李小鳳，胡渤洋，陳青君，徐詩毅，王秋穎，張國慶*

(1.北京農(nóng)學(xué)院 生物與資源環(huán)境學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206; 2.北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/北京林木分子設(shè)計(jì)育種高精尖創(chuàng)新中心/農(nóng)業(yè) 應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

蛹蟲草[Cordycepsmilitaris(L.) Link]是子囊菌門、核菌綱、肉座菌目、麥角菌科、蟲草屬的模式物種。蛹蟲草是一種食藥兼用真菌，其子實(shí)體富含蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖等，具有抗腫瘤、抗氧化、降血壓等活性，媲美傳統(tǒng)中藥冬蟲夏草(Ophiocordycepssinensis)[1-3]。蛹蟲草人工栽培始自20世紀(jì)80年代，經(jīng)不懈努力，栽培技術(shù)成熟、操作簡單，已在全國廣泛種植[4]。而冬蟲夏草生長條件苛刻，迄今尚未大規(guī)模商業(yè)化栽培。

菌種退化是蛹蟲草人工栽培中常見的問題。隨著繼代培養(yǎng)，菌株活力下降、子實(shí)體產(chǎn)量下降甚至絕產(chǎn)，是制約蛹蟲草栽培的最突出問題之一。較正常菌株，退化菌株在遺傳性狀和分子水平均表現(xiàn)出差異，如菌絲生長速率下降、子實(shí)體異常、交配型基因偏分離、基因突變頻率升高等[5-7]。蛹蟲草菌種退化使優(yōu)良性狀無法保持，給栽培產(chǎn)業(yè)帶來了風(fēng)險(xiǎn)。因此，解決菌種退化問題成為國內(nèi)外蛹蟲草研究的重要問題之一。

交配型基因(Mating-type genes, MAT)是控制真菌有性生殖的關(guān)鍵因子。蛹蟲草是二極性異宗配合型子囊真菌，存在兩類不同源的交配型MAT1-1(MAT-alpha)和MAT1-2(MAT-HMG)，其中MAT1-1包含2個(gè)連鎖的交配型基因MAT1-1-1和MAT1-1-2，而MAT1-2只包含一個(gè)交配型基因MAT1-2-1。單一交配型基因菌株無法形成子實(shí)體或子座上不產(chǎn)生子囊殼[8-10]?；蛉笔Ш突パa(bǔ)突變研究表明，缺失MAT1-1-1時(shí)，導(dǎo)致子座不育(不產(chǎn)生子囊殼與子囊孢子)；缺失MAT1-1-2時(shí)，雖能產(chǎn)生與親本相似的子座，但子囊殼敗育；缺失MAT1-2-1時(shí)，不能夠形成子座[10]。能夠出菇的蛹蟲草菌株通常含有MAT1-1和MAT1-2兩個(gè)交配型，而退化的菌株只含有MAT1-1或MAT1-2單一交配型[11]。而單交配型的子囊孢子菌株或分生孢子菌株，可通過雜交的手段，產(chǎn)生子實(shí)體，被認(rèn)為是蛹蟲草菌種復(fù)壯和選育的重要途徑[12-14]。

本研究以能夠正常出菇的蛹蟲草CM1901菌株新鮮子實(shí)體為材料，采用單孢分離的方法獲得子囊孢子單孢菌株，并進(jìn)行交配型基因鑒定，為進(jìn)一步開展蛹蟲草復(fù)壯和優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)菌株選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

蛹蟲草CM1901菌株，由北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院食藥用菌室分離并保存。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

孟加拉紅培養(yǎng)基，用于單孢分離培養(yǎng)；PDA培養(yǎng)基，用于單孢菌株保存。

菌絲體總DNA提取利用新型植物基因組DNA提取試劑盒(天根，北京)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 單孢分離與培養(yǎng)

單孢分離采用梯度稀釋涂布法。無菌條件下，采集無菌培養(yǎng)的蛹蟲草CM1901菌株新鮮成熟子座，懸掛于無菌三角瓶中過夜，待孢子充分彈射后撤去子座，以無菌去離子水充分洗滌三角瓶瓶壁，收集彈射的子囊孢子。孢子懸液以無菌去離子水梯度稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7等梯度。選取10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀釋液，涂布孟加拉紅平板，25 ℃避光培養(yǎng)2～3 d，平板上即可獲得子囊孢子萌發(fā)后剛剛?cè)庋劭梢姷木洹＿x擇不交叉不重疊的單孢子萌發(fā)菌落，轉(zhuǎn)接至PDA平板上繼續(xù)25 ℃避光培養(yǎng)，待純培養(yǎng)菌落直徑達(dá)到1元硬幣大小，轉(zhuǎn)入新的PDA平板培養(yǎng)用于交配型基因鑒定，或轉(zhuǎn)入PDA斜面培養(yǎng)并保存。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中的蛹蟲草交配型基因MAT1-1-1、MAT1-1-2和MAT1-2-1序列，分別設(shè)計(jì)3個(gè)交配型基因的特異性引物(表1)。

