武 揚(yáng)，姜尚昆，韓春暉，王婷甄，范雙喜，郝敬虹

(農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206)

葉用萵苣成為各地生熟兼用、市場熱銷的重要葉類蔬菜。葉用萵苣喜冷涼濕潤的氣候條件，在15～20 ℃時(shí)生長最佳，超過30 ℃時(shí)則易生長不良，發(fā)生抽薹，影響食用品質(zhì)，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致減產(chǎn)絕收。這一問題在生菜的周年生產(chǎn)中亟需解決。[1，2]。

植物生長素是活性植物細(xì)胞自身分泌的一類激素，主要調(diào)控植物的生長方向，細(xì)胞的生長和分裂、組織的分化、植物器官的形成、莖的向性運(yùn)動(dòng)、葉的衰老脫落等，在某些植物種類中，生長素還參與誘導(dǎo)開花等[3]。而生長素參與調(diào)控的大多數(shù)發(fā)育過程則都是通過基因的表達(dá)來調(diào)控的[4]。在課題組前期的研究推論生長素在葉用萵苣的抽薹過程中起著重要的作用。

大多數(shù)植物中，生長素響應(yīng)基因受TIR1，生長素響應(yīng)因子(ARF)家族，以及AUX/IAA轉(zhuǎn)錄因子家族的調(diào)控[5]。近年來，研究表明植物生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是通過調(diào)控ARFs來實(shí)現(xiàn)的[6]。典型的ARF在其氨基末端具有B3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)，中間區(qū)(MR)以及羧基末端的二聚化作用結(jié)構(gòu)域(CTD)[7]。CTD結(jié)構(gòu)域具有III和IV結(jié)構(gòu)域，與Aux/IAA蛋白類似，能夠在ARFs和Aux/IAAs之間形成同型二聚體和異型二聚體[8]。ARF家族成員眾多，不同ARF蛋白之間在功能上存在明顯差異。Sessions等發(fā)現(xiàn)AtARF3在擬南芥花器官的形成中起重要作用[9]。另一項(xiàng)研究則表明AtARF5參與胚胎模式的形成和維管組織的發(fā)育[10]。遺傳試驗(yàn)表明，AtARF8是擬南芥果實(shí)發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子，抑制其表達(dá)可誘導(dǎo)擬南芥單性結(jié)實(shí)[11]。SlARF4參與了番茄果實(shí)發(fā)育過程中糖代謝的調(diào)控[12]，SlARF7調(diào)控番茄果實(shí)結(jié)實(shí)和發(fā)育過程中植物生長素信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)并介導(dǎo)植物生長素和赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]。在水稻胚胎組織中，OsARF1表達(dá)量顯著高于其在營養(yǎng)組織中的表達(dá)量，沉默OsARF1會(huì)使植株出現(xiàn)長勢變?nèi)?，葉片變小卷曲，不育等顯現(xiàn)[14]。擬南芥中，AtARF1和AtARF2均控制擬南芥葉片衰老和花器官脫落，且AtARF1是一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子[15]。

