何金花，劉丹楓，高麗娟，馬紅敏

石家莊市第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北石家莊 050000

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)是常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病，也是糖尿病常見(jiàn)的并發(fā)癥[1-2]。2型糖尿病患者長(zhǎng)期處于高糖狀態(tài)，可能會(huì)發(fā)生高糖毒性和腦細(xì)胞缺氧狀態(tài)，從而損傷呼吸中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致OSAHS發(fā)生[3]。有研究顯示，敲除微小RNA-34a(miR-34a)基因可激活Notch1/低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)信號(hào)通路，減輕腦缺血再灌注對(duì)大鼠腦組織損傷和神經(jīng)元凋亡的影響[4]。miR-34a可通過(guò)靶向調(diào)節(jié)沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)加重高糖狀態(tài)下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老，從而促進(jìn)糖尿病患者并發(fā)癥發(fā)生[5]。由此推測(cè)miR-34a及SIRT1可能與OSAHS發(fā)生相關(guān)。本研究擬探討miR-34a、SIRT1在2型糖尿病合并OSAHS患者血清中水平，以及二者單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)2型糖尿病合并OSAHS的診斷價(jià)值，旨在為2型糖尿病合并OSAHS的治療提供新靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年4月至2020年3月石家莊市第二醫(yī)院收治的單純2型糖尿病患者70例(單純2型糖尿病組)，2型糖尿病合并OSAHS患者60例(2型糖尿病合并OSAHS組)為研究對(duì)象。單純2型糖尿病組男37例，女33例；年齡45～80歲，平均(61.82±9.31)歲。2型糖尿病合并OSAHS組男31例，女29例；年齡45～80歲，平均(61.98±9.45)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者符合《中國(guó)2型糖尿病防治指南(2017年版)》中關(guān)于2型糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(2)2型糖尿病患者均行Epworth嗜睡量表(ESS)初篩，ESS≥7分者行多導(dǎo)睡眠圖(PSG)監(jiān)測(cè)，OSAHS符合2011年中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的《阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診治指南(2011年修訂版)》診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；(3)臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并慢性阻塞性肺疾病及急慢性感染患者；(2)合并有內(nèi)分泌疾病如甲狀腺功能減退癥、痛風(fēng)等患者；(3)中樞性、混合性O(shè)SAHS患者；(4)酮癥酸中毒、乳酸酸中毒患者；(5)合并嚴(yán)重心腦血管疾病及嚴(yán)重功能障礙患者；(6)合并腫瘤患者。單純2型糖尿病組與2型糖尿病合并OSAHS組在性別、年齡上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。患者及家屬同意簽署知情同意書(shū)，本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2試劑與儀器 RNA提取試劑盒(貨號(hào)：R1200-100，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司)；cDNA第一鏈合成試劑盒(貨號(hào)：60906-10，購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司)；SYBR Green PCR Kit熒光定量PCR試劑盒(貨號(hào)：KL101-969，購(gòu)自上?？道噬锟萍加邢薰?；SIRT1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(貨號(hào)：K4923-100，購(gòu)自艾美捷科技有限公司)；CFX96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(購(gòu)自德國(guó)Bio-Rad公司)；邦德安百多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(cè)系統(tǒng)[注冊(cè)號(hào)：國(guó)食藥監(jiān)械(進(jìn))字2005第2212944號(hào)，購(gòu)自北京杰富瑞科技有限公司]。

1.3方法

1.3.1樣品采集 所有患者入院當(dāng)天清晨空腹時(shí)采集靜脈血4～6 mL裝于采血管中，在4 ℃、3 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，留取上清液，凍存于-80 ℃冰箱中，待測(cè)。