表1 PCR引物列表Tab.1 List of PCR primers

1.5 交配型基因鑒定

1.5.1 DNA提取 菌絲體總DNA提取以剛長滿平板的新鮮菌絲體為材料，使用基因組DNA提取試劑盒(天根)提取。

1.5.2 退火溫度優(yōu)化 以親本菌株菌絲體總DNA為模板，設(shè)定溫度梯度優(yōu)化PCR條件。PCR反應(yīng)體系：基因組DNA 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，2×Taq MasterMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃預(yù)變性30 s，50.0～57.3 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共35個(gè)循壞，72 ℃ 10 min。PCR結(jié)束后，產(chǎn)物利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5.3 PCR擴(kuò)增與測序分析 根據(jù)1.5.2優(yōu)化條件，以無菌水為陰性對照、CM1901親本菌株為陽性對照，測定各單孢菌株交配型基因。分別回收親本菌株和各單孢菌株的PCR產(chǎn)物，由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。目標(biāo)序列利用NCBI在線BLAST比對分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單孢分離與培養(yǎng)

通過梯度稀釋法，挑選出不交叉、不重疊的單孢子接種到備好的PDA培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，最終獲得102株單孢菌株，分別編號為CMSS01-CMSS102。

2.2 退火溫度優(yōu)化

采用梯度PCR確定蛹蟲草CM1901菌株親本交配型基因的最適PCR退火溫度范圍，電泳結(jié)果如圖1所示。MAT1-1-1交配型基因最適退火溫度范圍為54.3～57.0 ℃(圖1-A)，MAT1-1-2交配型基因最適退火溫度范圍為54.0～55.0 ℃(圖1-B)，MAT1-2-1交配型基因最適退火溫度為57.3 ℃(圖1-C)。單孢菌株交配型基因MAT1-1-1、MAT1-1-2和MAT1-2-1克隆時(shí)，退火溫度分別選用55.0、55.0和57.0 ℃。

2.3 親本菌株交配型基因鑒定

回收蛹蟲草CM1901親本交配型基因的清晰目標(biāo)條帶PCR產(chǎn)物，進(jìn)行測序和在線BLAST比對分析。分別獲得交配型基因MAT1-1-1、MAT1-1-2和MAT1-2-1部分序列，長度分別為422、888和785 bp，經(jīng)在線BLAST比對分析，與蛹蟲草MAT1-1-1 (KP721263.1)、MAT1-1-2 (XM_006072440.1)和MAT1-2-1 (AB084257.1)相似性分別為100%、100%和98.61%。表明獲得的目標(biāo)片段為蛹蟲草交配型基因。

2.4 單孢子菌株交配型基因鑒定

分別測定102株單孢分離菌株的3種交配型基因類型，部分菌株電泳圖譜如圖2所示。結(jié)果表明，102個(gè)單孢菌株根據(jù)其交配型基因類型分為3類，即僅含MAT1-1交配型、僅含MAT1-2交配型、同時(shí)含有MAT1-和MAT1-2交配型(即親本型)。僅含MAT1-1交配型菌株57株，僅含MAT1-2交配型菌株24株，另外21株為親本型，MAT1-1∶MAT1-2為78∶45(表2)。另外，這3類單孢菌株表現(xiàn)出不同的菌落特征(圖3)。MAT1-1交配型和親本型菌株菌落存在同心圓結(jié)構(gòu)，并產(chǎn)黃色色素；而MAT1-2交配型菌株菌落純白，無同心圓結(jié)構(gòu)和明顯色素分泌。

表2 蛹蟲草CM1901親本與子囊孢子單孢菌株交配型基因類型

3 討 論

蛹蟲草、羊肚菌等子囊真菌類食用菌普遍存在菌株退化現(xiàn)象，組織分離菌株隨著繼代培養(yǎng)菌株活性和產(chǎn)量下降。為解決蛹蟲草退化問題，前人從雜交育種、交配型基因等角度開展了大量研究。高新華對蛹蟲草進(jìn)行子囊孢子單孢分離，并通過兩兩雜交和子實(shí)體誘導(dǎo)，確定蛹蟲草屬于二極性異宗配合[15]。本研究以能夠正常出草的蛹蟲草CM1901新鮮子實(shí)體為材料，采用孢子彈射和梯度稀釋培養(yǎng)法，獲得102株子囊孢子單孢菌株。分別測定親本和單孢菌株交配型基因MAT1-1(包括MAT1-1-1和MAT1-1-2)和MAT1-2，結(jié)果顯示親本菌株同時(shí)含有MAT1-1和MAT1-2交配型基因(即親本型)，而子囊孢子菌株存在僅含MAT1-1、僅含MAT1-2和親本型3種類型。汪虹等分別鑒定了3株蛹蟲草正常出草菌株和11株不出草的退化菌株是交配型基因，3株正常菌株同時(shí)含有MAT1-1和MAT1-2交配型基因，而退化的11株菌株中，1個(gè)菌株缺失MAT1-1，10個(gè)菌株缺失MAT1-2[11]。但隨著后續(xù)研究深入也發(fā)現(xiàn)，僅含有單一交配型的菌株也能夠形成子實(shí)體。Zheng等報(bào)道，野外采集的18個(gè)蛹蟲草菌株中，只有3個(gè)菌株同時(shí)含有MAT1-1和MAT1-2交配型基因[8]?；蛉笔Ш突パa(bǔ)突變研究表明，當(dāng)缺失MAT1-2-1時(shí)不能形成子實(shí)體，而缺失MAT1-1-1或MAT1-1-2則不產(chǎn)生子囊殼或者子囊殼敗育[10]。

