代祥軍，吳國(guó)華

重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院:1.腫瘤放療消化病區(qū)；2.腫瘤放療綜合病區(qū)，重慶 404000

結(jié)直腸癌是全球高發(fā)的消化道惡性腫瘤之一，全球每年新發(fā)直腸癌病例超過(guò)120萬(wàn)，超過(guò)50%患者死亡，病死率居惡性腫瘤第3位[1]。結(jié)直腸癌惡性程度較高，易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[2]。探討結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲行為相關(guān)機(jī)制，有助于為臨床治療和預(yù)后提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。基質(zhì)金屬蛋白酶7(MMP-7)是MMPs家族中參與降解細(xì)胞外基質(zhì)的重要酶之一，在惡性腫瘤中通過(guò)促使細(xì)胞突破基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)限制，引發(fā)腫瘤細(xì)胞侵襲性行為的發(fā)生[3]。胸苷酸合成酶(TS)是合成胸苷酸的關(guān)鍵酶，參與腫瘤細(xì)胞DNA合成，與腫瘤浸潤(rùn)、侵襲轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)關(guān)系密切[4]。MMP-7、TS在結(jié)直腸癌中的報(bào)道較多，但與癌細(xì)胞侵襲生長(zhǎng)相關(guān)的報(bào)道并不多見(jiàn)，本研究擬通過(guò)檢測(cè)81例結(jié)直腸癌患者組織中MMP-7、TS及癌細(xì)胞增殖蛋白、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)，探討MMP-7、TS與結(jié)直腸癌侵襲生長(zhǎng)的關(guān)系，以進(jìn)一步明確MMP-7、TS在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)行為特征，為臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年6月至2019年3月重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“本院”)腫瘤科收治的81例經(jīng)手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本(結(jié)直腸癌組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)行結(jié)直腸癌根治手術(shù)，術(shù)后病理學(xué)證實(shí)為結(jié)直腸癌；(2)臨床資料完整；(3)年齡18歲以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)檢查前已經(jīng)接受手術(shù)、放療或化療等形式治療；(2)合并其他部位腫瘤或結(jié)直腸轉(zhuǎn)移瘤；(3)妊娠或哺乳期患者。結(jié)直腸癌組中男49例，女32例；年齡53～69歲，平均(60.32±4.19)歲。另選擇同期于本院門(mén)診行腸鏡檢查的72例結(jié)腸息肉、結(jié)腸炎組織標(biāo)本為對(duì)照組，均于腸鏡下取組織活檢，經(jīng)HE染色排除癌變。其中男41例，女31例；年齡50～67歲，平均(61.78±4.06)歲。兩組年齡、性別構(gòu)成比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲得本院倫理會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬均知情同意簽署同意書(shū)。

1.2方法 取制備好的石蠟組織標(biāo)本，加入二甲苯脫蠟后再用無(wú)水乙醇脫二甲苯，而后切取100 mg組織標(biāo)本勻漿研磨，離心棄上清液。TRIzol(美國(guó)Sigma公司)法提取總RNA，檢測(cè)純度和完整性，取20 μg RNA標(biāo)本，莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶(Epicentre 公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。CFX96實(shí)時(shí)熒光PCR儀(美國(guó)Bio-Rad)檢測(cè)MMP-7、TS以及癌細(xì)胞增殖蛋白[叉頭盒蛋白A1(FOXA1)、程序性細(xì)胞死亡基因4(PDCD4)、Xklp2靶蛋白(TPX2)]、侵襲相關(guān)蛋白[N-鈣黏附素(N-CD)、上皮鈣黏附素(E-CD) 、Twist相關(guān)蛋白1(TWIST1)、Yes相關(guān)蛋白(YAP)]表達(dá)。以U6 為內(nèi)參，相對(duì)定量法計(jì)算MMP-7、TS，癌細(xì)胞增殖蛋白、侵襲相關(guān)蛋白在各組相對(duì)表達(dá)量，ΔΔCt目標(biāo)相對(duì)表達(dá)量=ΔCt目標(biāo)表達(dá)-ΔCtU6。

2 結(jié) 果

2.1結(jié)直腸癌組和對(duì)照組MMP-7、TS水平比較 結(jié)直腸癌組MMP-7、TS水平高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 結(jié)直腸癌組和對(duì)照組MMP-7、TS水平比較

2.2結(jié)直腸癌組和對(duì)照組癌細(xì)胞增殖蛋白、侵襲相關(guān)蛋白水平比較 結(jié)直腸癌組FOXA1、PDCD4、TPX2、N-CD、TWIST1、YAP水平均高于對(duì)照組(P<0.05)，E-CD低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 結(jié)直腸癌組和對(duì)照組癌細(xì)胞增殖蛋白、侵襲相關(guān)蛋白水平的比較

2.3結(jié)直腸癌患者M(jìn)MP-7、TS表達(dá)與癌細(xì)胞增殖蛋白、侵襲相關(guān)蛋白相關(guān)性 相關(guān)分析顯示，結(jié)直腸癌患者M(jìn)MP-7、TS水平與FOXA1、PDCD4、TPX2、N-CD、TWIST1、YAP水平均呈正相關(guān)(P<0.05)，與E-CD水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表3。MMP-7、TS水平之間呈正相關(guān)(r=0.642，P<0.001)。MMP-7與TWIST1、YAP水平的相關(guān)系數(shù)高于TS(Z=11.340、10.937，P<0.001)。

