疫機(jī)能會(huì)越好[15]。研究報(bào)道，日糧中添加天蠶素抗菌肽可以明顯提高817肉雜雞的免疫器官指數(shù)，顯著升高T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率[16]。試驗(yàn)本研究結(jié)果日糧中添加多肽提取物肉仔雞外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、免疫器官臟器指數(shù)明顯提高，這與前人報(bào)道一致，結(jié)果提示多肽物可提高球蟲(chóng)感染仔雞的免疫調(diào)節(jié)作用。

柔嫩艾美耳球蟲(chóng)病防治過(guò)程中，盲腸的損傷情況以及糞便中卵囊排出數(shù)量是檢驗(yàn)防治效果的重要指標(biāo)，卵囊排出數(shù)量和腸道損傷評(píng)分越低，表示藥物抗球蟲(chóng)效果越佳，從而判斷出藥物的抗球蟲(chóng)指數(shù)越高[5]。試驗(yàn)研究中聯(lián)合肽組仔雞排出卵囊數(shù)和腸道損傷明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組(球蟲(chóng)感染組)，而ACI高于球蟲(chóng)感染組但低于抗球蟲(chóng)藥鹽霉素組，結(jié)果表明多肽提取物有一定抗球蟲(chóng)作用。雞的腸道具有消化和吸收營(yíng)養(yǎng)成分及抵抗外界病原體侵害的作用，當(dāng)腸道絨毛高度變低或隱窩變深時(shí)，表示腸道黏膜形態(tài)出現(xiàn)損害情況，當(dāng)絨毛高度與隱窩深度之比降低時(shí)，表示腸道黏膜已受到損傷且消化吸收能力出現(xiàn)異常，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成動(dòng)物的免疫功能下降，反之則表明腸道免疫及吸收功能完好[17]。試驗(yàn)結(jié)果在日糧中添加多肽提取物后球蟲(chóng)感染仔雞腸道絨毛高度增加，隱窩深度降低，絨毛高度/隱窩深度值升高，提示多肽提取物可改善球蟲(chóng)感染的雞腸道形態(tài)和腸道吸收能力。

綜上所述，日糧中添加多肽提取物(地鱉肽和蠐螬肽)具有一定的抗球蟲(chóng)效果，可能通過(guò)提高機(jī)體調(diào)節(jié)免疫功能降低雞球蟲(chóng)感染造成的應(yīng)激反應(yīng)，改善腸道形態(tài)而降低腸道損傷。