1.3.2血清中miR-34a表達(dá)水平的檢測(cè) RNA試劑盒提取血清中總RNA，以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板。采用qRT-PCR儀對(duì)miR-34a及內(nèi)參U6進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，38個(gè)循環(huán)；72 ℃ 3 min?？偡磻?yīng)體系(10 μL)：cDNA 2 μL、正向引物0.5 μL、反向引物0.5 μL、SYBR Green PCR Kit 2 μL、ddH2O 5 μL。miR-34a正向引物5′-GGC AGT GTC TTA GCT GGT TG-3′，反向引物5′-AAG AGC TTC CGA AGT CCT GG-3′；內(nèi)參U6正向引物5′-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3′，反向引物5′-GGA ACG CTT CAC GAA TTT G-3′。引物由上海生工合成。miR-34a相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.3.3血清中SIRT1水平的檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)血清中SIRT1水平，操作步驟嚴(yán)格依據(jù)SIRT1 ELISA試劑盒進(jìn)行。

1.3.4臨床資料的收集 記錄患者糖尿病病程、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)等資料。采用邦德安百多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(cè)系統(tǒng)對(duì)2型糖尿病患者每晚監(jiān)測(cè)PSG，時(shí)間大于7 h，記錄患者每小時(shí)低通氣次數(shù)或呼吸暫停次數(shù)，獲得睡眠呼吸暫停低通氣指數(shù)(AHI)。

2 結(jié) 果

2.1兩組臨床指標(biāo)的比較 單純2型糖尿病組、2型糖尿病合并OSAHS組的TG、TC、LDL-C、HDL-C、BMI、HbA1c水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與單純2型糖尿病組相比，2型糖尿病合并OSAHS組患者糖尿病病程較長(zhǎng)(P<0.05)，F(xiàn)BG水平及AHI較高(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組患者臨床指標(biāo)的比較

續(xù)表1 兩組患者臨床指標(biāo)的比較

2.2兩組患者血清miR-34a、SIRT1水平比較 與單純2型糖尿病組相比，2型糖尿病合并OSAHS組患者血清miR-34a表達(dá)水平較高(P<0.05)，SIRT1水平較低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組血清miR-34a、SIRT1水平比較

2.32型糖尿病合并OSAHS患者血清miR-34a與SIRT1相關(guān)性分析 miRtarBase網(wǎng)站預(yù)測(cè)，miR-34a與SIRT1存在結(jié)合位點(diǎn)；Pearson相關(guān)分析顯示，血清miR-34a表達(dá)水平與SIRT1水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.823，P<0.05)。

2.4血清miR-34a、SIRT1單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)2型糖尿病合并OSAHS的預(yù)測(cè)價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-34a、SIRT1水平單獨(dú)檢測(cè)診斷2型糖尿病合并OSAHS的曲線下面積(AUC)分別為0.846、0.835，靈敏度分別為65.00%、70.00%，特異度分別為88.60%、88.30%，截?cái)嘀捣謩e為3.06、0.67 ng/mL；二者聯(lián)合檢測(cè)診斷2型糖尿病合并OSAHS的AUC為0.935，靈敏度為87.10%，特異度為85.00%。

3 討 論

2型糖尿病與OSAHS在臨床上相互影響，2型糖尿病患者血糖控制不佳會(huì)加重OSAHS，OSAHS也可以加重胰島素抵抗，促進(jìn)糖尿病發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，與單純2型糖尿病組相比，2型糖尿病合并OSAHS組患者糖尿病病程較長(zhǎng)，F(xiàn)BG水平較高，提示2型糖尿病患者并發(fā)OSAHS可能是由于長(zhǎng)時(shí)間血糖控制不佳導(dǎo)致的。此外糖尿病患者機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下，可發(fā)生支氣管舒縮張力異常，加重OSAHS病情[8-9]。OSAHS患者在睡眠過(guò)程中，機(jī)體可反復(fù)出現(xiàn)低氧與二氧化碳滯留現(xiàn)象，間歇性的缺氧再?gòu)?fù)氧過(guò)程，可作用于中樞交感神經(jīng)調(diào)控部位，使神經(jīng)發(fā)生興奮。miRNA可參與細(xì)胞的分化和調(diào)亡，從而調(diào)控基因表達(dá)的生物功能[10]。因此，探討miRNA在2型糖尿病合并OSAHS發(fā)生過(guò)程中的作用可為臨床早期治療患者提供理論依據(jù)。