盡管蛹蟲草是二極性異宗配合型子囊真菌，但研究顯示，無論是子囊孢子單孢菌株還是分生孢子單孢菌株，其MAT1-1和MAT1-2基因交配型比例往往達(dá)不到理論值1∶1，且不同菌株存在較大差異。譚琦等對蛹蟲草栽培親本菌株及其100株分離自菌絲的分生孢子交配型基因鑒定，親本菌株同時(shí)含有MAT1-1和MAT1-2；100株單孢菌株中，40株只含有MAT1-1、25株只含有MAT1-2，35株為親本型；MAT1-1∶MAT1-2為75∶60[16]。鮑大鵬從蛹蟲草CM-H07菌株分離60株分生孢子單孢菌株，其中21株只含有MAT1-1、16株只含有MAT1-2，23株為親本型；MAT1-1∶MAT1-2為44∶39[17]。Zheng等以同時(shí)含有MAT1-1和MAT1-2交配型的親本菌株子實(shí)體為材料，分離獲得30株子囊孢子單孢菌株，其中只含有MAT1-1和MAT1-2的菌株分別為28株和2株，親本型菌株為0，MAT1-1∶MAT1-2為28∶2[8]。另外，Zhang和Liang報(bào)道，蛹蟲草野生型和人工栽培菌株子囊孢子單孢菌株中，MAT1-1∶MAT1-2分別為66∶70和71∶60，接近理論值1∶1[12]。本研究結(jié)果中，CM1901菌株為同時(shí)含有MAT1-1和MAT1-2的親本型菌株；102個(gè)子囊孢子單孢菌株中，57株只含有MAT1-1、24株只含有MAT1-2，21株為親本型；MAT1-1∶MAT1-2為78∶45，高于Zhang和Liang報(bào)道的66∶70和71∶60[12]，但低于Zheng等報(bào)道的28∶2[8]。另外，還存在不含有MAT1-2的野生型和人工栽培菌株[8]?；诖?，蛹蟲草不是典型的二極性異宗配合型子囊真菌，在不同菌株中MAT1-1∶MAT1-2比例不同，這可能是由于MAT1-2基因改變或菌株自身差異。推測，隨著蛹蟲草繼代培養(yǎng)，MAT1-2基因逐漸缺失，從MAT1-1∶MAT1-2理論比例1∶1直至不含MAT1-2基因。

本研究中，蛹蟲草單孢分離時(shí)，不僅僅獲得了只含MAT1-1或MAT1-2的交配型基因，同時(shí)還獲得了同時(shí)含有MAT1-1和MAT1-2的親本型菌株。高新華分別從C.m.H-07ZY1和C.m.H-04G13s9菌株子實(shí)體分離獲得9個(gè)和11個(gè)子囊孢子單孢菌株，其中各有1株為親本菌株，作者推測可能是由于將異核菌絲誤認(rèn)為子囊孢子單孢菌株[15]。另一方面，譚琦、鮑大鵬等在分離分生孢子單孢菌株時(shí)，獲得了大量的親本型單孢菌株[16,17]。而周春影等報(bào)道，臺灣線蟲草(Ophiocordycepsformosana)子囊孢子單孢菌株的親本型菌株高于單一交配型，在分離獲得34株子囊孢子單孢菌株中，14株只含有MAT1-1、2株只含有MAT1-2，16株為親本型[18]。因此，在進(jìn)行蛹蟲草子囊孢子或者分生孢子單孢菌株分離時(shí)，親本型單孢菌株普遍存在。類似的現(xiàn)象在雙孢蘑菇擔(dān)孢子中存在，一般擔(dān)子菌每個(gè)擔(dān)子頂端產(chǎn)生4個(gè)單核擔(dān)孢子，而雙孢蘑菇則產(chǎn)生2個(gè)雙核、異核擔(dān)孢子，并以此得名“雙孢”。推測在蛹蟲草子囊孢子形成過程中，有一定比例形成雙核、異核子囊孢子，從而出現(xiàn)親本型單孢菌株現(xiàn)象。這種親本型單孢菌株有待通過顯微觀察等手段進(jìn)一步研究。