表3 結(jié)直腸癌患者M(jìn)MP-7、TS水平與癌細(xì)胞增殖蛋白、侵襲相關(guān)蛋白的相關(guān)性分析

3 討 論

結(jié)直腸癌早期無(wú)典型癥狀，確診時(shí)多數(shù)患者處于中晚期，失去根治手術(shù)機(jī)會(huì)，預(yù)后差[5]。侵襲性是癌細(xì)胞重要生物學(xué)特性，與腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因、細(xì)胞外基質(zhì)降解、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、微環(huán)境改變、新生血管形成、細(xì)胞黏附等因素有關(guān)[6]，了解與結(jié)直腸癌腫瘤侵襲機(jī)制相關(guān)的分子機(jī)制可遏制腫瘤進(jìn)展，改善患者預(yù)后。

MMP-7是具有基質(zhì)降解活性和底物特異性的MMPs，發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡等作用[7]。TS是在核酸代謝通路中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的限速酶，TS過(guò)度表達(dá)可促使腫瘤細(xì)胞增殖，其水平反映腫瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)[8]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者癌組織中MMP-7、TS水平增高，提示MMP-7、TS與結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。MMP-7具有廣泛的蛋白水解活性，MMP-7過(guò)表達(dá)可促使癌變，加速癌細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[9]。TS可能通過(guò)調(diào)節(jié)p53表達(dá)影響細(xì)胞周期，促使細(xì)胞惡變，加速細(xì)胞生長(zhǎng)增殖[10]。

在癌細(xì)胞侵襲性生長(zhǎng)過(guò)程中，多種增殖蛋白和侵襲相關(guān)蛋白均參與其中。FOXA1通過(guò)調(diào)控G1/S細(xì)胞周期加速細(xì)胞增殖[11-12]。PDCD4可抑制G1期增殖，參與癌細(xì)胞凋亡[13]。TPX2作為一種微管相關(guān)蛋白，其異常表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞中心體異常擴(kuò)增和惡性轉(zhuǎn)化，并促進(jìn)細(xì)胞增殖，影響細(xì)胞周期和凋亡[14]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是癌細(xì)胞增殖后獲取向臨近和遠(yuǎn)處組織轉(zhuǎn)移能力的基礎(chǔ)，E-CD、N-CD作為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化分子標(biāo)志物，在惡性腫瘤中E-CD表達(dá)減少，N-CD表達(dá)增多，導(dǎo)致細(xì)胞間極性降低，癌細(xì)胞向鄰近組織侵襲以及向淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[15]。TWIST1是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化信號(hào)通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其高表達(dá)可促使惡性腫瘤的上皮間轉(zhuǎn)化和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[16]。YAP通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活凝血酶敏感素1/黏著斑激酶信號(hào)促進(jìn)病灶粘連和腫瘤侵襲[17]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組FOXA1、PDCD4、TPX2、N-CD、TWIST1、YAP水平均高于對(duì)照組，E-CD水平低于對(duì)照組，說(shuō)明癌細(xì)胞增殖蛋白、侵襲相關(guān)蛋白改變與結(jié)直腸癌發(fā)生有關(guān)，并驗(yàn)證了結(jié)直腸癌惡性增殖和侵襲的生物學(xué)特性。

相關(guān)分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者M(jìn)MP-7、TS水平與FOXA1、PDCD4、TPX2、N-CD、TWIST1、YAP水平均呈正相關(guān)(P<0.05)，與E-CD水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，說(shuō)明MMP-7、TS與結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲行為有關(guān)。細(xì)胞外基質(zhì)降解與腫瘤侵襲行為關(guān)系密切，癌細(xì)胞通過(guò)穿透宿主細(xì)胞組織，向鄰近或遠(yuǎn)處組織侵襲涉及細(xì)胞外基質(zhì)的破壞，MMP-7作為基質(zhì)降解活性較強(qiáng)的MMPs參與癌細(xì)胞增殖、侵襲過(guò)程[18]。GUO等[18]報(bào)道顯示MMP-7與宮頸癌盆腔淋巴結(jié)及腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。結(jié)直腸癌局部復(fù)發(fā)、腹腔盆腔內(nèi)播散病灶中TS基因表達(dá)增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞DNA合成增加，導(dǎo)致癌細(xì)胞加速生長(zhǎng)、增殖，引起腫瘤侵襲、播散[19]。TS過(guò)度表達(dá)上調(diào)可能導(dǎo)致對(duì)5氟嘧啶耐藥，從而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和盆腔內(nèi)轉(zhuǎn)移[20]。進(jìn)一步分析MMP-7、TS與癌細(xì)胞增殖蛋白、侵襲相關(guān)蛋白關(guān)聯(lián)程度大小，發(fā)現(xiàn)MMP-7與TWIST1、YAP蛋白表達(dá)相關(guān)系數(shù)高于TS，TWIST1、YAP蛋白均與癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示MMP-7可能在直腸癌細(xì)胞侵襲性生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮更關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示MMP-7、TS水平也呈正相關(guān)，提示MMP-7、TS在結(jié)直腸癌侵襲行為中可能發(fā)揮協(xié)同作用。

綜上所述，結(jié)直腸癌患者癌組織中MMP-7、TS表達(dá)升高，高表達(dá)MMP-7、TS可能參與癌細(xì)胞侵襲過(guò)程。MMP-7、TS水平的檢測(cè)可為結(jié)直腸癌病情評(píng)估提供參考。