miR-34家族具有進(jìn)化保守性，由miR-34a、miR-34b、miR-34c組成，miR-34a位于染色體1q36.22上，是心血管疾病的重要調(diào)控因子，也可參與調(diào)控氧化應(yīng)激和短暫的缺氧、復(fù)氧導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡[11]。另外miR-34a的表達(dá)與高血糖誘導(dǎo)的血管功能障礙也有關(guān)[12]。受高糖刺激后，人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞miR-34a呈高表達(dá)，且miR-34a通過(guò)改變線粒體功能參與氧化應(yīng)激，從而促進(jìn)視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老[13]。miR-34a是與缺氧-復(fù)氧損傷相關(guān)的細(xì)胞死亡和細(xì)胞存活的多功能調(diào)節(jié)因子，并已報(bào)道通過(guò)靶向p53在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞周期阻滯[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病合并OSAHS組患者血清miR-34a表達(dá)水平顯著高于單純2型糖尿病組患者，提示miR-34a可能影響2型糖尿病合并OSAHS的發(fā)生，可能原因?yàn)樵诟咛菭顟B(tài)下，miR-34a影響細(xì)胞功能，進(jìn)而促進(jìn)OSAHS疾病發(fā)生；也可能通過(guò)調(diào)控氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡從而促進(jìn)2型糖尿病合并OSAHS的發(fā)生。

miR-34a是SIRT1的翻譯抑制因子[15-17]。miRtarBase網(wǎng)站預(yù)測(cè)，miR-34a與SIRT1存在結(jié)合位點(diǎn)，Pearson相關(guān)分析顯示，血清miR-34a表達(dá)水平與SIRT1水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.823,P<0.05)，提示miR-34a可能調(diào)控SIRT1參與糖尿病合并OSAHS的發(fā)生。LIN等[18]發(fā)現(xiàn)，miR-34a在2型糖尿病小鼠耳蝸毛細(xì)胞中呈高表達(dá)，并抑制SIRT1表達(dá)，高表達(dá)的miR-34a可促進(jìn)2型糖尿病小鼠耳蝸毛細(xì)胞凋亡。劉金泉等[19]研究證實(shí)miR-34a低表達(dá)可通過(guò)靶向上調(diào)SIRT1抑制帕金森病模型細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷。BADI等[20]研究發(fā)現(xiàn)在人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中，miR-34a過(guò)度表達(dá)，且miR-34a通過(guò)下調(diào)SIRT1表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，通過(guò)血管平滑肌礦化促進(jìn)血管鈣化。血管鈣化可誘導(dǎo)心腦血管疾病發(fā)生[21]。本研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病合并OSAHS組患者血清SIRT1水平顯著低于單純2型糖尿病組患者，提示SIRT1可能參與2型糖尿病合并OSAHS的發(fā)生。ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-34a、SIRT1水平單獨(dú)檢測(cè)診斷2型糖尿病合并OSAHS的AUC分別為0.846、0.835，二者聯(lián)合檢測(cè)診斷2型糖尿病合并OSAHS的AUC為0.935，靈敏度為87.10%，特異度為85.00%，miR-34a與SIRT1聯(lián)合檢測(cè)時(shí)靈敏度均高于二者單獨(dú)檢測(cè)時(shí)靈敏度，提示檢測(cè)患者miR-34a與SIRT1水平對(duì)臨床上診斷2型糖尿病合并OSAHS可能具有一定的參考價(jià)值。

綜上所述，2型糖尿病合并OSAHS患者血清miR-34a表達(dá)水平上調(diào)，SIRT1表達(dá)水平下調(diào)，miR-34a與SIRT1的檢測(cè)對(duì)診斷2型糖尿病合并OSAHS發(fā)生具有一定的臨床參考價(jià)值，二者聯(lián)合檢測(cè)效果可能更好。