課題組在之前對高溫抽薹組和對照組的差異蛋白分析中，生長素響應(yīng)因子ARF1蛋白存在顯著差異，推測其與抽薹有關(guān)。但ARF1基因在生菜中的作用機(jī)理及其與生菜抽薹的關(guān)系仍不清楚。因此進(jìn)行了LsARF1基因的生物信息學(xué)分析，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real-time quantitative PCR,qRT-PCR)技術(shù)分析不同溫度和時(shí)間點(diǎn)下的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究其在葉用萵苣抽薹中的相關(guān)作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以葉用萵苣(LactucasativaL.)易抽薹半結(jié)球型品種GB-30為試材(在農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了編號和保存)實(shí)驗(yàn)于2019年9月在北京農(nóng)學(xué)院日光溫室中進(jìn)行。選取顆粒飽滿、大小均一的種子，常規(guī)方法催芽。將發(fā)芽情況較為整齊的種子播種于裝有基質(zhì)的穴盤中，于北京農(nóng)學(xué)院日光溫室中培養(yǎng)(光照條件為光照14 h，黑暗10 h；溫度為白天(20±2) ℃，夜間(13±2) ℃，相對濕度為65%～75%)。待幼苗生長至3葉1心時(shí)移栽至10cm口徑營養(yǎng)缽中。待幼苗長到6葉1心時(shí)，選取生長一致的植株移入人工氣候箱。在溫度為(20±2) ℃/(13±2) ℃(晝/夜)、光周期14 h/10 h(晝/夜)、相對濕度60%、光照強(qiáng)度300 μmol/(m2·s)的條件下適應(yīng)2 d。之后，將幼苗分成2組：第1組幼苗一直生長在上述環(huán)境中，作為對照；第2組幼苗進(jìn)行(33±2) ℃/(25±2) ℃高溫脅迫處理。在處理的0、8、16、24 d時(shí)取樣(前期研究結(jié)果表明高溫處理8 d開始抽薹)，取樣部位為花莖，每5株作為1次重復(fù)，每個(gè)樣品取樣進(jìn)行3次重復(fù)。在液氮中速凍后，于-80 ℃冰箱中保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葉用萵苣總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 采用艾德萊總RNA提取試劑盒，提取葉用萵苣的總RNA。cDNA第一鏈的合成按照全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的方法進(jìn)行。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 對蛋白質(zhì)參數(shù)進(jìn)行在線分析：ProtParam(http://web.expasy.org/protparam)。進(jìn)行信號肽分析：SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/signal p/)。NPS@(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpagenpsa_sopma.html)的自優(yōu)化比對預(yù)測方法(SOPMA)預(yù)測氨基酸的二級結(jié)構(gòu)。NCBI CD-search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi公司)用于分析蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)。NCBI ProteinBLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)用于在線搜索LsARF1氨基酸序列的同源序列。MEME軟件用于分析保守基序。ProtComp(http://linux1.softberry.com/berry.phtml)和PSORT(https://psort.hgc.jp/)用于預(yù)測蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)用于預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。MEGA7中的鄰域連接方法用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 葉用萵苣ARF1基因表達(dá)分析 利用已知的擬南芥ARF1基因序列，在NCBI中的葉用萵苣全基因組庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_002870075.1)中進(jìn)行比對，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性qPCR引物ARF1-F：CGCGTTGGAGTAAGGAGGCTTATG和ARF1-R：TGCATGAGAGGCAGTAGCAAGAAC。以葉用萵苣18S rRNA基因(HM047292.1)作為內(nèi)參基因。使用20 μL體系與Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀上檢測LsARF1基因的表達(dá)量。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，循環(huán)數(shù)39，進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。

熒光定量PCR所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS12.5(International Business Machine，Chicago，IL)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Origin9(Origin Lab，Northampton，MA,USA)繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉用萵苣LsARF1基因序列分析

LsARF1基因編碼區(qū)的核苷酸序列長1 968 bp，共編碼656個(gè)氨基酸，LsARF1基因核苷酸序列及推測的氨基酸序列如圖1所示。

利用ProtParam軟件分析LsARF1基因編碼的氨基酸序列，得出LsARF1蛋白的分子量為74 kDa，理論等電點(diǎn)為5.79。它的Ser，Leu和Glu水平較高，分別為10.2%，8.4%和8.2%，Cys，Trp和Tyr水平較低，分別為1.8%，1.8%和2.0%，總計(jì)84個(gè)帶負(fù)電荷的殘基(Asp+Glu)，總共66個(gè)帶正電荷的殘基(Arg+Lys)，不穩(wěn)定性指數(shù)為55.4(不穩(wěn)定的蛋白質(zhì))，平均親水性值為-0.53，預(yù)測為親水性蛋白質(zhì)。SignalP4.0分析表明，該蛋白質(zhì)不含信號肽或跨膜結(jié)構(gòu)域，也不是分泌蛋白。

通過NPS@的SOPMA預(yù)測LsARF1蛋白的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白中α-螺旋占19.85%，387個(gè)氨基酸殘基組成無規(guī)則卷曲，含量高達(dá)59.08%，延伸鏈占16.18%，最少的是β-折疊，僅占4.89%。

2.2 葉用萵苣LsARF1保守結(jié)構(gòu)域與多重序列比對分析

利用NCBI CD-esarch分析該蛋白的保守結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，即B3，Auxin_resp，AUX_IAA結(jié)構(gòu)域(圖2)。 B3結(jié)構(gòu)域是ARF蛋白與DNA結(jié)合的區(qū)域；而Auxin_resp是ARF家族的保守結(jié)構(gòu)域； AUX_IAA是ARF蛋白的二聚化結(jié)合位點(diǎn)。大多數(shù)ARF蛋白具有這三個(gè)結(jié)構(gòu)域。根據(jù)氨基酸序列分析的結(jié)果，可以得出結(jié)論，LsARF1蛋白可能具有與ARF蛋白家族的功能。

利用DNAMAN7.0對葉用萵苣、向日葵和黃花蒿的ARF1氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)LsARF1蛋白與其他物種具有高度相似性。 N-末端保守性較高，C-保守性較差，并且有更多的可變序列。(圖3)

2.3 LsARF8蛋白的生物信息學(xué)分析

進(jìn)一步使用SWISS-MODEL軟件對LsARF1進(jìn)行同源建模，推測ARF1蛋白的三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)它包含ARF家族特有的保守結(jié)構(gòu)(圖4)。此結(jié)果與NCBI CD-search分析一致。

2.4 葉用萵苣LsARF1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將獲得的LsARF1氨基酸序列與NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫中的ARF1序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)它與向日葵、大豆和芝麻等10種植物的ARF1蛋白具有較高同源性。利用MEGA 7.0軟件工具構(gòu)建高度同源蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。這11個(gè)氨基酸序列清楚地分為二類，第一類是獼猴桃和芝麻，萵苣和刺苞菜薊為第二類。萵苣和刺苞菜薊均為菊科的農(nóng)作物，同源程度較高(圖5)。

2.5 葉用萵苣LsARF1基因在高溫抽薹中的表達(dá)分析

通過qRT-PCR，檢測了葉用萵苣易抽薹品種GB-30莖部試材在高溫-常溫處理下LsARF1基因的相對表達(dá)量(圖6)。結(jié)果顯示，在處理后的8 d，高溫組和對照組中基因的相對表達(dá)量開始出現(xiàn)分歧，其間，對照組基因的相對表達(dá)量均高于高溫組的；高溫組基因的相對表達(dá)量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，對照組基因的相對表達(dá)量則一直呈現(xiàn)上升趨勢。

綜上分析，高溫使葉用萵苣莖中LsARF1基因的相對表達(dá)量發(fā)生顯著變化。

3 討 論

近年來，隨著多個(gè)物種全基因組研究的發(fā)展，先后在擬南芥、番茄、黃瓜等植物中鑒定出ARF基因家族成員。這些進(jìn)展為研究ARFs在植物生長發(fā)育過程中的作用機(jī)制以及這些因子參與信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)、逆境脅迫應(yīng)答等提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。Ellis等表明擬南芥ARF1在花的發(fā)育時(shí)高表達(dá),而在其他部位含量較低,甚至不表達(dá)，表達(dá)量受外源光調(diào)節(jié)，arf1arf2突變體花藥開裂延遲[16]。Hirotaka等研究發(fā)現(xiàn)，MpARF1是生長素敏感轉(zhuǎn)錄因子，生長素能解除Aux/IAA介導(dǎo)的MpARF1轉(zhuǎn)錄活性，MpARF1突變導(dǎo)致地錢發(fā)生明顯的發(fā)育缺陷表型[17]。水稻中的OsARF1基因也受生長素調(diào)節(jié)，與胚芽鞘的向性有關(guān)[18]。RIN13在褐飛虱葉片中的瞬時(shí)表達(dá)可加速葉片衰老和細(xì)胞死亡，并影響ROS清除酶的活性，ARF1與RIN13相互作用，通過改變ARF1亞細(xì)胞定位來加速葉片衰老和細(xì)胞死亡[19]。ARF1對果實(shí)發(fā)育具有調(diào)控作用，如PpARF1在桃硬核期果實(shí)中有重要的調(diào)控作用[20]，VvARF1參與葡萄漿果發(fā)育[21]。在楊樹中，PdPapARF1調(diào)節(jié)促進(jìn)生長和防御反應(yīng)，也是不定根形成的積極刺激因子[22]。茶樹越冬芽深休眠和萌動(dòng)期，CsARF1表達(dá)量較高,表明該基因與越冬芽的休眠及解除休眠密切相關(guān)[23]。

在本研究中，使用多種分析軟件對LsARF1蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。通過分析，發(fā)現(xiàn)LsARF1蛋白具有典型的ARF蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)，并預(yù)測其在細(xì)胞核中的亞細(xì)胞定位，為研究LsARF1蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。通過對LsARF1基因在不同溫度下在易抽薹品種GB-30中基因表達(dá)水平的分析，高溫組與對照組在處理第8天開始出現(xiàn)差異，在處理第16天差異變得顯著，LsARF1基因表達(dá)水平由于高溫的抑制而顯著降低，高溫組葉用萵苣莖部開始出現(xiàn)快速生長。已有的研究可以推測，葉用萵苣發(fā)生抽薹與生長素響應(yīng)因子LsARF1基因的表達(dá)被抑制有關(guān)。相信隨著研究的不斷深入，LsARF1與葉用萵苣抽薹之間的關(guān)系以及更多的抽薹相關(guān)機(jī)制將會(huì)被揭示。